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¿La expresión de GroEL y GroES en eritrocitos sería una terapia potencialmente eficaz para la anemia de células falciformes?

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¿La expresión de GroEL y GroES en eritrocitos sería una estrategia terapéutica potencialmente eficaz para la anemia de células falciformes? ¿Por qué o por qué no?


  1. GroEL y GroES son complejos de chaperonina multiproteína: no son tan fáciles de expresar ectópicamente
  2. Los eritrocitos no tienen núcleo: no se puede expresar nada de manera estable en los eritrocitos maduros.
  3. Si su objetivo es hacer una expresión génica estable (que requeriría integración genómica), la mejor manera es hacer una terapia génica: cultivo de células madre hematopoyéticas, corregir la mutación mediante recombinación homóloga. Vuelva a colocar las células en la médula ósea.

Hidrofobicidad: un antiguo patrón molecular asociado al daño que inicia respuestas inmunes innatas.

Actualmente se cree que las respuestas inmunitarias se inician por patrones moleculares asociados a patógenos o por señales de peligro / alarma derivadas de los tejidos. Aquí, proponemos que estos dos grupos de moléculas podrían no ser mutuamente excluyentes. Muchos de ellos podrían ser parte de un sistema de alerta evolutivamente antiguo en el que las porciones hidrófobas de las moléculas biológicas actúan, cuando se exponen, como patrones moleculares asociados al daño universal para iniciar la reparación, la remodelación y la inmunidad.


Aplicación de la ingeniería genética en el desarrollo bioterapéutico

Los avances en la ingeniería genética han tenido un impacto profundo en la industria bioterapéutica y han dado forma a muchos de los métodos y estrategias que se utilizan hoy en día tanto para la bioproducción como para el diseño terapéutico. Se han logrado mejoras en el rendimiento y la calidad de la producción mediante la manipulación de la expresión de genes involucrados en la supervivencia celular, el metabolismo, la secreción y la glicosilación, entre otros, y los avances recientes en los ensayos clínicos de terapia génica son muy prometedores para el futuro. Aquí revisamos las herramientas actuales de edición del genoma utilizadas en el campo y examinamos las principales áreas de investigación para la bioproducción de huéspedes microbianos y mamíferos, así como el progreso en terapias basadas en genes y células.

Métodos

Resumimos los métodos de edición de genes utilizados para la bioproducción basada en procariotas y eucariotas y proporcionamos una breve reseña de los enfoques clínicos para la terapia génica.

Resultados

Si bien los primeros avances en ingeniería genética han creado células huésped procariotas ideales para la bioproducción, el advenimiento de las nucleasas programables ha ampliado enormemente la utilidad de los huéspedes eucariotas para la producción de glicoproteínas, lo que permite un control más preciso sobre estas fábricas de células. Estas mismas herramientas también han creado nuevas oportunidades para la creación de terapias basadas en terapia génica con varios ensayos clínicos en curso.

Conclusión

La ingeniería genética ha cambiado el panorama bioterapéutico y ha creado nuevas vías para la bioproducción y el diseño terapéutico.


Abstracto—Cómo responde una célula al estrés es un problema central en la biología cardiovascular. Diversas tensiones fisiológicas (p. Ej., Calor, hemodinámica, proteínas mutantes y daño oxidativo) producen múltiples cambios en una célula que finalmente afectan las estructuras y funciones de las proteínas. Las células de diferentes phyla inician una cascada de eventos que involucran proteínas esenciales, las chaperonas moleculares, en decisiones para reparar o degradar proteínas dañadas como una estrategia de defensa para asegurar la supervivencia. La evidencia acumulada indica que las chaperonas moleculares, como la familia de proteínas de estrés del choque térmico (HSP), participan activamente en una serie de procesos celulares, incluida la citoprotección. La versatilidad de la omnipresente familia HSP se ve reforzada por las redes reguladoras inducibles por estrés, tanto a nivel transcripcional como postranscripcional. En la presente revisión, discutimos la regulación y función de las chaperonas HSP y su importancia clínica en condiciones tales como hipertrofia cardíaca, lesión de la pared vascular, cirugía cardíaca, preacondicionamiento isquémico, envejecimiento y, posiblemente, mutaciones en genes que codifican proteínas contráctiles y canales iónicos. .

Las tensiones fisiológicas que van desde la isquemia miocárdica hasta las mutaciones genéticas producen estados patológicos en los que el daño proteico y las estructuras proteicas mal plegadas son un denominador común. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ¿Cómo responde la célula? Múltiples vías endógenas participan en la restauración de la homeostasis celular, pero un mecanismo bien caracterizado que involucra el plegamiento de proteínas es la familia de proteínas de estrés del choque térmico, o HSP. 10 11 La comprensión de los mecanismos que subyacen a la función de HSP la proporcionan 2 líneas principales de evidencia: (1) el plegamiento correcto de muchas proteínas en una célula requiere maquinaria de plegamiento de proteínas, las chaperonas moleculares, 12 13 y (2) las chaperonas de HSP se desnaturalizan proteínas o promover su degradación después de un choque térmico. 14 15

Los estudios genéticos proporcionan pruebas convincentes en diferentes filos de que la sobreexpresión de proteínas de estrés es un medio poderoso de citoprotección, incluso en el corazón intacto. 10 16 17 18 De manera similar, estudios bioquímicos han demostrado que la chaperona Hsc70 aumenta el plegamiento productivo de la mutación común ΔF508 de CFTR. Esto sugiere un papel fisiológico de un acompañante de HSP en enfermedades humanas. 19 20 Mecanismos divergentes que producen proteínas celulares anormales o mal plegadas convergen en una vía común, lo que lleva a un aumento en los niveles de proteínas citoprotectoras del estrés, que disminuyen o neutralizan los efectos deletéreos del estrés agudo o crónico.

En esta revisión, resumimos los conocimientos actuales sobre la regulación y función de los acompañantes individuales (p. Ej., Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp47, Hsp27 y αB-cristalina) en el sistema cardiovascular. Además de sus roles bien establecidos en la supervivencia celular (necrosis y apoptosis), enfatizaremos la evidencia emergente con respecto a las funciones de chaperón en la adaptación fisiológica durante la hipertrofia cardíaca, el preacondicionamiento isquémico, la lesión de la pared de los vasos, el estrés oxidativo y el envejecimiento. Aunque actualmente solo podemos especular acerca de sus roles en enfermedades cardíacas específicas, discutiremos muchas oportunidades potenciales para establecer si las chaperonas de HSP ejercen un efecto o juegan un papel fisiológico directo en la historia natural de enfermedades resultantes de mutaciones del aparato contráctil cardíaco ( p. ej., miocardiopatía hipertrófica) y canales iónicos (p. ej., síndrome de QT largo) en humanos.

Definiciones y nomenclatura

¿Qué son las proteínas de "choque térmico" del estrés?

El término proteína de "choque térmico" es un nombre inapropiado, pero sigue siendo un legado del descubrimiento fortuito de Ritossa 21 de que el choque térmico produjo protuberancias cromosómicas de células de las glándulas salivales en Drosophila. El estrés por calor (~ 5 ° por encima de la temperatura de crecimiento normal) regula al alza la síntesis rápida de una familia de proteínas multigénicas, originalmente llamadas proteínas de choque térmico, 22 que son el resultado de una respuesta a menudo denominada respuesta de choque térmico. 10 21 El estrés por calor subletal previo aumenta transitoriamente la capacidad de una célula para resistir un desafío de calor posterior que de otro modo sería letal. Este fenómeno, o termotolerancia, jugó un papel clave en el lanzamiento de numerosos estudios en modelos experimentales tanto in vitro como in vivo en los que se encontró una asociación similar entre la respuesta al choque térmico y la protección contra hipoxia o isquemia simulada. De hecho, diversos estreses, incluidos metales pesados, análogos de aminoácidos, inflamación y estrés oxidativo / isquémico, inducen la expresión de genes HSP. En consecuencia, se prefieren los términos "proteínas de estrés" o "familia de proteínas de estrés de choque térmico", aunque muchas de estas proteínas tienen funciones esenciales durante condiciones no estresadas. 13

Las proteínas de estrés pertenecen a familias multigénicas que varían en tamaño molecular de 10 a 150 kDa y se encuentran en todos los compartimentos celulares principales. La convención es nombrar proteínas de estrés de varios tamaños moleculares como sigue: Hsp27, Hsp70 y Hsp90, mientras que los genes de proteínas de choque térmico se designan como sigue: hsp27, hsp70 y hsp90. 23 La distinción entre miembros expresados ​​constitutivamente (p. Ej., Hsc70 y Hsp90β) o miembros afines de la familia HSP y sus isoformas inducibles (Hsp70 y Hsp90α, respectivamente) es arbitraria, ya que la acumulación de evidencia, en sistemas in vivo fisiológicamente relevantes, ahora indica que tales relaciones dependen de la expresión restringida a células y tejidos.

Las consecuencias celulares del calor y el estrés isquémico son similares

Al igual que la isquemia / reperfusión experimental, el choque térmico es un estrés que interrumpe numerosos procesos metabólicos y estructuras celulares y que culmina en la muerte celular cuando se excede un umbral crítico. 10 24 25 Tanto el estrés por calor como la isquemia causan daños extensos al citoesqueleto, incluido el colapso de la red de filamentos intermedios en forma de hilos en grandes agregados perinucleares, la reorganización de la red citoplasmática, la relocalización de las fibras que contienen actina alrededor del núcleo y la rotura de los microtúbulos y la huso mitótico. 26 27 La hinchazón mitocondrial, la pérdida de mitocondrias y el desacoplamiento de la fosforilación oxidativa son características similares del choque térmico y la lesión isquémica temprana reversible. 28 29 30

De manera característica, la síntesis de proteínas en general se inhibe después de la exposición al calor extremo como resultado de la fosforilación de factores de iniciación como eIF2α, que interrumpe el ensamblaje ribosómico e inactiva las proteínas de unión a la cápsula. 31 32 33 En contraste, los genes HSP se expresan de manera eficiente después de la exposición al calor, en parte, como resultado de la ausencia de intrones en varios genes inducibles (p. Ej., Hsp70). Además, las alteraciones del empalme del ARNm y la estabilización del ARNm inducida por calor son mecanismos adaptativos que se utilizan para traducir eficazmente las proteínas de estrés, que pueden alcanzar entre el 15% y el 25% de la proteína intracelular total en cuestión de minutos después del estrés fisiológico en estas condiciones. 10 34 Casualmente, varias chaperonas citosólicas se trasladan al núcleo, 35 donde la inhibición inducida por el calor del ensamblaje de la cromatina del ADN expone una conformación sensible a las nucleasas, una característica patognomónica de la apoptosis inducida por el calor y la isquemia. 36 Se observan cambios menos dramáticos en las proteínas integrales de la membrana, la bicapa lipídica y la morfología de la superficie celular. La cesación de los estímulos nocivos va seguida de una degradación rápida y eficaz de los ARNm de Hsp. 37 38 39

Como se mencionó anteriormente, el estrés por calor subletal previo o "preacondicionamiento hipertérmico" atenúa profundamente todos los cambios celulares inducidos por el calor a un desafío por calor severo posterior. Además, el pretratamiento con calor produce "tolerancia cruzada" a diversos tipos de estrés fisiológico. Por ejemplo, la protección del corazón isquémico intacto después del pretratamiento con calor puede durar de horas a días. 40 41 La comprensión obtenida de los roles fisiológicos de la expresión de Hsp durante la respuesta al choque térmico ha contribuido a los pensamientos actuales sobre las funciones de chaperona en estados patológicos que probablemente resulten en un plegamiento anormal de proteínas.

La atención se ha centrado principalmente en la inducción de chaperonas de HSP y los posibles mecanismos de reparación implicados en la mitigación de la lesión por isquemia / reperfusión. La Figura 1 resume de forma esquemática muchos de estos conceptos e ilustra los múltiples mecanismos bien reconocidos implicados en la lesión miocárdica isquémica, que incluyen daño / estrés oxidativo, sobrecarga de calcio y proteasas activadas, liberación de enzimas proteolíticas y lisosomales, alteraciones del citoesqueleto y activación del complemento.

Diversos estreses fisiológicos inducen la expresión del gen HSP a través de un mecanismo común

La rápida inducción de la expresión de la proteína de estrés se logra mediante mecanismos de activación transcripcional y traducción preferencial. 10 42 HSF (HSF1 a HSF4) regulan la síntesis inducible de HSP durante el desarrollo, crecimiento y adaptación. 42 43 44 Mientras que los genes esenciales de copia única codifican HSF en Saccharomyces cerevisiae y Drosophila, 45 46 Se han identificado múltiples HSF en pollos, plantas, ratones y humanos. 47 48 49 50 51 Se han identificado dos HSF (HSF1 y HSF2, que codifican proteínas de 75 y 72 kDa, respectivamente) en el ratón. 49 Ni HSF1 ni HSF2 son inducibles por calor, pero HSF1 está hiperfosforilado en un ras-dependiente por miembros de las subfamilias MAPK (ERK1, JNK / SAPK y proteína quinasa p38) durante el estrés fisiológico. 52 53 Durante condiciones no estresadas, tanto la actividad de unión al ADN como la actividad transcripcional del HSF1 de vertebrados están bajo un estricto control negativo (revisado en la Referencia 44 44). Sin embargo, sigue siendo controvertido si la represión por la chaperona Hsp70, el secuestro de la fosforilación constitutiva en los residuos de serina o los reguladores inhibidores desconocidos son los principales mecanismos subyacentes a la activación inducible por estrés y la desactivación rápida de HSF1. 43 54 55 56

Estudios previos han demostrado que en respuesta tanto al calor como a la isquemia simulada, el mecanismo (s) para la activación de HSF1 es similar, si no idéntico, en las células miogénicas 57 y que el agotamiento del ATP intracelular juega un papel importante en el desencadenamiento de la unión de HSF1-ADN actividad. 58 En condiciones de enfermedad, se cree que los inductores de la activación de HSF1, como las LDL oxidadas y los intermedios de nitrógeno reactivo, aumentan el daño de las proteínas, lo que desencadena la regulación positiva de la expresión del gen HSP. 59 60 61 Sin embargo, la activación transcripcional de la vía HSF1 no requiere nueva síntesis de proteínas, ya que el transactivador preexistente (HSF1) está inactivo en el estado sin estrés. 43 56 57 Las tensiones fisiológicas, como el calor y la isquemia, inducen a los monómeros de HSF1 a oligomerizar como homotrímeros, que luego se unen a un motivo específico de secuencia aguas arriba, elemento de choque térmico, en el promotor de todos los genes de HSP inducibles por estrés 62 63 (Figura 1I hasta 1K). Recientemente, establecimos un modelo de eliminación genética de Hsf1 y demostramos en estudios in vitro el requisito esencial de esta vía reguladora en la defensa celular y la termotolerancia. 36 Además, la expresión de la proteína de estrés se ha implicado en la promoción de la supervivencia de las células tumorales 64 y la protección del corazón isquémico. 16 17 18

La sobreexpresión de proteínas de estrés mejora la velocidad de recuperación fisiológica del corazón isquémico

Una literatura sustancial describe la inducción de Hsp70 por isquemia, 57 65 66 el papel potencial de Hsp70 en el preacondicionamiento isquémico, 40 67 y una correlación inversa entre la expresión de Hsp70 inducida por el preacondicionamiento isquémico o térmico y el tamaño del infarto en modelos animales. 41 68 69 70 Además, la expresión forzada de Hsp70 transmite un efecto citoprotector en las células cultivadas, incluidos los miocitos cardíacos sometidos a isquemia simulada. 71 72 Específicamente, la sobreexpresión de la principal proteína de choque térmico de 70 kDa (Hsp70) en ratones transgénicos mejora la función miocárdica, 16 17 18 preserva la recuperación funcional metabólica, 18 y reduce el tamaño del infarto 73 después de isquemia / reperfusión. Además de la Hsp70, la Hsp27 y la αB-cristalina pueden proteger a los cardiomiocitos primarios contra el daño isquémico. 74 Aunque los mecanismos precisos no se comprenden suficientemente, se cree que las proteínas de estrés median la cardioprotección a través de sus funciones biológicas como chaperonas moleculares.

Las proteínas del estrés pueden funcionar como acompañantes moleculares

Las chaperonas moleculares, como Hsp70 y αB-cristalina, son proteínas que facilitan el plegado, ensamblaje y desensamblaje de otras proteínas, pero no forman parte del producto terminado. 75 Dado que muchas proteínas requieren chaperonas para plegarse, estas proteínas son componentes esenciales en la etapa final del dogma central de la biología molecular: ADN↔ARN → polipéptido → proteína plegada. 11 75 Las chaperonas in vitro funcionan para prevenir la agregación de otras proteínas en condiciones de estrés y para promover la restauración de la actividad enzimática de sustratos de proteínas desnaturalizados o enzimas (p. Ej., Citrato sintasa, β-galactosidasa o luciferasa) al eliminar el estrés. 11 13 76

La Figura 2 muestra esquemáticamente el ciclo de reacción de la chaperona Hsc70 en relación con cochaperonas y sustratos moleculares recientemente identificados en la célula. Por ejemplo, la chaperona Hsp40 desempeña una función catalítica importante en la carga de sustratos objetivo en el ciclo de unión / liberación de Hsc70. 77 Aunque los mecanismos de estas funciones aún están emergiendo, las principales funciones de las chaperonas moleculares son (1) unir transitoriamente y retrasar el plegamiento de las cadenas polipeptídicas nacientes hasta que se completa la síntesis, (2) mantener las cadenas polipeptídicas en una conformación apropiada adecuada para la translocación. a través de las membranas de orgánulos, (3) previenen la agregación de interacciones intramoleculares o intermoleculares, (4) desmontan activamente las vesículas recubiertas de clatrina, (5) mantienen los complejos de esteroides aporeceptores en estados competentes de ligandos (Hsp90 y cochaperona) y (6) ayudan a degradar los tóxicos metabolitos promoviendo la ubicuinación y la lisis del proteasoma 78 (Figura 1L a 1P).

El caso de las acompañantes moleculares en las enfermedades cardíacas

El interés clínico generalizado en las funciones biológicas de las chaperonas moleculares se extiende a una variedad de patologías humanas, desde afecciones degenerativas como la enfermedad de Alzheimer, priones, amiloidosis, formación de cataratas, enfermedad de células falciformes, fibrosis quística y diversas enfermedades cardíacas, incluida la isquemia miocárdica. Los eventos tempranos que restablecen el reflujo oportuno del miocardio isquémico, ya sea mediante trombolíticos, angioplastia directa o lisis espontánea de coágulos, son esenciales para mejorar la recuperación del miocardio y reducir la morbilidad y la mortalidad. 79 80 No obstante, la isquemia recurrente, ya sea por rotura de una placa inestable o insuficiencia cardíaca congestiva, puede complicar el curso clínico de un infarto agudo de miocardio. En el infarto agudo de miocardio sin complicaciones, la recuperación fisiológica a nivel celular comienza en minutos, pero podría durar de semanas a meses antes de que se complete la reparación del miocardio. Por tanto, los mecanismos de protección endógenos tienen relevancia clínica para mitigar los efectos de la cardiopatía isquémica.

Actividades bioquímicas de la vía reguladora de HSP y acompañantes durante la isquemia miocárdica

En trabajos previos realizados para definir el estímulo próximo a la activación de HSF, observamos que la acidosis intracelular severa (pH 6,7) era insuficiente para inducir la unión de ADN de HSF1 en células miogénicas cultivadas expuestas a isquemia simulada, si se conservaban las reservas de ATP. 58 En contraste, la depleción severa de ATP (65%) estimuló la unión al ADN de HSF1, incluso si el pH se mantuvo dentro del rango normal. 58 En el corazón isquémico intacto, 15 minutos de isquemia, que produce lesión reversible, se asocia con una reducción similar (65%) de las reservas de ATP de alta energía, mientras que la lesión letal se encuentra con isquemia prolongada (& gt40 minutos) y & gt90% de depleción. de piscinas de alta energía. 81 El Kmetro para la débil actividad ATPasa de la Hsc70 bovina es de 1 a 2 µmol / L, 3 órdenes de magnitud por debajo de las concentraciones milimolares de los conjuntos de nucleótidos de adenina intracelulares.75 Por lo tanto, es poco probable que la activación dependiente de ATP de la vía reguladora de HSF1 y las propiedades bioquímicas de las chaperonas moleculares se vean afectadas negativamente durante los períodos de isquemia transitoria o lesión isquémica miocárdica reversible.

La prueba de principio que indica un efecto cardioprotector de Hsp70 en animales transgénicos sometidos a isquemia / reperfusión sugiere que los métodos farmacológicos o genéticos para aumentar la expresión de proteínas de estrés en el miocardio de pacientes con riesgo de eventos isquémicos agudos podrían limitar la lesión isquémica. 82 Sin embargo, se necesitan conocimientos básicos adicionales con respecto a (1) sus relaciones con otras vías endógenas involucradas en la protección miocárdica del daño / estrés oxidativo, (2) la especificidad funcional entre los miembros acompañantes de la familia multigénica HSP, y (3) la contribución de este vía durante la isquemia aguda y otros estados fisiológicos que desencadenan la respuesta al choque térmico, antes de la aplicación clínica.

Proteínas de estrés y vías antioxidantes para la cardioprotección

Desde la década de 1970, médicos e investigadores han seguido la hipótesis de que los captadores de radicales libres pueden mejorar el daño oxidativo durante la isquemia / reperfusión. 83 En sistemas modelo que van desde transgénicos Drosophila para los ratones, la sobreexpresión de catalasa, superóxido dismutasa o glutatión peroxidasa tiende a proteger contra el estrés oxidativo. 84 85 86 El estrés oxidativo, por isquemia / reperfusión, también juega un papel central en la lesión de órganos vitales como el cerebro, riñón y corazón. Se cree que las ROS contribuyen a la disfunción ventricular o "aturdimiento miocárdico", arritmias y daño celular progresivo o muerte después de una lesión isquémica (Figura 1). 87 88 89 90

Se han informado resultados discrepantes de los intentos de administrar antioxidantes durante y después de la isquemia / reperfusión miocárdica. 91 92 Los antioxidantes exógenos, que están restringidos a los espacios intersticiales, pueden tener una capacidad limitada para proteger las proteínas intracelulares contra las ROS. Por ejemplo, el radical libre de hidroxilo (· OH), que se cree que es el principal agente del daño oxidativo, es tan altamente reactivo con un sustrato típico que su vida media a 37 ° C es de 7 x 10 −10 segundos. 93 Por tanto, es difícil imaginar que la administración de antioxidantes exógenos, en concentraciones que sean fisiológicamente factibles, pueda prevenir eficazmente el daño macromolecular inducido por OH. Una estrategia potencialmente más eficaz puede ser minimizar fisiológicamente la producción de · OH. De hecho, la sobreexpresión de miembros de la familia HSP puede proporcionar una de esas vías. Varios estudios han informado que durante la protección contra la isquemia miocárdica, la regulación al alza de los niveles de proteínas de estrés se correlaciona con aumentos en la actividad enzimática de la catalasa, lo que sugiere posibles interacciones aditivas o sinérgicas de estas vías endógenas contra el estrés oxidativo. 40 94 95 Una pregunta importante sin respuesta es si las funciones de las proteínas de estrés, como chaperonas moleculares, complementan las funciones únicas de las enzimas antioxidantes en la protección contra el estrés / daño oxidativo..

Chaperonas moleculares de los compartimentos citosol / nuclear

La tabla muestra las principales clases de HSP, los compartimentos intracelulares, sus funciones putativas y la importancia potencial en biología cardiovascular.

Chaperones Hsp70

Los miembros de la familia Hsp70 son el grupo más estudiado y abundante en células eucariotas. 96 En el citosol, Hsp70 se une a polipéptidos nacientes antes de su liberación del ribosoma. 97 Todos los miembros de la clase chaperona Hsp70 poseen dos dominios distintos: un dominio ATPasa N-terminal altamente conservado y un dominio C-terminal más divergente, que une péptidos hidrófobos cortos de sustratos diana 98 99 (Figura 2A). La función de chaperona de Hsp70 requiere el dominio ATPasa N-terminal, que, curiosamente, es similar estructuralmente a la actina del músculo esquelético de conejo a pesar de la poca similitud de secuencia. 100

Estas relaciones estructura / funcionales de Hsp70 probablemente confieren actividad de chaperona in vivo en la cardioprotección. A este respecto, prácticamente no se sabe nada acerca de la chaperona constitutiva de Hsc70, que comparte una homología de secuencia & gt80% con Hsp70. Posiblemente, una modesta regulación positiva de la Hsc70 constitutiva podría promover un beneficio cardioprotector sustancial. Sin embargo, la regulación positiva de las HSP más allá de un umbral crítico puede tener consecuencias celulares deletéreas. 101 Se informó recientemente que existen funciones distintas entre los miembros de Hsp70 en regiones fuera del dominio de unión del péptido, lo que sugiere niveles adicionales de complejidad para las funciones de chaperona in vivo. 102

Chaperones Hsp90

La Figura 2 muestra que la chaperona Hsp90 es un componente del ciclo de reacción que involucra al complejo chaperona Hsc70 y proteínas recién sintetizadas. Además, los miembros de la familia Hsp90, Hsp90α y Hsp90β, que constituyen del 1% al 2% de las proteínas citoplasmáticas solubles totales, tienen las relaciones funcionales in vivo mejor caracterizadas con las proteínas diana, los receptores de hormonas esteroides. 103 Hsp90 con acompañantes acompañantes, Hsp70 y Hsp56, se une directamente, estabiliza y mantiene el complejo aporeceptor en una conformación inactiva. La unión de ligando (p. Ej., Estrógeno) al complejo de aporeceptor desencadena la hidrólisis de ATP por Hsp90, que se disocia de un receptor "activado" que ahora puede unirse al motivo de reconocimiento específico de secuencia e inducir la transcripción de genes diana. 104 Además, los niveles elevados de expresión de Hsp90 desestabilizan el complejo receptor de estrógeno / elemento sensible al estrógeno y regulan negativamente la expresión del gen diana sensible al estrógeno, lo que indica un bucle de retroalimentación reguladora. 105

Las funciones de chaperona de Hsp90 están mediadas por vías de transducción de señales que involucran varias proteínas quinasas de tipos tirosina y serina-treonina, caseína quinasa II, eIF-2α regulado por hemo y una variedad de otras proteínas celulares, como calmodulina, actina y tubulina. (revisado en la Referencia 106106). Finalmente, los chaperones Hsp90 de Saccharomyces cerevisiae son esenciales para la supervivencia en todas las condiciones, lo que respalda sus importantes funciones fisiológicas en los eucariotas inferiores. 107

Chaperonas citosólicas de especial interés en biología cardíaca y vascular

A diferencia de las omnipresentes homólogas Hsp70 y Hsp90, los miembros específicos de las HSP de PM pequeño (HO-1 o Hsp32, Hsp27, αB-cristalina y chaperonas Hsp20) exhiben una expresión restringida en los tejidos, lo que sugiere posibles propiedades especializadas en el sistema cardiovascular.

HO inducible (Hsp32)

HO es la enzima que limita la velocidad en la degradación del hemo a biliverdina (un potente antioxidante), hierro molecular y monóxido de carbono. Tres genes de copia única relacionados codifican las isoformas HO: HO-1, HO-2 y HO-3. 108109110 HO-1 es una proteína de estrés genuina de 32 kDa (Hsp32) que es inducida por diversos estreses fisiológicos, que incluyen hipoxia, isquemia / reperfusión, hemina, peróxido de hidrógeno y varios metales pesados ​​(selenio, arsenito, cobalto, cadmio e iones estannosos). 108 109 110 Inducible Hsp32 (HO-1), la isoforma más ampliamente expresada, está presente en las células del miocardio. 111

La Hsp32, como la forma inducible de la NO sintasa, media la inhibición plaquetaria dependiente de guanilil ciclasa y la vasodilatación de las CMLV. 112 113 114 Sin embargo, las fuerzas hemodinámicas fisiológicamente relevantes (esfuerzo cortante y tensión cíclica) inducen la expresión de ARNm de HO-1 pero no la expresión de NO sintasa inducible, lo que sugiere la especificidad de esta vía de respuesta al estrés a las señales fisiológicas. 115 Tanto el NO liberado endógenamente como el administrado exógeno inducen un aumento de 3 a 6 veces en la expresión del gen Hsp32 (HO-1) y la producción de CO en las CMLV 116 de manera similar, el inhibidor protoporfirina-IX de estaño previene la agregación plaquetaria mediante la inducción del gen HO-1 expresión y producción de CO en las CMLV aórticas. 115 En las CMLV de rata, el tratamiento con angiotensina II disminuye la expresión del ARNm de Hsp32 (HO-1) de una manera dependiente del calcio. 117 Sin embargo, la hipertensión inducida por angiotensina II aumenta la expresión del ARNm de Hsp32 (HO-1) en la aorta de rata, lo que sugiere la influencia predominante de los factores hemodinámicos in vivo. 118

Varias vías reguladoras están implicadas en la inducción de la expresión del gen Hsp32, más notablemente HSF1 y las vías del factor de transcripción 1 inducible por hipoxia. 119 120 121 122 Aunque se carece de evidencia directa de una función chaperona de Hsp32, su sobreexpresión en varios tipos de células protege contra el estrés / daño oxidativo. 123124125 En consecuencia, los estudios para definir las vías reguladoras precisas estimuladas por los metales pesados, la hipoxia y el estrés oxidativo podrían proporcionar una nueva visión de las funciones biológicas de Hsp32 (HO-1) en la modulación del estrés / daño oxidativo durante la isquemia / reperfusión, el tono vascular (p. ej., hipertensión) e inhibición de la agregación plaquetaria y / o proliferación de CMLV después de una angioplastia con balón.

Hsp25 / 27 Chaperón

Después de su descubrimiento como inhibidor de la polimerización de actina, se ha demostrado que la chaperona 126 Hsp 25/27 (Hsp25 en ratones y Hsp27 en humanos) desempeña un papel importante en la dinámica de los filamentos de actina en diversos tipos de células. Los estímulos fisiológicos (estrés oxidativo, citocinas y factores de crecimiento) aumentan drásticamente la fosforilación de Hsp27 humana en los residuos Ser15, Ser78 y Ser83, que es esencial para la tolerancia adquirida. 127128129 La fosforilación de Hsp25 / 27 es catalizada por las MAPK (p38-MAPK, JNK o SAPK) y ERK. 130 En el corazón adulto perfundido, tanto p38-MAPK como JNK / SAPK se activan después de isquemia / reperfusión. 131 En respuesta al tratamiento con ROS, la activación de p38-MAPK aumenta la actividad de la cinasa 2 de MAPKAP, que fosforila Hsp27. 132

En las células endoteliales humanas, la inhibición de la activación de p38-MAPK inducida por el factor de crecimiento endotelial vascular anula la fosforilación de Hsp27, la polimerización de actina y la migración celular, lo que sugiere un posible vínculo entre Hsp27 y la angiogénesis. 133 En conjunto, la evidencia disponible coloca a p38-MAPK como un activador corriente arriba de la fosforilación de Hsp25 / 27 inducible por estrés, y esta vía subyace al efecto de p38-MAPK en la reorganización de la actina filamentosa, la acumulación de fibras de estrés y el reclutamiento de vinculina en sitios focales de adhesión. 134 A continuación, será importante determinar si Hsp25 / 27 ejerce acciones vasoprotectoras en respuesta a fuerzas hemodinámicas o lesión de la pared del vaso. Sin embargo, el análisis directo probablemente requerirá un modelo de desactivación del gen Hsp27.

Acompañante de αB-cristalina (Hsp22)

Mientras que Hsp27 se detecta en células endoteliales, CMLV y cardiomiocitos, la chaperona αB-cristalina se expresa solo en cardiomiocitos. 135 Tanto Hsp27 como αB-cristalina son HSP genuinas estructuralmente relacionadas con actividad de chaperona in vitro pero, a diferencia de Hsp70, no son proteínas de unión a ATP. 136137138139 El mayor interés en la regulación y función de la proteína αB-cristalina (Hsp22), una proteína estructural principal del cristalino ocular, se relaciona con su expresión restringida en tejidos en linajes miogénicos estriados con alta capacidad oxidativa, como el corazón y fibras musculares esqueléticas de tipo I. 140 En tejidos no lenticulares, la expresión posnatal de αB-cristalina aumenta y alcanza sus niveles más altos en el corazón adulto (~ 1% a 3% de la proteína soluble total), seguida por el músculo esquelético y el riñón. 140 Estudios inmunohistoquímicos previos han localizado la expresión más alta de αB-cristalina en las fibras de conducción cardíaca del corazón adulto. 141 Actualmente se desconoce si una alteración de la expresión de αB-cristalina podría conducir a anomalías del sistema de conducción, pero plantea una posibilidad intrigante.

Aunque la expresión de αB-cristalina se ha localizado en las bandas Z del citoesqueleto, en un patrón similar al de la desmina y la actina, 142 estudios recientes sugieren que esta interacción es mucho más transitoria y dinámica con respecto a los objetivos intracelulares, dependiendo de las condiciones fisiológicas. En miocitos cardíacos no estimulados, los estudios bioquímicos indican que la αB-cristalina es muy soluble y permanece en la fracción citosólica, el calor o la isquemia desencadena una rápida translocación de αB-cristalina en las fracciones citoesqueléticas / nucleares insolubles, agregación e interacciones específicas en las bandas Z (Referencia 142). 142 e IJ Benjamin, datos no publicados, 1998). La importancia fisiológica de la tendencia tanto de la αB-cristalina como de la Hsp25 / 27 a formar grandes complejos heterooligoméricos (500 a 800 kDa) tanto in vivo como in vitro después de tensiones fisiológicas sigue siendo un misterio. 143 144 Aunque la chaperona de αB-cristalina proporciona citoprotección a los cardiomiocitos, 74 los mecanismos reguladores de las modificaciones posteriores a la traducción, como la fosforilación, glicación y desacetilación de la función de αB-cristalina, esperan un análisis directo en el sistema cardiovascular.

Proteínas de estrés y desarrollo y diferenciación de músculos estriados

Se ha descrito un aumento de la expresión de chaperona de HSP de pequeño MW durante períodos asociados con una mayor síntesis de proteínas, degradación de proteínas y reorganización celular, como diferenciación miogénica y embriogénesis. 145 La expresión restringida en tejido de αB-cristalina durante la miogénesis del músculo esquelético puede requerir la familia MyoD de factores de transcripción básicos hélice-bucle-hélice, que se unen al potenciador esencial de la caja E contenido en el promotor de αB-cristalina. 146 147 Recientemente informamos que la expresión de αB-cristalina, pero no de Hsp27, está directamente relacionada con aumentos en el metabolismo oxidativo en el músculo esquelético después de la estimulación nerviosa crónica. 148 Sin embargo, el papel fisiológico de la regulación positiva de la expresión de Hsp27, que precede a la diferenciación temprana de las células madre embrionarias murinas, aún no se ha establecido en los linajes miogénicos. 149

Se sabe mucho menos acerca de los mecanismos reguladores implicados en la expresión restringida de αB-cristalina en miocitos cardíacos. La αB-cristalina se expresa abundantemente en el desarrollo cardíaco temprano a partir del día embrionario 8.5, lo que sugiere un papel como proteína estructural o como acompañante molecular en la estabilización de miofibras. 150 Dado que los factores similares a Myo-d están ausentes en el corazón, los estudios de unión in vitro de extractos nucleares cardíacos han implicado las actividades transcripcionales de un factor estimulante corriente arriba en el elemento de la caja E y el factor de respuesta sérica en una caja CArG inversa en el Promotor de αB-cristalina. 151 Hasta ahora, una encuesta de desarrollo in vivo revela que la expresión de αB-cristalina no se ve afectada en el músculo esquelético de myf5 ratones nulos o el corazón de ratones nulos d-HAND en el día embrionario 9.0 (I.J. Benjamin, datos no publicados, 1998). 152 153

Otros acompañantes citosólicos / nucleares

Varias otras HSP que existen en el compartimento citosólico / nuclear son de interés potencial en biología cardiovascular. Por ejemplo, la proteína citosólica de 20 kDa, p20, se expresa abundantemente en el corazón, el músculo esquelético y el músculo liso y se copurifica con las chaperonas αB-cristalina y Hsp27. 154 155 Aunque la expresión de p20 no es inducida ni por calor ni por estrés químico, contiene el "dominio de cristalina α" homólogo C-terminal compartido por todos los miembros de las HSP de PM pequeño. 138 En las CMLV, p20 es un sustrato para las proteínas quinasas cAMP y cGMP, lo que sugiere un papel regulador de las funciones postuladas en el mantenimiento fisiológico del tono vascular y la adaptación a la lesión de la pared de los vasos. 156

Un cuarto miembro de las HSP pequeñas (además de Hsp27, αB-cristalina y p20), una proteína de unión a proteína quinasa de distrofia miotónica se asocia e incrementa la actividad de la proteína quinasa de distrofia y previene su desnaturalización in vitro inducida por el calor. 157 La proteína quinasa de la distrofia miotónica, a diferencia de Hsp27 o αB-cristalina, está regulada al alza en el músculo esquelético de pacientes con distrofia miotónica, lo que sugiere que esta nueva proteína puede estar involucrada en la patogenia de esta enfermedad. 157

Los miembros de la familia Hsp110 exhiben funciones de chaperona y citoprotectoras, aunque los detalles sobre su expresión relativa en las células del miocardio y la distribución regional en el sistema cardiovascular esperan una caracterización adicional. 158 Los miembros adicionales de la familia Hsp110 incluyen Hsp105, Apg-1 y Osp94. 159 160 161 Existe un gran interés en identificar un homólogo mamífero de la levadura Hsp104 que, en lugar de prevenir la agregación de proteínas, parece resolubilizar agregados de proteínas insolubles. 162

Sistema de chaperona mitocondrial Hsp70

Todos los organismos poseen mecanismos dependientes de ATP para el plegamiento y ensamblaje de proteínas dentro de los orgánulos. 11 13 La translocación de proteínas a través de la membrana mitocondrial requiere la chaperona mitocondrial Hsp70 en la matriz, donde se completa el plegamiento al estado nativo 13 (ver Figura 1).

Sistema de chaperonina mitocondrial

Además de las chaperonas similares a Hsp70, las chaperoninas mitocondriales Hsp60 y Hsp10 constituyen un sistema separado que proporciona un entorno secuestrado para plegar un subconjunto de proteínas in vivo. 163 Estos anillos de 7 miembros están dispuestos como estructuras cilíndricas en las que se produce un plegamiento de proteínas dependiente de ATP en su cavidad central. 164 La evidencia de estudios in vitro sugiere que las chaperonas y los sistemas de chaperonina de Hsp70 funcionan de manera cooperativa en el plegamiento y ensamblaje de proteínas en eucariotas (revisado en la Referencia 13 13).

Sistema de chaperonina citosólica

La chaperonina TRiC se considera el equivalente funcional de la chaperonina Hsp60 / Hsp10 en el citosol eucariota. El complejo TRiC, que consta de anillos dobles de 8 o 9 miembros de subunidades de ≈55 a 65 kDa, es necesario para el plegamiento de actina y tubulina in vivo. 165 Chaperonin TRiC requiere componentes adicionales, como Hsp40, que estimula la ATPasa Hsc70, para el plegamiento de proteínas en el citosol 77 166 (ver Figura 2). La evidencia disponible sugiere que la chaperonina TRiC funciona en las etapas finales de plegamiento durante la traducción de un número limitado de dominios polipeptídicos. 13

Trascendencia

Las chaperonas y chaperoninas mitocondriales solo son inducidas modestamente por el estrés fisiológico en los cardiomiocitos y el corazón. 167 Sin embargo, la ubicación de las chaperonas y chaperoninas de Hsp70 mitocondriales en los principales sitios de producción de ROS podría servir para complementar los mecanismos de defensa tanto enzimáticos como no enzimáticos para disminuir la lesión oxidativa y aumentar la tasa de recuperación fisiológica después de la lesión isquémica. 168 169 Actualmente se desconoce si la sobreexpresión de chaperona o chaperonina de Hsp75 mitocondrial puede proporcionar una protección equivalente o superior contra la lesión isquémica. Otra cuestión importante se refiere a si las funciones superpuestas de las chaperonas Hsp70 y los sistemas de chaperonina Hsp60 o TRiC / Hsp40 están coordinadas para el plegamiento de proteínas de novo y la citoprotección potencial durante la patogénesis de la enfermedad cardíaca.

Chaperonas moleculares en urgencias

Proteínas reguladas por glucosa

El análisis de las chaperonas del RE puede ser de particular interés clínico, porque el RE funciona para degradar o reparar las proteínas dañadas después de la isquemia miocárdica o después de que las proteínas mutantes (p. Ej., CFTR o tiroglobulina) no se plieguen correctamente. 11 170 171 La anoxia, la inanición de glucosa y los ionóforos de calcio inducen miembros de la clase de proteínas de estrés reguladas por glucosa que se unen al Ca 2+, Grp170, Grp94 y Grp78 / BiP. 11 172 Se han informado cambios variables en la expresión de la proteína Grp78 después de la isquemia.173174 Aunque la "culpa por asociación" con las chaperonas citosólicas es el presunto papel de la función de la chaperona Grp en la vigilancia y el control de la calidad de las proteínas, se necesitan más estudios de su expresión en los estados fisiopatológicos asociados con la expresión, la glicosilación postraduccional y la secreción de proteínas anormales a través de la vía ER-Golgi.

Chaperones Hsp47

La glicoproteína Hsp47 de unión a colágeno de 47 kDa es un miembro de la superfamilia de la serpina (inhibidor de la serina proteasa) y está altamente inducida por estrés por calor o estados patofisiológicos (p. Ej., Fibrosis hepática) asociados con una mayor síntesis de colágeno. 175 Hsp47 reside en el ER y contiene la señal de retención del ER Arg-Asp-Glu-Leu C-terminal. 176 Hsp47 se une transitoriamente a los tipos de colágeno I a IV y ávidamente a los sustratos de colágeno desnaturalizados, por lo que su papel en el procesamiento y transporte de procolágeno parece firmemente establecido. 177 Los estudios futuros deben abordar ahora la probable relevancia biológica y clínica de la expresión de Hsp47 en el inicio y la progresión de estados fisiopatológicos, como infarto de miocardio, miocardiopatías idiopáticas e hipertróficas e hipertensión, en las que la fibrosis miocárdica se destaca de forma destacada. 178

Desafíos actuales y direcciones futuras

La recuperación fisiológica del corazón isquémico comienza en minutos, pero la tasa de reparación isquémica celular, que puede durar de días a semanas, es fundamental para la reducción de la morbilidad y la mortalidad cardiovasculares subsiguientes. La idea de que las proteínas de estrés pueden acelerar la recuperación fisiológica de la lesión miocárdica reversible se basa en evidencia experimental que indica que múltiples “señales” próximas pueden activar la respuesta al choque térmico y, por lo tanto, evocar los mecanismos protectores endógenos de las Hsps. Los eventos clínicos importantes como la angina inestable, la oclusión recurrente después de la terapia trombolítica y la exacerbación aguda de la angina crónica son inductores fisiológicos potenciales de las proteínas citoprotectoras del estrés. El siguiente paso lógico sería considerar la posibilidad de que miembros relacionados de la familia de proteínas de estrés multigénicas confieran beneficios funcionales similares o adicionales. Debido a que la isquemia y otras perturbaciones fisiológicas alteran las relaciones estructura-función normales de las proteínas intracelulares, los estudios futuros deben establecer si las chaperonas moleculares, solas o en combinación, alivian el daño isquémico acelerando la recuperación fisiológica de la célula miocárdica en el organismo intacto.

Modelos experimentales para la investigación de proteínas de estrés

Modelos transgénicos de sobreexpresión de Hsp70 (ganancia de función) y hsf1-los ratones deficientes (pérdida de función) y su posterior caracterización están comenzando a esclarecer sus roles fisiológicos in vivo. 16 17 18 36 Una dirección interesante de tales esfuerzos podría conducir a enfoques integrados en las funciones fisiológicas de sistemas completos o redes reguladoras en modelos animales genéticamente modificados de enfermedades humanas. Sin embargo, no debe pasarse por alto la gran cantidad de conocimientos existentes sobre estudios fisiológicos en animales más grandes que el ratón. Los estudios para definir el papel de la expresión de HSP en el aturdimiento del miocardio utilizando animales conscientes podrían justificar el desarrollo de modelos transgénicos de ratas y conejos. Las limitaciones potenciales de tales estrategias incluyen costos sustancialmente mayores debido a períodos de gestación más largos, mayor tiempo para alcanzar la madurez sexual y tamaños de camada más pequeños de especies tan grandes. Sin embargo, los investigadores con experiencia en biología molecular y fisiología molecular que emprenden proyectos colaborativos aumentan las posibilidades de éxito, al tiempo que evitan la duplicación de esfuerzos.

¿La expresión de genes HSP inducida por estrés afecta el tamaño del infarto, la arritmogénesis y el remodelado miocárdico después de un infarto agudo de miocardio?

Estudios previos han demostrado que el pretratamiento (24 horas) con estrés por calor atenúa la liberación de radicales libres en el corazón aislado de rata 95 y reduce la cantidad de arritmias, un sello funcional importante de la lesión por isquemia / reperfusión (revisado en la Referencia 92 92). Juntos, estos estudios correlacionan las posibles interacciones entre estas vías protectoras, pero son inadecuados para establecer una relación de causa y efecto. El desarrollo de un modelo de ratón knockout del gen HSF1 proporciona un poderoso enfoque experimental para determinar si una deficiencia en la síntesis de HSP inducible por estrés, durante perturbaciones fisiológicas como la isquemia miocárdica, afecta el resultado de la lesión postinfarto y los mecanismos de reparación en el organismo intacto. Los resultados de tales estudios pueden ayudar a establecer la causalidad, dilucidar los posibles mecanismos por los cuales la síntesis de HSP se relaciona con la isquemia miocárdica y evaluar la participación de las proteínas de estrés durante el preacondicionamiento isquémico temprano y tardío. La caracterización oportuna de varios modelos knockout, actualmente en desarrollo en laboratorios de todo el mundo, debería seguir fomentando colaboraciones fructíferas entre los investigadores. 179 Un mayor progreso debería acelerar el flujo de nuevos conocimientos hacia áreas relacionadas como la fibrosis posisquémica reactiva y reparadora, 180 la inflamación posperfusión181 y el aturdimiento miocárdico. 89 182

Expresión de proteínas de estrés y mecanismos de preacondicionamiento isquémico

El preacondicionamiento isquémico es la maniobra experimental más poderosa que protege de forma reproducible el corazón frente a la provocación isquémica posterior. 183 Sin embargo, existe controversia sobre las funciones precisas de las proteínas de estrés en este fenómeno bien caracterizado. 184 Varios mecanismos que involucran a la proteína quinasa C, los receptores de adenosina y sus relaciones con las vías de transducción de señales han sido implicados en el preacondicionamiento isquémico. 185 Evidencia suficiente indica una falta de correlación entre la expresión inducible por estrés (p. Ej., Hsp70) y el preacondicionamiento temprano, que es de corta duración y dura entre 1 y 3 horas, según el modelo y la especie. 186

¿Es improbable que la familia de proteínas de estrés Chaperone tenga relevancia fisiológica en el preacondicionamiento temprano?

En nuestra opinión, los estudios en esta área han descartado prematuramente o prestado una atención inadecuada a la importancia potencial de las Hsps de PM pequeño, como la αB-cristalina y la Hsp27. Es probable que estos acompañantes sean candidatos para la "primera línea de defensa" contra el estrés no letal. Actualmente se desconoce si la oligomerización de Hsps de pequeño peso molecular contribuye a la estabilidad mecánica o al papel especulado del citoesqueleto en la protección isquémica del miocito cardíaco. 187 188 Tanto los modelos de knockout del gen αB-cristalina como Hsp27, actualmente en desarrollo, podrían abordar directamente esta hipótesis.

De manera similar, se necesitan estudios para abordar la correlación entre el preacondicionamiento tardío y la expresión de proteínas de estrés. Veinticuatro horas después de un estrés isquémico inicial, varios estudios han informado aumentos en la síntesis de Hsp60 y Hsp70 en conejos, 41 Hsp70 en cerdos, 182 y manganeso-SOD en perros 189 190 y tolerancia isquémica retardada o preacondicionamiento tardío. Por tanto, una cuestión fundamental es si existe una relación directa entre la expresión de la proteína de estrés y el preacondicionamiento tardío. 191 192 193 También se requiere una evaluación más detallada del papel específico de la Hsp individual en la cardioprotección. Los intentos de determinar el mecanismo del canal de potasio sensible a ATP cardioprotector mediante el uso de inhibidores han encontrado una falta de correlación con la expresión de la proteína de estrés Hsp70. 194 Sin embargo, los enfoques que utilizan inhibidores específicos son inadecuados para establecer la especificidad, con algún grado de certeza, más allá de las proteínas bajo investigación. 195

Chaperonas moleculares y vías de muerte celular

Las proteínas de estrés son candidatas ideales para desempeñar funciones reguladoras clave en la supervivencia celular y las vías de muerte que implican el daño del ADN y la síntesis, reparación y degradación de proteínas. Las maniobras que aumentan la expresión de Hsp70 después del choque térmico, la exposición al butirato de sodio y la sobreexpresión constitutiva o regulada inhiben la apoptosis en una variedad de tipos de células. 196197198 El protooncogén c-mi c potencia la apoptosis inducida por choque térmico 199 200 en contraste, la sobreexpresión de Bcl-2 aumenta la supervivencia celular inducida por termotolerancia. 201 La expresión específica de tejido de Hsp70-2 previene la apoptosis en ciertas células mitóticas a través de un mecanismo que involucra el control del ciclo celular. 202 La función de chaperona de Hsp70 en la regulación de la apoptosis puede estar al nivel de la transducción de señales, ya que se ha implicado en la vía de la quinasa activada por estrés. 203

Estudios recientes en nuestro laboratorio utilizando hsf1Las células cultivadas deficientes han establecido el papel de las Hsps inducibles por estrés para hacer que las células sean termotolerantes a la apoptosis inducida por calor. 36 El presente estudio proporciona un modelo genético para examinar las posibles relaciones interdependientes entre el estrés inducible por Hsps y los mecanismos implicados en la supervivencia celular y / o las vías de muerte celular. El estrés por calor subletal protege las mitocondrias contra el estrés oxidativo y previene la muerte celular por apoptosis. 204 Dadas sus ubicaciones estratégicas en todos los orgánulos principales, es tentador especular que múltiples Hsps pueden combatir el estrés / daño oxidativo replegando represores dañados de la vía de muerte celular o previniendo su degradación. Alternativamente, reprimir la liberación de activadores suicidas como el citocromo C podría ocurrir a través de interacciones con chaperonas y chaperoninas mitocondriales (Figura 1).

Además, los resultados de varios estudios recientes han implicado al pequeño MW Hsp25 / 27 en las vías de supervivencia celular que implican la diferenciación celular y el estrés / daño oxidativo. Estudios previos han demostrado que la sobreexpresión de Hsp25 / 27, como la proteína antiapoptótica Bcl-2, aumenta los niveles del glutatión antioxidante y la resistencia a la apoptosis mediada por Fas / APO-1, aunque no está claro si esto ocurre directamente. 205 La retirada de las células madre embrionarias de ratón del ciclo celular induce una regulación positiva del ARNm de Hsp25 / 27, que se acompaña de una disminución de la fosforilación y un aumento de la oligomerización de la proteína Hsp25 / 27. 149 La reducción antisentido de Hsp25 / 27 revierte estos cambios mediante la prolongación del ciclo celular, la reducción de los niveles de glutatión y la aceleración hacia la apoptosis. Juntos, estos hallazgos provocativos sugieren que durante la proliferación y diferenciación de las células miocárdicas, la chaperona Hsp25 / 27, y otras, pueden reducir el estrés / daño oxidativo y prevenir la apoptosis a través de un nuevo mecanismo redox dependiente. 206

¿La expresión de genes HSP inducida por el estrés afecta la historia natural de las enfermedades cardiovasculares crónicas, incluido el envejecimiento?

Numerosos estudios han correlacionado la inducción de la expresión de Hsp y la sobrecarga de presión por banda aórtica, hipertensión aguda, exposición a agentes vasoactivos o hipertrofia ventricular izquierda y expresión del factor de crecimiento en varios tipos de células. 207 208 209 Se informa que se producen disminuciones en la expresión de genes HSP y la actividad de unión al ADN de HSF1 durante el proceso de envejecimiento en el miocardio de roedores. 210 Existe una creciente evidencia que sugiere que el estrés / daño oxidativo puede ser un factor causal importante en el proceso de envejecimiento. 211 El nivel de estrés oxidativo y la susceptibilidad de los tejidos al estrés oxidativo inducido experimentalmente parecen aumentar durante el proceso de envejecimiento. Actualmente se desconoce si las cantidades aumentadas de daño oxidativo molecular, observadas durante el proceso de envejecimiento, están causalmente asociadas con una actividad disminuida de HSF1 y, por implicación, la expresión del gen Hsp. La disponibilidad de modelos transgénicos y de eliminación de genes permitirá que los estudios futuros establezcan el papel de la expresión génica de choque térmico inducible por estrés durante el envejecimiento normal o la adaptación fisiológica a los factores de riesgo cardíaco asociados a la enfermedad.

Chaperonas moleculares en estados de enfermedad cardíaca causadas por la expresión de proteínas mutantes

Los niveles elevados de proteínas mal plegadas o desnaturalizadas, así como la microinyección de proteínas anormales, son potentes inductores de la expresión del gen HSP. 14 59 Estudios recientes que indican que la chaperona Hsc70 interactúa indirectamente con el CFTR que alberga la mutación de plegamiento común ΔF508 apoyan esta noción general de su papel biológico en las enfermedades humanas. 20

Desde la perspectiva de la biología de la chaperona, las enfermedades cardíacas que surgen de mutaciones en genes que codifican componentes del aparato contráctil o proteínas de los canales iónicos son esencialmente problemas de proteínas anormales. Se han implicado múltiples mutaciones de proteínas sarcoméricas en la patogenia de la miocardiopatía hipertrófica familiar, incluidas las cadenas ligeras y pesadas de miosina, las subunidades de troponina I y T, la proteína C que se une a la miosina y la tropomiosina (Referencia 6 6 y revisada en la Referencia 7 7). Mientras que la chaperona Hsp27 juega un papel en la polimerización de actina y la chaperonina TRiC está involucrada en el plegamiento de actina y tubulina, el papel fisiológico de los sistemas de chaperona y chaperonina en el plegamiento y ensamblaje de estructuras sarcoméricas, en condiciones normales o en enfermedad, sigue siendo un misterio. Posiblemente, las chaperonas pueden influir en la reparación o degradación de proteínas sarcoméricas mutantes, que, en última instancia, afectan las relaciones estructura-función y el fenotipo de la enfermedad. 212 Primero se necesitan análisis in vitro para determinar si la función de la chaperona puede afectar el plegamiento de proteínas productivas causado por las mutaciones relevantes, que pueden validarse en modelos animales apropiados. 18 213

Chaperonas moleculares en biología vascular

Existen numerosas oportunidades para diseccionar las funciones de chaperona durante la síntesis y secreción de péptidos y proteínas biológicos activos, la proliferación celular, la señalización intracelular y el reordenamiento citoesquelético. Los resultados de tales estudios pueden identificar los objetivos específicos de la proteína HSP y la especificidad entre los diversos tipos de células en la promoción de los efectos protectores vasculares del estrógeno. 214 215 Las funciones esenciales de Hsp90 y cochaperonas en la biología del receptor de esteroides sugieren que las chaperonas de HSP desempeñan un papel clínicamente significativo en los efectos de la terapia de reemplazo hormonal en mujeres posmenopáusicas. 216 217 Los estudios epidemiológicos han encontrado que el beneficio protector contra la enfermedad coronaria en mujeres premenopáusicas se elimina en los años posmenopáusicos. 218 219 220 Las posibles acciones protectoras de los estrógenos se han atribuido a sus propiedades antioxidantes y vasoprotectoras, disminución de lípidos y lipoproteínas en sangre y efectos directos sobre la pared de los vasos. 221 Será importante definir si la expresión de Hsp inducible por estrés en ratones modificados genéticamente juega un papel en la respuesta vascular a la lesión en animales machos y hembras. 215

Chaperona molecular y enfermedades inmunológicas

En contraste con sus funciones citoprotectoras bien establecidas, ciertas proteínas de estrés se han implicado en la patogenia de las enfermedades cardiovasculares. Por ejemplo, se han demostrado niveles elevados de anticuerpos en suero contra el homólogo bacteriano de Hsp60 de mamífero en pacientes con miocardiopatía y diabetes, en individuos asintomáticos con estenosis carotídea y en lesiones ateroscleróticas en conejos y humanos (revisado en la Referencia 222222). Una hipótesis es que la enfermedad autoinmune resulta de la reactividad cruzada de péptidos inmunogénicos, que se derivan de chaperonas bacterianas y mitocondriales y Hsp60 (chaperonina) y son reconocidos por linfocitos T activados γ / δ. 223224 Respuestas inmunes humorales y marcadores seropositivos contra la familia Hsp70 (especialmente ER Grp78 y Hsc70) del parásito protozoario Trypanosoma cruzi han sido implicados en la patogenia de la enfermedad de Chagas, 224A, la causa más común de insuficiencia cardíaca congestiva en América Latina (ver Tabla). Aunque estos estudios correlativos tienen limitaciones inherentes, la investigación futura para establecer la causalidad podría abrir vías para desarrollar vacunas u otras terapias novedosas para el tratamiento y la prevención.

Aplicaciones terapéuticas potenciales de las chaperonas moleculares

Las estrategias que podrían aumentar la tasa de recuperación fisiológica después del aturdimiento postinfarto y la disfunción ventricular siguen siendo objetivos importantes en el tratamiento de los pacientes con infarto agudo de miocardio. Debido a que las maniobras que utilizan hipertermia tisular o de todo el cuerpo son engorrosas y poco prácticas en humanos conscientes, las estrategias farmacológicas que aumentan la expresión de proteínas de estrés para la protección isotérmica tienen un mérito potencial contra el daño isquémico del corazón, los riñones y el cerebro. Los inhibidores del proteasoma, que elevan transitoriamente el nivel de proteínas desplegadas dentro de las células, es un enfoque potencial. 225 Los enfoques alternativos pueden implicar el desarrollo de pequeñas moléculas y péptidos 226 226A que imitan las acciones in vivo de las chaperonas con beneficios terapéuticos.

Perspectivas

El papel de las proteínas del estrés en la cardioprotección ha sido reconocido como una de las direcciones futuras más importantes de la investigación en la cardiopatía isquémica. 227 Dado que el número de personas afectadas es tan grande, una intervención terapéutica que contribuya a un pequeño cambio en la morbilidad y mortalidad postinfarto de miocardio, por ejemplo, puede tener efectos dramáticos en los resultados clínicos generales. Las oportunidades para abordar las funciones fisiológicas de los acompañantes citoprotectores en las enfermedades cardíacas deben ampliarse para incluir sus funciones probables durante las afecciones crónicas (aterosclerótica, hipertensión, diabetes, trastornos genéticos y valvulopatías) que convergen a través de vías comunes, lo que resulta en insuficiencia cardíaca y la muerte súbita. Las alianzas estratégicas entre equipos de investigación podrían forjar nuevas direcciones y acelerar el progreso en esta área prometedora, que, en última instancia, podría tener éxito en la explotación de vías endógenas para mejorar la salud fisiológica y reducir el desgaste fisiológico asociado con las enfermedades cardiovasculares.

Abreviaturas y acrónimos seleccionados

CFTR=fibrosis quística regulador de la conductancia transmembrana
ER=retículo endoplásmico
ERK=quinasa extracelularmente sensible
Grp=proteína relacionada con la glucosa
HO=hemo oxigenasa
Hsc=cognado de choque térmico
HSF=factor de transcripción de choque térmico
HSP=familia de choque térmico de proteínas de estrés
Hsp=proteína de choque térmico
JNK=c-Jun quinasa N-terminal
MAPK=proteína quinasa activada por mitógenos
MAPKAP=Proteína quinasa activada por MAPK
MW=peso molecular
ROS=especies de oxígeno reactivas
SAPK=proteína quinasa activada por estrés
TRiC=Complejo de anillo TCP-1
VSMC=célula de músculo liso vascular

Figura 1. Un resumen de las principales señales fisiopatológicas que activan la síntesis de HSP (a la izquierda de la línea continua vertical) y las funciones potenciales de las HSP (a la derecha de la línea continua vertical). La lesión celular se manifiesta por una mayor generación de ROS, disponibilidad de hierro con actividad redox, peroxidación de los lípidos de la membrana y daño de las proteínas, entre otros. 92 Las fuentes extracelulares de ROS (A) podrían ser células endoteliales, CMLV e incluso miocitos en el tejido circundante. El transporte de electrones mitocondriales de oxígeno molecular (B) puede ser la principal fuente intracelular para la generación de ROS.El calcio intracelular libre (C), que aumenta 10 veces en los 10 minutos posteriores a la reperfusión, 228 229 se ha implicado en la activación de proteasas (D), que, a su vez, se cree que contribuyen a la lesión miocárdica intracelular. 230 231 232 El daño al citoesqueleto (E) es un evento temprano de lesión isquémica, que causa disfunción ventricular o “aturdimiento miocárdico” cuando la lesión es reversible. 87 La lesión miocárdica también podría ocurrir por el reclutamiento de leucocitos polimorfonucleares (PMN) por múltiples mecanismos en el territorio isquémico y por la liberación de radicales libres derivados del oxígeno (A), enzimas lisosomales citotóxicas (F), proteasas extracelulares (G) y complemento. activación (H) (revisado en la Referencia 233). Se cree que diversas señales fisiológicas activan el HSF1 (I) inducible por estrés, que se une al elemento de choque térmico específico de secuencia (HSE) (J), contenido en los promotores de todas las HSP (K). Aunque el mecanismo preciso de protección isquémica mediada por Hsp70 es poco conocido, se atribuye ampliamente a la propiedad biológica de las "chaperonas moleculares", que se propone ayudar en el ensamblaje o reparación de proteínas recién sintetizadas o dañadas. 11 234235 En términos fisiológicos, las funciones potenciales de las chaperonas moleculares en el corazón isquémico incluyen las siguientes: plegamiento de proteínas de polipéptidos recién sintetizados esenciales para mantener el metabolismo oxidativo después del daño de los miocitos (L), protección de las mitocondrias de ROS y citocinas como TNFα 204 236 y translocación de proteínas recién sintetizadas durante la reparación de orgánulos (M), reparación de proteínas estructurales críticas después de alteraciones citoesqueléticas inducidas por isquemia (N), reciclaje de vesículas de membrana (Hsc70) (O) 237, transporte de subproductos tóxicos potenciales para su degradación por el proteasoma (P), 78238239 supresión de citocinas proinflamatorias como la pro-interleucina-1β (Q), 204236240 supresión de NADPH oxidasa y el estallido oxidativo por la respuesta al choque térmico (R), protección 241 por la producción de NO de síntesis inducible de la expresión de HSP (S), 61 242 243 244 245 246 prevención de la apoptosis ya sea a través de la unión del citocromo de la chaperona mitocondrial Hsp60 C y / o unión de Hsp70 de dianas citosólicas (T), 36 204 reparación del canal iónico (U), síntesis de colágeno por la chaperona Hsp47 para la fibrosis reparativa (V), 180 y modulación de la lesión isquémica inmunomediada (W). 241

Figura 2. Un esquema propuesto para el ciclo de reacción del complejo de chaperona Hsc70 en el plegado de un sustrato hipotético en la célula. Comenzando en la parte inferior de la figura, la chaperona Hsc70 (A) consta de una ATPasa N-terminal y un dominio C-terminal para la unión del sustrato diana. Hsp40 (B), el homólogo eucariota de DnaJ, se une primero a proteínas desplegadas (UP) (C) y luego se une a Hsc70.ADP, o se une al complejo Hsc70.ADP.UP (D), que tiene una concentración baja de / tasa de descuento para UPs. Se prevén varios destinos diferentes para el complejo Hsc70.ADP.UP, cada uno de los cuales depende del reemplazo de Hsp40 por diferentes socios accesorios, específicamente, Hip (proteína que interactúa con Hsc70), Hop (proteína organizadora de Hsc70 / Hsp90) y Hap (Proteína accesoria Hsc70). 166247248 Después de la liberación de Hsp40, Hip se une al dominio ATPasa de Hsc70 (E), estimula su actividad y luego permanece unida para estabilizar el complejo ADP-Hsc70-sustrato, lo que sugiere que puede desempeñar un papel en el transporte de sustratos. dentro de las celdas (F). 166 Hop sirve como enlazador físico entre Hsc70 y Hsp90 (G), presumiblemente para facilitar la transferencia de UP entre estos acompañantes. Si Hop cambia o no la actividad de ATPasa de Hsc70 es controvertido. 249 La función de Hup, que estimula la liberación de UP de Hsc70 (H) y convierte los oligómeros de Hsc70 en monómeros (I), aún no se ha establecido. La energía transferida de la hidrólisis de ATP, el paso limitante del ciclo de chaperona eucariota, se usa en ciclos sucesivos para ayudar al plegamiento y prevenir la agregación y degradación. Con este fin, dos proteínas relacionadas, BAG-1 (no mostrada) y Hap (J), que se unen al dominio de la ATPasa Hsc70, también inhiben la unión de Hsp70 al sustrato proteico no plegado in vitro, lo que sugiere que estas proteínas pueden desempeñar un papel en el mantenimiento de control de calidad dirigiendo interacciones no productivas hacia la degradación 250 (ilustración proporcionada amablemente por LE Hightower, Universidad de Connecticut, Storrs).

Tabla 1. Principales clases de PAS en biología cardiovascular

mHsp75 indica Hsp75 HIF-1 mitocondrial, factor de transcripción 1 inducible por hipoxia y MKBP, proteína quinasa de distrofia miotónica.

El Dr. Benjamin recibió el apoyo de la Fundación Estadounidense para la Investigación Médica, los Institutos Nacionales de Salud y un Premio al Investigador Establecido de la Asociación Estadounidense del Corazón. Agradecemos a R. S. Williams, R. Meidell, A. Davis, P. Thomas y R. Sohal por sus comentarios críticos sobre nuestro manuscrito.


Abstracto—Cómo responde una célula al estrés es un problema central en la biología cardiovascular. Diversas tensiones fisiológicas (p. Ej., Calor, hemodinámica, proteínas mutantes y daño oxidativo) producen múltiples cambios en una célula que finalmente afectan las estructuras y funciones de las proteínas. Las células de diferentes phyla inician una cascada de eventos que involucran proteínas esenciales, las chaperonas moleculares, en decisiones para reparar o degradar proteínas dañadas como una estrategia de defensa para asegurar la supervivencia. La evidencia acumulada indica que las chaperonas moleculares, como la familia de proteínas de estrés del choque térmico (HSP), participan activamente en una serie de procesos celulares, incluida la citoprotección. La versatilidad de la omnipresente familia HSP se ve reforzada por las redes reguladoras inducibles por estrés, tanto a nivel transcripcional como postranscripcional. En la presente revisión, discutimos la regulación y función de las chaperonas HSP y su importancia clínica en condiciones tales como hipertrofia cardíaca, lesión de la pared vascular, cirugía cardíaca, preacondicionamiento isquémico, envejecimiento y, posiblemente, mutaciones en genes que codifican proteínas contráctiles y canales iónicos. .

Las tensiones fisiológicas que van desde la isquemia miocárdica hasta las mutaciones genéticas producen estados patológicos en los que el daño proteico y las estructuras proteicas mal plegadas son un denominador común. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ¿Cómo responde la célula? Múltiples vías endógenas participan en la restauración de la homeostasis celular, pero un mecanismo bien caracterizado que involucra el plegamiento de proteínas es la familia de proteínas de estrés del choque térmico, o HSP. 10 11 La comprensión de los mecanismos que subyacen a la función de HSP la proporcionan 2 líneas principales de evidencia: (1) el plegamiento correcto de muchas proteínas en una célula requiere maquinaria de plegamiento de proteínas, las chaperonas moleculares, 12 13 y (2) las chaperonas de HSP se desnaturalizan proteínas o promover su degradación después de un choque térmico. 14 15

Los estudios genéticos proporcionan pruebas convincentes en diferentes filos de que la sobreexpresión de proteínas de estrés es un medio poderoso de citoprotección, incluso en el corazón intacto. 10 16 17 18 De manera similar, estudios bioquímicos han demostrado que la chaperona Hsc70 aumenta el plegamiento productivo de la mutación común ΔF508 de CFTR. Esto sugiere un papel fisiológico de un acompañante de HSP en enfermedades humanas. 19 20 Mecanismos divergentes que producen proteínas celulares anormales o mal plegadas convergen en una vía común, lo que lleva a un aumento en los niveles de proteínas citoprotectoras del estrés, que disminuyen o neutralizan los efectos deletéreos del estrés agudo o crónico.

En esta revisión, resumimos los conocimientos actuales sobre la regulación y función de los acompañantes individuales (p. Ej., Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp47, Hsp27 y αB-cristalina) en el sistema cardiovascular. Además de sus roles bien establecidos en la supervivencia celular (necrosis y apoptosis), enfatizaremos la evidencia emergente con respecto a las funciones de chaperón en la adaptación fisiológica durante la hipertrofia cardíaca, el preacondicionamiento isquémico, la lesión de la pared de los vasos, el estrés oxidativo y el envejecimiento. Aunque actualmente solo podemos especular acerca de sus roles en enfermedades cardíacas específicas, discutiremos muchas oportunidades potenciales para establecer si las chaperonas de HSP ejercen un efecto o juegan un papel fisiológico directo en la historia natural de enfermedades resultantes de mutaciones del aparato contráctil cardíaco ( p. ej., miocardiopatía hipertrófica) y canales iónicos (p. ej., síndrome de QT largo) en humanos.

Definiciones y nomenclatura

¿Qué son las proteínas de "choque térmico" del estrés?

El término proteína de "choque térmico" es un nombre inapropiado, pero sigue siendo un legado del descubrimiento fortuito de Ritossa 21 de que el choque térmico produjo protuberancias cromosómicas de células de las glándulas salivales en Drosophila. El estrés por calor (~ 5 ° por encima de la temperatura de crecimiento normal) regula al alza la síntesis rápida de una familia de proteínas multigénicas, originalmente llamadas proteínas de choque térmico, 22 que son el resultado de una respuesta a menudo denominada respuesta de choque térmico. 10 21 El estrés por calor subletal previo aumenta transitoriamente la capacidad de una célula para resistir un desafío de calor posterior que de otro modo sería letal. Este fenómeno, o termotolerancia, jugó un papel clave en el lanzamiento de numerosos estudios en modelos experimentales tanto in vitro como in vivo en los que se encontró una asociación similar entre la respuesta al choque térmico y la protección contra hipoxia o isquemia simulada. De hecho, diversos estreses, incluidos metales pesados, análogos de aminoácidos, inflamación y estrés oxidativo / isquémico, inducen la expresión de genes HSP. En consecuencia, se prefieren los términos "proteínas de estrés" o "familia de proteínas de estrés de choque térmico", aunque muchas de estas proteínas tienen funciones esenciales durante condiciones no estresadas. 13

Las proteínas de estrés pertenecen a familias multigénicas que varían en tamaño molecular de 10 a 150 kDa y se encuentran en todos los compartimentos celulares principales. La convención es nombrar proteínas de estrés de varios tamaños moleculares como sigue: Hsp27, Hsp70 y Hsp90, mientras que los genes de proteínas de choque térmico se designan como sigue: hsp27, hsp70 y hsp90. 23 La distinción entre miembros expresados ​​constitutivamente (p. Ej., Hsc70 y Hsp90β) o miembros afines de la familia HSP y sus isoformas inducibles (Hsp70 y Hsp90α, respectivamente) es arbitraria, ya que la acumulación de evidencia, en sistemas in vivo fisiológicamente relevantes, ahora indica que tales relaciones dependen de la expresión restringida a células y tejidos.

Las consecuencias celulares del calor y el estrés isquémico son similares

Al igual que la isquemia / reperfusión experimental, el choque térmico es un estrés que interrumpe numerosos procesos metabólicos y estructuras celulares y que culmina en la muerte celular cuando se excede un umbral crítico. 10 24 25 Tanto el estrés por calor como la isquemia causan daños extensos al citoesqueleto, incluido el colapso de la red de filamentos intermedios en forma de hilos en grandes agregados perinucleares, la reorganización de la red citoplasmática, la relocalización de las fibras que contienen actina alrededor del núcleo y la rotura de los microtúbulos y la huso mitótico. 26 27 La hinchazón mitocondrial, la pérdida de mitocondrias y el desacoplamiento de la fosforilación oxidativa son características similares del choque térmico y la lesión isquémica temprana reversible. 28 29 30

De manera característica, la síntesis de proteínas en general se inhibe después de la exposición al calor extremo como resultado de la fosforilación de factores de iniciación como eIF2α, que interrumpe el ensamblaje ribosómico e inactiva las proteínas de unión a la cápsula. 31 32 33 En contraste, los genes HSP se expresan de manera eficiente después de la exposición al calor, en parte, como resultado de la ausencia de intrones en varios genes inducibles (p. Ej., Hsp70). Además, las alteraciones del empalme del ARNm y la estabilización del ARNm inducida por calor son mecanismos adaptativos que se utilizan para traducir eficazmente las proteínas de estrés, que pueden alcanzar entre el 15% y el 25% de la proteína intracelular total en cuestión de minutos después del estrés fisiológico en estas condiciones. 10 34 Casualmente, varias chaperonas citosólicas se trasladan al núcleo, 35 donde la inhibición inducida por el calor del ensamblaje de la cromatina del ADN expone una conformación sensible a las nucleasas, una característica patognomónica de la apoptosis inducida por el calor y la isquemia. 36 Se observan cambios menos dramáticos en las proteínas integrales de la membrana, la bicapa lipídica y la morfología de la superficie celular. La cesación de los estímulos nocivos va seguida de una degradación rápida y eficaz de los ARNm de Hsp. 37 38 39

Como se mencionó anteriormente, el estrés por calor subletal previo o "preacondicionamiento hipertérmico" atenúa profundamente todos los cambios celulares inducidos por el calor a un desafío por calor severo posterior. Además, el pretratamiento con calor produce "tolerancia cruzada" a diversos tipos de estrés fisiológico. Por ejemplo, la protección del corazón isquémico intacto después del pretratamiento con calor puede durar de horas a días. 40 41 La comprensión obtenida de los roles fisiológicos de la expresión de Hsp durante la respuesta al choque térmico ha contribuido a los pensamientos actuales sobre las funciones de chaperona en estados patológicos que probablemente resulten en un plegamiento anormal de proteínas.

La atención se ha centrado principalmente en la inducción de chaperonas de HSP y los posibles mecanismos de reparación implicados en la mitigación de la lesión por isquemia / reperfusión. La Figura 1 resume de forma esquemática muchos de estos conceptos e ilustra los múltiples mecanismos bien reconocidos implicados en la lesión miocárdica isquémica, que incluyen daño / estrés oxidativo, sobrecarga de calcio y proteasas activadas, liberación de enzimas proteolíticas y lisosomales, alteraciones del citoesqueleto y activación del complemento.

Diversos estreses fisiológicos inducen la expresión del gen HSP a través de un mecanismo común

La rápida inducción de la expresión de la proteína de estrés se logra mediante mecanismos de activación transcripcional y traducción preferencial. 10 42 HSF (HSF1 a HSF4) regulan la síntesis inducible de HSP durante el desarrollo, crecimiento y adaptación. 42 43 44 Mientras que los genes esenciales de copia única codifican HSF en Saccharomyces cerevisiae y Drosophila, 45 46 Se han identificado múltiples HSF en pollos, plantas, ratones y humanos. 47 48 49 50 51 Se han identificado dos HSF (HSF1 y HSF2, que codifican proteínas de 75 y 72 kDa, respectivamente) en el ratón. 49 Ni HSF1 ni HSF2 son inducibles por calor, pero HSF1 está hiperfosforilado en un ras-dependiente por miembros de las subfamilias MAPK (ERK1, JNK / SAPK y proteína quinasa p38) durante el estrés fisiológico. 52 53 Durante condiciones no estresadas, tanto la actividad de unión al ADN como la actividad transcripcional del HSF1 de vertebrados están bajo un estricto control negativo (revisado en la Referencia 44 44). Sin embargo, sigue siendo controvertido si la represión por la chaperona Hsp70, el secuestro de la fosforilación constitutiva en los residuos de serina o los reguladores inhibidores desconocidos son los principales mecanismos subyacentes a la activación inducible por estrés y la desactivación rápida de HSF1. 43 54 55 56

Estudios previos han demostrado que en respuesta tanto al calor como a la isquemia simulada, el mecanismo (s) para la activación de HSF1 es similar, si no idéntico, en las células miogénicas 57 y que el agotamiento del ATP intracelular juega un papel importante en el desencadenamiento de la unión de HSF1-ADN actividad. 58 En condiciones de enfermedad, se cree que los inductores de la activación de HSF1, como las LDL oxidadas y los intermedios de nitrógeno reactivo, aumentan el daño de las proteínas, lo que desencadena la regulación positiva de la expresión del gen HSP. 59 60 61 Sin embargo, la activación transcripcional de la vía HSF1 no requiere nueva síntesis de proteínas, ya que el transactivador preexistente (HSF1) está inactivo en el estado sin estrés. 43 56 57 Las tensiones fisiológicas, como el calor y la isquemia, inducen a los monómeros de HSF1 a oligomerizar como homotrímeros, que luego se unen a un motivo específico de secuencia aguas arriba, elemento de choque térmico, en el promotor de todos los genes de HSP inducibles por estrés 62 63 (Figura 1I hasta 1K). Recientemente, establecimos un modelo de eliminación genética de Hsf1 y demostramos en estudios in vitro el requisito esencial de esta vía reguladora en la defensa celular y la termotolerancia. 36 Además, la expresión de la proteína de estrés se ha implicado en la promoción de la supervivencia de las células tumorales 64 y la protección del corazón isquémico. 16 17 18

La sobreexpresión de proteínas de estrés mejora la velocidad de recuperación fisiológica del corazón isquémico

Una literatura sustancial describe la inducción de Hsp70 por isquemia, 57 65 66 el papel potencial de Hsp70 en el preacondicionamiento isquémico, 40 67 y una correlación inversa entre la expresión de Hsp70 inducida por el preacondicionamiento isquémico o térmico y el tamaño del infarto en modelos animales. 41 68 69 70 Además, la expresión forzada de Hsp70 transmite un efecto citoprotector en las células cultivadas, incluidos los miocitos cardíacos sometidos a isquemia simulada. 71 72 Específicamente, la sobreexpresión de la principal proteína de choque térmico de 70 kDa (Hsp70) en ratones transgénicos mejora la función miocárdica, 16 17 18 preserva la recuperación funcional metabólica, 18 y reduce el tamaño del infarto 73 después de isquemia / reperfusión. Además de la Hsp70, la Hsp27 y la αB-cristalina pueden proteger a los cardiomiocitos primarios contra el daño isquémico. 74 Aunque los mecanismos precisos no se comprenden suficientemente, se cree que las proteínas de estrés median la cardioprotección a través de sus funciones biológicas como chaperonas moleculares.

Las proteínas del estrés pueden funcionar como acompañantes moleculares

Las chaperonas moleculares, como Hsp70 y αB-cristalina, son proteínas que facilitan el plegado, ensamblaje y desensamblaje de otras proteínas, pero no forman parte del producto terminado. 75 Dado que muchas proteínas requieren chaperonas para plegarse, estas proteínas son componentes esenciales en la etapa final del dogma central de la biología molecular: ADN↔ARN → polipéptido → proteína plegada. 11 75 Las chaperonas in vitro funcionan para prevenir la agregación de otras proteínas en condiciones de estrés y para promover la restauración de la actividad enzimática de sustratos de proteínas desnaturalizados o enzimas (p. Ej., Citrato sintasa, β-galactosidasa o luciferasa) al eliminar el estrés. 11 13 76

La Figura 2 muestra esquemáticamente el ciclo de reacción de la chaperona Hsc70 en relación con cochaperonas y sustratos moleculares recientemente identificados en la célula. Por ejemplo, la chaperona Hsp40 desempeña una función catalítica importante en la carga de sustratos objetivo en el ciclo de unión / liberación de Hsc70. 77 Aunque los mecanismos de estas funciones aún están emergiendo, las principales funciones de las chaperonas moleculares son (1) unir transitoriamente y retrasar el plegamiento de las cadenas polipeptídicas nacientes hasta que se completa la síntesis, (2) mantener las cadenas polipeptídicas en una conformación apropiada adecuada para la translocación. a través de las membranas de orgánulos, (3) previenen la agregación de interacciones intramoleculares o intermoleculares, (4) desmontan activamente las vesículas recubiertas de clatrina, (5) mantienen los complejos de esteroides aporeceptores en estados competentes de ligandos (Hsp90 y cochaperona) y (6) ayudan a degradar los tóxicos metabolitos promoviendo la ubicuinación y la lisis del proteasoma 78 (Figura 1L a 1P).

El caso de las acompañantes moleculares en las enfermedades cardíacas

El interés clínico generalizado en las funciones biológicas de las chaperonas moleculares se extiende a una variedad de patologías humanas, desde afecciones degenerativas como la enfermedad de Alzheimer, priones, amiloidosis, formación de cataratas, enfermedad de células falciformes, fibrosis quística y diversas enfermedades cardíacas, incluida la isquemia miocárdica. Los eventos tempranos que restablecen el reflujo oportuno del miocardio isquémico, ya sea mediante trombolíticos, angioplastia directa o lisis espontánea de coágulos, son esenciales para mejorar la recuperación del miocardio y reducir la morbilidad y la mortalidad. 79 80 No obstante, la isquemia recurrente, ya sea por rotura de una placa inestable o insuficiencia cardíaca congestiva, puede complicar el curso clínico de un infarto agudo de miocardio. En el infarto agudo de miocardio sin complicaciones, la recuperación fisiológica a nivel celular comienza en minutos, pero podría durar de semanas a meses antes de que se complete la reparación del miocardio. Por tanto, los mecanismos de protección endógenos tienen relevancia clínica para mitigar los efectos de la cardiopatía isquémica.

Actividades bioquímicas de la vía reguladora de HSP y acompañantes durante la isquemia miocárdica

En trabajos previos realizados para definir el estímulo próximo a la activación de HSF, observamos que la acidosis intracelular severa (pH 6,7) era insuficiente para inducir la unión de ADN de HSF1 en células miogénicas cultivadas expuestas a isquemia simulada, si se conservaban las reservas de ATP. 58 En contraste, la depleción severa de ATP (65%) estimuló la unión al ADN de HSF1, incluso si el pH se mantuvo dentro del rango normal. 58 En el corazón isquémico intacto, 15 minutos de isquemia, que produce lesión reversible, se asocia con una reducción similar (65%) de las reservas de ATP de alta energía, mientras que la lesión letal se encuentra con isquemia prolongada (& gt40 minutos) y & gt90% de depleción. de piscinas de alta energía. 81 El Kmetro para la débil actividad ATPasa de la Hsc70 bovina es de 1 a 2 µmol / L, 3 órdenes de magnitud por debajo de las concentraciones milimolares de los conjuntos de nucleótidos de adenina intracelulares. 75 Por lo tanto, es poco probable que la activación dependiente de ATP de la vía reguladora de HSF1 y las propiedades bioquímicas de las chaperonas moleculares se vean afectadas negativamente durante los períodos de isquemia transitoria o lesión isquémica miocárdica reversible.

La prueba de principio que indica un efecto cardioprotector de Hsp70 en animales transgénicos sometidos a isquemia / reperfusión sugiere que los métodos farmacológicos o genéticos para aumentar la expresión de proteínas de estrés en el miocardio de pacientes con riesgo de eventos isquémicos agudos podrían limitar la lesión isquémica. 82 Sin embargo, se necesitan conocimientos básicos adicionales con respecto a (1) sus relaciones con otras vías endógenas involucradas en la protección miocárdica del daño / estrés oxidativo, (2) la especificidad funcional entre los miembros acompañantes de la familia multigénica HSP, y (3) la contribución de este vía durante la isquemia aguda y otros estados fisiológicos que desencadenan la respuesta al choque térmico, antes de la aplicación clínica.

Proteínas de estrés y vías antioxidantes para la cardioprotección

Desde la década de 1970, médicos e investigadores han seguido la hipótesis de que los captadores de radicales libres pueden mejorar el daño oxidativo durante la isquemia / reperfusión. 83 En sistemas modelo que van desde transgénicos Drosophila para los ratones, la sobreexpresión de catalasa, superóxido dismutasa o glutatión peroxidasa tiende a proteger contra el estrés oxidativo. 84 85 86 El estrés oxidativo, por isquemia / reperfusión, también juega un papel central en la lesión de órganos vitales como el cerebro, riñón y corazón. Se cree que las ROS contribuyen a la disfunción ventricular o "aturdimiento miocárdico", arritmias y daño celular progresivo o muerte después de una lesión isquémica (Figura 1). 87 88 89 90

Se han informado resultados discrepantes de los intentos de administrar antioxidantes durante y después de la isquemia / reperfusión miocárdica. 91 92 Los antioxidantes exógenos, que están restringidos a los espacios intersticiales, pueden tener una capacidad limitada para proteger las proteínas intracelulares contra las ROS. Por ejemplo, el radical libre de hidroxilo (· OH), que se cree que es el principal agente del daño oxidativo, es tan altamente reactivo con un sustrato típico que su vida media a 37 ° C es de 7 x 10 −10 segundos. 93 Por tanto, es difícil imaginar que la administración de antioxidantes exógenos, en concentraciones que sean fisiológicamente factibles, pueda prevenir eficazmente el daño macromolecular inducido por OH. Una estrategia potencialmente más eficaz puede ser minimizar fisiológicamente la producción de · OH. De hecho, la sobreexpresión de miembros de la familia HSP puede proporcionar una de esas vías. Varios estudios han informado que durante la protección contra la isquemia miocárdica, la regulación al alza de los niveles de proteínas de estrés se correlaciona con aumentos en la actividad enzimática de la catalasa, lo que sugiere posibles interacciones aditivas o sinérgicas de estas vías endógenas contra el estrés oxidativo. 40 94 95 Una pregunta importante sin respuesta es si las funciones de las proteínas de estrés, como chaperonas moleculares, complementan las funciones únicas de las enzimas antioxidantes en la protección contra el estrés / daño oxidativo..

Chaperonas moleculares de los compartimentos citosol / nuclear

La tabla muestra las principales clases de HSP, los compartimentos intracelulares, sus funciones putativas y la importancia potencial en biología cardiovascular.

Chaperones Hsp70

Los miembros de la familia Hsp70 son el grupo más estudiado y abundante en células eucariotas. 96 En el citosol, Hsp70 se une a polipéptidos nacientes antes de su liberación del ribosoma. 97 Todos los miembros de la clase chaperona Hsp70 poseen dos dominios distintos: un dominio ATPasa N-terminal altamente conservado y un dominio C-terminal más divergente, que une péptidos hidrófobos cortos de sustratos diana 98 99 (Figura 2A). La función de chaperona de Hsp70 requiere el dominio ATPasa N-terminal, que, curiosamente, es similar estructuralmente a la actina del músculo esquelético de conejo a pesar de la poca similitud de secuencia. 100

Estas relaciones estructura / funcionales de Hsp70 probablemente confieren actividad de chaperona in vivo en la cardioprotección. A este respecto, prácticamente no se sabe nada acerca de la chaperona constitutiva de Hsc70, que comparte una homología de secuencia & gt80% con Hsp70. Posiblemente, una modesta regulación positiva de la Hsc70 constitutiva podría promover un beneficio cardioprotector sustancial. Sin embargo, la regulación positiva de las HSP más allá de un umbral crítico puede tener consecuencias celulares deletéreas. 101 Se informó recientemente que existen funciones distintas entre los miembros de Hsp70 en regiones fuera del dominio de unión del péptido, lo que sugiere niveles adicionales de complejidad para las funciones de chaperona in vivo. 102

Chaperones Hsp90

La Figura 2 muestra que la chaperona Hsp90 es un componente del ciclo de reacción que involucra al complejo chaperona Hsc70 y proteínas recién sintetizadas. Además, los miembros de la familia Hsp90, Hsp90α y Hsp90β, que constituyen del 1% al 2% de las proteínas citoplasmáticas solubles totales, tienen las relaciones funcionales in vivo mejor caracterizadas con las proteínas diana, los receptores de hormonas esteroides. 103 Hsp90 con acompañantes acompañantes, Hsp70 y Hsp56, se une directamente, estabiliza y mantiene el complejo aporeceptor en una conformación inactiva. La unión de ligando (p. Ej., Estrógeno) al complejo de aporeceptor desencadena la hidrólisis de ATP por Hsp90, que se disocia de un receptor "activado" que ahora puede unirse al motivo de reconocimiento específico de secuencia e inducir la transcripción de genes diana. 104 Además, los niveles elevados de expresión de Hsp90 desestabilizan el complejo receptor de estrógeno / elemento sensible al estrógeno y regulan negativamente la expresión del gen diana sensible al estrógeno, lo que indica un bucle de retroalimentación reguladora. 105

Las funciones de chaperona de Hsp90 están mediadas por vías de transducción de señales que involucran varias proteínas quinasas de tipos tirosina y serina-treonina, caseína quinasa II, eIF-2α regulado por hemo y una variedad de otras proteínas celulares, como calmodulina, actina y tubulina. (revisado en la Referencia 106106). Finalmente, los chaperones Hsp90 de Saccharomyces cerevisiae son esenciales para la supervivencia en todas las condiciones, lo que respalda sus importantes funciones fisiológicas en los eucariotas inferiores. 107

Chaperonas citosólicas de especial interés en biología cardíaca y vascular

A diferencia de las omnipresentes homólogas Hsp70 y Hsp90, los miembros específicos de las HSP de PM pequeño (HO-1 o Hsp32, Hsp27, αB-cristalina y chaperonas Hsp20) exhiben una expresión restringida en los tejidos, lo que sugiere posibles propiedades especializadas en el sistema cardiovascular.

HO inducible (Hsp32)

HO es la enzima que limita la velocidad en la degradación del hemo a biliverdina (un potente antioxidante), hierro molecular y monóxido de carbono. Tres genes de copia única relacionados codifican las isoformas HO: HO-1, HO-2 y HO-3. 108109110 HO-1 es una proteína de estrés genuina de 32 kDa (Hsp32) que es inducida por diversos estreses fisiológicos, que incluyen hipoxia, isquemia / reperfusión, hemina, peróxido de hidrógeno y varios metales pesados ​​(selenio, arsenito, cobalto, cadmio e iones estannosos). 108 109 110 Inducible Hsp32 (HO-1), la isoforma más ampliamente expresada, está presente en las células del miocardio. 111

La Hsp32, como la forma inducible de la NO sintasa, media la inhibición plaquetaria dependiente de guanilil ciclasa y la vasodilatación de las CMLV. 112 113 114 Sin embargo, las fuerzas hemodinámicas fisiológicamente relevantes (esfuerzo cortante y tensión cíclica) inducen la expresión de ARNm de HO-1 pero no la expresión de NO sintasa inducible, lo que sugiere la especificidad de esta vía de respuesta al estrés a las señales fisiológicas. 115 Tanto el NO liberado endógenamente como el administrado exógeno inducen un aumento de 3 a 6 veces en la expresión del gen Hsp32 (HO-1) y la producción de CO en las CMLV 116 de manera similar, el inhibidor protoporfirina-IX de estaño previene la agregación plaquetaria mediante la inducción del gen HO-1 expresión y producción de CO en las CMLV aórticas. 115 En las CMLV de rata, el tratamiento con angiotensina II disminuye la expresión del ARNm de Hsp32 (HO-1) de una manera dependiente del calcio. 117 Sin embargo, la hipertensión inducida por angiotensina II aumenta la expresión del ARNm de Hsp32 (HO-1) en la aorta de rata, lo que sugiere la influencia predominante de los factores hemodinámicos in vivo. 118

Varias vías reguladoras están implicadas en la inducción de la expresión del gen Hsp32, más notablemente HSF1 y las vías del factor de transcripción 1 inducible por hipoxia. 119 120 121 122 Aunque se carece de evidencia directa de una función chaperona de Hsp32, su sobreexpresión en varios tipos de células protege contra el estrés / daño oxidativo. 123124125 En consecuencia, los estudios para definir las vías reguladoras precisas estimuladas por los metales pesados, la hipoxia y el estrés oxidativo podrían proporcionar una nueva visión de las funciones biológicas de Hsp32 (HO-1) en la modulación del estrés / daño oxidativo durante la isquemia / reperfusión, el tono vascular (p. ej., hipertensión) e inhibición de la agregación plaquetaria y / o proliferación de CMLV después de una angioplastia con balón.

Hsp25 / 27 Chaperón

Después de su descubrimiento como inhibidor de la polimerización de actina, se ha demostrado que la chaperona 126 Hsp 25/27 (Hsp25 en ratones y Hsp27 en humanos) desempeña un papel importante en la dinámica de los filamentos de actina en diversos tipos de células. Los estímulos fisiológicos (estrés oxidativo, citocinas y factores de crecimiento) aumentan drásticamente la fosforilación de Hsp27 humana en los residuos Ser15, Ser78 y Ser83, que es esencial para la tolerancia adquirida. 127128129 La fosforilación de Hsp25 / 27 es catalizada por las MAPK (p38-MAPK, JNK o SAPK) y ERK. 130 En el corazón adulto perfundido, tanto p38-MAPK como JNK / SAPK se activan después de isquemia / reperfusión. 131 En respuesta al tratamiento con ROS, la activación de p38-MAPK aumenta la actividad de la cinasa 2 de MAPKAP, que fosforila Hsp27. 132

En las células endoteliales humanas, la inhibición de la activación de p38-MAPK inducida por el factor de crecimiento endotelial vascular anula la fosforilación de Hsp27, la polimerización de actina y la migración celular, lo que sugiere un posible vínculo entre Hsp27 y la angiogénesis. 133 En conjunto, la evidencia disponible coloca a p38-MAPK como un activador corriente arriba de la fosforilación de Hsp25 / 27 inducible por estrés, y esta vía subyace al efecto de p38-MAPK en la reorganización de la actina filamentosa, la acumulación de fibras de estrés y el reclutamiento de vinculina en sitios focales de adhesión. 134 A continuación, será importante determinar si Hsp25 / 27 ejerce acciones vasoprotectoras en respuesta a fuerzas hemodinámicas o lesión de la pared del vaso. Sin embargo, el análisis directo probablemente requerirá un modelo de desactivación del gen Hsp27.

Acompañante de αB-cristalina (Hsp22)

Mientras que Hsp27 se detecta en células endoteliales, CMLV y cardiomiocitos, la chaperona αB-cristalina se expresa solo en cardiomiocitos. 135 Tanto Hsp27 como αB-cristalina son HSP genuinas estructuralmente relacionadas con actividad de chaperona in vitro pero, a diferencia de Hsp70, no son proteínas de unión a ATP. 136137138139 El mayor interés en la regulación y función de la proteína αB-cristalina (Hsp22), una proteína estructural principal del cristalino ocular, se relaciona con su expresión restringida en tejidos en linajes miogénicos estriados con alta capacidad oxidativa, como el corazón y fibras musculares esqueléticas de tipo I. 140 En tejidos no lenticulares, la expresión posnatal de αB-cristalina aumenta y alcanza sus niveles más altos en el corazón adulto (~ 1% a 3% de la proteína soluble total), seguida por el músculo esquelético y el riñón. 140 Estudios inmunohistoquímicos previos han localizado la expresión más alta de αB-cristalina en las fibras de conducción cardíaca del corazón adulto. 141 Actualmente se desconoce si una alteración de la expresión de αB-cristalina podría conducir a anomalías del sistema de conducción, pero plantea una posibilidad intrigante.

Aunque la expresión de αB-cristalina se ha localizado en las bandas Z del citoesqueleto, en un patrón similar al de la desmina y la actina, 142 estudios recientes sugieren que esta interacción es mucho más transitoria y dinámica con respecto a los objetivos intracelulares, dependiendo de las condiciones fisiológicas. En miocitos cardíacos no estimulados, los estudios bioquímicos indican que la αB-cristalina es muy soluble y permanece en la fracción citosólica, el calor o la isquemia desencadena una rápida translocación de αB-cristalina en las fracciones citoesqueléticas / nucleares insolubles, agregación e interacciones específicas en las bandas Z (Referencia 142). 142 e IJ Benjamin, datos no publicados, 1998). La importancia fisiológica de la tendencia tanto de la αB-cristalina como de la Hsp25 / 27 a formar grandes complejos heterooligoméricos (500 a 800 kDa) tanto in vivo como in vitro después de tensiones fisiológicas sigue siendo un misterio. 143 144 Aunque la chaperona de αB-cristalina proporciona citoprotección a los cardiomiocitos, 74 los mecanismos reguladores de las modificaciones posteriores a la traducción, como la fosforilación, glicación y desacetilación de la función de αB-cristalina, esperan un análisis directo en el sistema cardiovascular.

Proteínas de estrés y desarrollo y diferenciación de músculos estriados

Se ha descrito un aumento de la expresión de chaperona de HSP de pequeño MW durante períodos asociados con una mayor síntesis de proteínas, degradación de proteínas y reorganización celular, como diferenciación miogénica y embriogénesis. 145 La expresión restringida en tejido de αB-cristalina durante la miogénesis del músculo esquelético puede requerir la familia MyoD de factores de transcripción básicos hélice-bucle-hélice, que se unen al potenciador esencial de la caja E contenido en el promotor de αB-cristalina. 146 147 Recientemente informamos que la expresión de αB-cristalina, pero no de Hsp27, está directamente relacionada con aumentos en el metabolismo oxidativo en el músculo esquelético después de la estimulación nerviosa crónica. 148 Sin embargo, el papel fisiológico de la regulación positiva de la expresión de Hsp27, que precede a la diferenciación temprana de las células madre embrionarias murinas, aún no se ha establecido en los linajes miogénicos. 149

Se sabe mucho menos acerca de los mecanismos reguladores implicados en la expresión restringida de αB-cristalina en miocitos cardíacos. La αB-cristalina se expresa abundantemente en el desarrollo cardíaco temprano a partir del día embrionario 8.5, lo que sugiere un papel como proteína estructural o como acompañante molecular en la estabilización de miofibras. 150 Dado que los factores similares a Myo-d están ausentes en el corazón, los estudios de unión in vitro de extractos nucleares cardíacos han implicado las actividades transcripcionales de un factor estimulante corriente arriba en el elemento de la caja E y el factor de respuesta sérica en una caja CArG inversa en el Promotor de αB-cristalina. 151 Hasta ahora, una encuesta de desarrollo in vivo revela que la expresión de αB-cristalina no se ve afectada en el músculo esquelético de myf5 ratones nulos o el corazón de ratones nulos d-HAND en el día embrionario 9.0 (I.J. Benjamin, datos no publicados, 1998). 152 153

Otros acompañantes citosólicos / nucleares

Varias otras HSP que existen en el compartimento citosólico / nuclear son de interés potencial en biología cardiovascular. Por ejemplo, la proteína citosólica de 20 kDa, p20, se expresa abundantemente en el corazón, el músculo esquelético y el músculo liso y se copurifica con las chaperonas αB-cristalina y Hsp27. 154 155 Aunque la expresión de p20 no es inducida ni por calor ni por estrés químico, contiene el "dominio de cristalina α" homólogo C-terminal compartido por todos los miembros de las HSP de PM pequeño. 138 En las CMLV, p20 es un sustrato para las proteínas quinasas cAMP y cGMP, lo que sugiere un papel regulador de las funciones postuladas en el mantenimiento fisiológico del tono vascular y la adaptación a la lesión de la pared de los vasos. 156

Un cuarto miembro de las HSP pequeñas (además de Hsp27, αB-cristalina y p20), una proteína de unión a proteína quinasa de distrofia miotónica se asocia e incrementa la actividad de la proteína quinasa de distrofia y previene su desnaturalización in vitro inducida por el calor. 157 La proteína quinasa de la distrofia miotónica, a diferencia de Hsp27 o αB-cristalina, está regulada al alza en el músculo esquelético de pacientes con distrofia miotónica, lo que sugiere que esta nueva proteína puede estar involucrada en la patogenia de esta enfermedad. 157

Los miembros de la familia Hsp110 exhiben funciones de chaperona y citoprotectoras, aunque los detalles sobre su expresión relativa en las células del miocardio y la distribución regional en el sistema cardiovascular esperan una caracterización adicional. 158 Los miembros adicionales de la familia Hsp110 incluyen Hsp105, Apg-1 y Osp94. 159 160 161 Existe un gran interés en identificar un homólogo mamífero de la levadura Hsp104 que, en lugar de prevenir la agregación de proteínas, parece resolubilizar agregados de proteínas insolubles. 162

Sistema de chaperona mitocondrial Hsp70

Todos los organismos poseen mecanismos dependientes de ATP para el plegamiento y ensamblaje de proteínas dentro de los orgánulos. 11 13 La translocación de proteínas a través de la membrana mitocondrial requiere la chaperona mitocondrial Hsp70 en la matriz, donde se completa el plegamiento al estado nativo 13 (ver Figura 1).

Sistema de chaperonina mitocondrial

Además de las chaperonas similares a Hsp70, las chaperoninas mitocondriales Hsp60 y Hsp10 constituyen un sistema separado que proporciona un entorno secuestrado para plegar un subconjunto de proteínas in vivo. 163 Estos anillos de 7 miembros están dispuestos como estructuras cilíndricas en las que se produce un plegamiento de proteínas dependiente de ATP en su cavidad central. 164 La evidencia de estudios in vitro sugiere que las chaperonas y los sistemas de chaperonina de Hsp70 funcionan de manera cooperativa en el plegamiento y ensamblaje de proteínas en eucariotas (revisado en la Referencia 13 13).

Sistema de chaperonina citosólica

La chaperonina TRiC se considera el equivalente funcional de la chaperonina Hsp60 / Hsp10 en el citosol eucariota. El complejo TRiC, que consta de anillos dobles de 8 o 9 miembros de subunidades de ≈55 a 65 kDa, es necesario para el plegamiento de actina y tubulina in vivo. 165 Chaperonin TRiC requiere componentes adicionales, como Hsp40, que estimula la ATPasa Hsc70, para el plegamiento de proteínas en el citosol 77 166 (ver Figura 2). La evidencia disponible sugiere que la chaperonina TRiC funciona en las etapas finales de plegamiento durante la traducción de un número limitado de dominios polipeptídicos. 13

Trascendencia

Las chaperonas y chaperoninas mitocondriales solo son inducidas modestamente por el estrés fisiológico en los cardiomiocitos y el corazón. 167 Sin embargo, la ubicación de las chaperonas y chaperoninas de Hsp70 mitocondriales en los principales sitios de producción de ROS podría servir para complementar los mecanismos de defensa tanto enzimáticos como no enzimáticos para disminuir la lesión oxidativa y aumentar la tasa de recuperación fisiológica después de la lesión isquémica. 168 169 Actualmente se desconoce si la sobreexpresión de chaperona o chaperonina de Hsp75 mitocondrial puede proporcionar una protección equivalente o superior contra la lesión isquémica. Otra cuestión importante se refiere a si las funciones superpuestas de las chaperonas Hsp70 y los sistemas de chaperonina Hsp60 o TRiC / Hsp40 están coordinadas para el plegamiento de proteínas de novo y la citoprotección potencial durante la patogénesis de la enfermedad cardíaca.

Chaperonas moleculares en urgencias

Proteínas reguladas por glucosa

El análisis de las chaperonas del RE puede ser de particular interés clínico, porque el RE funciona para degradar o reparar las proteínas dañadas después de la isquemia miocárdica o después de que las proteínas mutantes (p. Ej., CFTR o tiroglobulina) no se plieguen correctamente. 11 170 171 La anoxia, la inanición de glucosa y los ionóforos de calcio inducen miembros de la clase de proteínas de estrés reguladas por glucosa que se unen al Ca 2+, Grp170, Grp94 y Grp78 / BiP. 11 172 Se han informado cambios variables en la expresión de la proteína Grp78 después de la isquemia. 173174 Aunque la "culpa por asociación" con las chaperonas citosólicas es el presunto papel de la función de la chaperona Grp en la vigilancia y el control de la calidad de las proteínas, se necesitan más estudios de su expresión en los estados fisiopatológicos asociados con la expresión, la glicosilación postraduccional y la secreción de proteínas anormales a través de la vía ER-Golgi.

Chaperones Hsp47

La glicoproteína Hsp47 de unión a colágeno de 47 kDa es un miembro de la superfamilia de la serpina (inhibidor de la serina proteasa) y está altamente inducida por estrés por calor o estados patofisiológicos (p. Ej., Fibrosis hepática) asociados con una mayor síntesis de colágeno. 175 Hsp47 reside en el ER y contiene la señal de retención del ER Arg-Asp-Glu-Leu C-terminal. 176 Hsp47 se une transitoriamente a los tipos de colágeno I a IV y ávidamente a los sustratos de colágeno desnaturalizados, por lo que su papel en el procesamiento y transporte de procolágeno parece firmemente establecido. 177 Los estudios futuros deben abordar ahora la probable relevancia biológica y clínica de la expresión de Hsp47 en el inicio y la progresión de estados fisiopatológicos, como infarto de miocardio, miocardiopatías idiopáticas e hipertróficas e hipertensión, en las que la fibrosis miocárdica se destaca de forma destacada. 178

Desafíos actuales y direcciones futuras

La recuperación fisiológica del corazón isquémico comienza en minutos, pero la tasa de reparación isquémica celular, que puede durar de días a semanas, es fundamental para la reducción de la morbilidad y la mortalidad cardiovasculares subsiguientes. La idea de que las proteínas de estrés pueden acelerar la recuperación fisiológica de la lesión miocárdica reversible se basa en evidencia experimental que indica que múltiples “señales” próximas pueden activar la respuesta al choque térmico y, por lo tanto, evocar los mecanismos protectores endógenos de las Hsps. Los eventos clínicos importantes como la angina inestable, la oclusión recurrente después de la terapia trombolítica y la exacerbación aguda de la angina crónica son inductores fisiológicos potenciales de las proteínas citoprotectoras del estrés. El siguiente paso lógico sería considerar la posibilidad de que miembros relacionados de la familia de proteínas de estrés multigénicas confieran beneficios funcionales similares o adicionales. Debido a que la isquemia y otras perturbaciones fisiológicas alteran las relaciones estructura-función normales de las proteínas intracelulares, los estudios futuros deben establecer si las chaperonas moleculares, solas o en combinación, alivian el daño isquémico acelerando la recuperación fisiológica de la célula miocárdica en el organismo intacto.

Modelos experimentales para la investigación de proteínas de estrés

Modelos transgénicos de sobreexpresión de Hsp70 (ganancia de función) y hsf1-los ratones deficientes (pérdida de función) y su posterior caracterización están comenzando a esclarecer sus roles fisiológicos in vivo. 16 17 18 36 Una dirección interesante de tales esfuerzos podría conducir a enfoques integrados en las funciones fisiológicas de sistemas completos o redes reguladoras en modelos animales genéticamente modificados de enfermedades humanas. Sin embargo, no debe pasarse por alto la gran cantidad de conocimientos existentes sobre estudios fisiológicos en animales más grandes que el ratón. Los estudios para definir el papel de la expresión de HSP en el aturdimiento del miocardio utilizando animales conscientes podrían justificar el desarrollo de modelos transgénicos de ratas y conejos. Las limitaciones potenciales de tales estrategias incluyen costos sustancialmente mayores debido a períodos de gestación más largos, mayor tiempo para alcanzar la madurez sexual y tamaños de camada más pequeños de especies tan grandes. Sin embargo, los investigadores con experiencia en biología molecular y fisiología molecular que emprenden proyectos colaborativos aumentan las posibilidades de éxito, al tiempo que evitan la duplicación de esfuerzos.

¿La expresión de genes HSP inducida por estrés afecta el tamaño del infarto, la arritmogénesis y el remodelado miocárdico después de un infarto agudo de miocardio?

Estudios previos han demostrado que el pretratamiento (24 horas) con estrés por calor atenúa la liberación de radicales libres en el corazón aislado de rata 95 y reduce la cantidad de arritmias, un sello funcional importante de la lesión por isquemia / reperfusión (revisado en la Referencia 92 92). Juntos, estos estudios correlacionan las posibles interacciones entre estas vías protectoras, pero son inadecuados para establecer una relación de causa y efecto. El desarrollo de un modelo de ratón knockout del gen HSF1 proporciona un poderoso enfoque experimental para determinar si una deficiencia en la síntesis de HSP inducible por estrés, durante perturbaciones fisiológicas como la isquemia miocárdica, afecta el resultado de la lesión postinfarto y los mecanismos de reparación en el organismo intacto. Los resultados de tales estudios pueden ayudar a establecer la causalidad, dilucidar los posibles mecanismos por los cuales la síntesis de HSP se relaciona con la isquemia miocárdica y evaluar la participación de las proteínas de estrés durante el preacondicionamiento isquémico temprano y tardío. La caracterización oportuna de varios modelos knockout, actualmente en desarrollo en laboratorios de todo el mundo, debería seguir fomentando colaboraciones fructíferas entre los investigadores. 179 Un mayor progreso debería acelerar el flujo de nuevos conocimientos hacia áreas relacionadas como la fibrosis posisquémica reactiva y reparadora, 180 la inflamación posperfusión181 y el aturdimiento miocárdico. 89 182

Expresión de proteínas de estrés y mecanismos de preacondicionamiento isquémico

El preacondicionamiento isquémico es la maniobra experimental más poderosa que protege de forma reproducible el corazón frente a la provocación isquémica posterior. 183 Sin embargo, existe controversia sobre las funciones precisas de las proteínas de estrés en este fenómeno bien caracterizado. 184 Varios mecanismos que involucran a la proteína quinasa C, los receptores de adenosina y sus relaciones con las vías de transducción de señales han sido implicados en el preacondicionamiento isquémico. 185 Evidencia suficiente indica una falta de correlación entre la expresión inducible por estrés (p. Ej., Hsp70) y el preacondicionamiento temprano, que es de corta duración y dura entre 1 y 3 horas, según el modelo y la especie. 186

¿Es improbable que la familia de proteínas de estrés Chaperone tenga relevancia fisiológica en el preacondicionamiento temprano?

En nuestra opinión, los estudios en esta área han descartado prematuramente o prestado una atención inadecuada a la importancia potencial de las Hsps de PM pequeño, como la αB-cristalina y la Hsp27. Es probable que estos acompañantes sean candidatos para la "primera línea de defensa" contra el estrés no letal. Actualmente se desconoce si la oligomerización de Hsps de pequeño peso molecular contribuye a la estabilidad mecánica o al papel especulado del citoesqueleto en la protección isquémica del miocito cardíaco. 187 188 Tanto los modelos de knockout del gen αB-cristalina como Hsp27, actualmente en desarrollo, podrían abordar directamente esta hipótesis.

De manera similar, se necesitan estudios para abordar la correlación entre el preacondicionamiento tardío y la expresión de proteínas de estrés. Veinticuatro horas después de un estrés isquémico inicial, varios estudios han informado aumentos en la síntesis de Hsp60 y Hsp70 en conejos, 41 Hsp70 en cerdos, 182 y manganeso-SOD en perros 189 190 y tolerancia isquémica retardada o preacondicionamiento tardío. Por tanto, una cuestión fundamental es si existe una relación directa entre la expresión de la proteína de estrés y el preacondicionamiento tardío. 191 192 193 También se requiere una evaluación más detallada del papel específico de la Hsp individual en la cardioprotección. Los intentos de determinar el mecanismo del canal de potasio sensible a ATP cardioprotector mediante el uso de inhibidores han encontrado una falta de correlación con la expresión de la proteína de estrés Hsp70. 194 Sin embargo, los enfoques que utilizan inhibidores específicos son inadecuados para establecer la especificidad, con algún grado de certeza, más allá de las proteínas bajo investigación. 195

Chaperonas moleculares y vías de muerte celular

Las proteínas de estrés son candidatas ideales para desempeñar funciones reguladoras clave en la supervivencia celular y las vías de muerte que implican el daño del ADN y la síntesis, reparación y degradación de proteínas. Las maniobras que aumentan la expresión de Hsp70 después del choque térmico, la exposición al butirato de sodio y la sobreexpresión constitutiva o regulada inhiben la apoptosis en una variedad de tipos de células. 196197198 El protooncogén c-mi c potencia la apoptosis inducida por choque térmico 199 200 en contraste, la sobreexpresión de Bcl-2 aumenta la supervivencia celular inducida por termotolerancia. 201 La expresión específica de tejido de Hsp70-2 previene la apoptosis en ciertas células mitóticas a través de un mecanismo que involucra el control del ciclo celular. 202 La función de chaperona de Hsp70 en la regulación de la apoptosis puede estar al nivel de la transducción de señales, ya que se ha implicado en la vía de la quinasa activada por estrés. 203

Estudios recientes en nuestro laboratorio utilizando hsf1Las células cultivadas deficientes han establecido el papel de las Hsps inducibles por estrés para hacer que las células sean termotolerantes a la apoptosis inducida por calor. 36 El presente estudio proporciona un modelo genético para examinar las posibles relaciones interdependientes entre el estrés inducible por Hsps y los mecanismos implicados en la supervivencia celular y / o las vías de muerte celular. El estrés por calor subletal protege las mitocondrias contra el estrés oxidativo y previene la muerte celular por apoptosis. 204 Dadas sus ubicaciones estratégicas en todos los orgánulos principales, es tentador especular que múltiples Hsps pueden combatir el estrés / daño oxidativo replegando represores dañados de la vía de muerte celular o previniendo su degradación. Alternativamente, reprimir la liberación de activadores suicidas como el citocromo C podría ocurrir a través de interacciones con chaperonas y chaperoninas mitocondriales (Figura 1).

Además, los resultados de varios estudios recientes han implicado al pequeño MW Hsp25 / 27 en las vías de supervivencia celular que implican la diferenciación celular y el estrés / daño oxidativo. Estudios previos han demostrado que la sobreexpresión de Hsp25 / 27, como la proteína antiapoptótica Bcl-2, aumenta los niveles del glutatión antioxidante y la resistencia a la apoptosis mediada por Fas / APO-1, aunque no está claro si esto ocurre directamente. 205 La retirada de las células madre embrionarias de ratón del ciclo celular induce una regulación positiva del ARNm de Hsp25 / 27, que se acompaña de una disminución de la fosforilación y un aumento de la oligomerización de la proteína Hsp25 / 27. 149 La reducción antisentido de Hsp25 / 27 revierte estos cambios mediante la prolongación del ciclo celular, la reducción de los niveles de glutatión y la aceleración hacia la apoptosis. Juntos, estos hallazgos provocativos sugieren que durante la proliferación y diferenciación de las células miocárdicas, la chaperona Hsp25 / 27, y otras, pueden reducir el estrés / daño oxidativo y prevenir la apoptosis a través de un nuevo mecanismo redox dependiente. 206

¿La expresión de genes HSP inducida por el estrés afecta la historia natural de las enfermedades cardiovasculares crónicas, incluido el envejecimiento?

Numerosos estudios han correlacionado la inducción de la expresión de Hsp y la sobrecarga de presión por banda aórtica, hipertensión aguda, exposición a agentes vasoactivos o hipertrofia ventricular izquierda y expresión del factor de crecimiento en varios tipos de células. 207 208 209 Se informa que se producen disminuciones en la expresión de genes HSP y la actividad de unión al ADN de HSF1 durante el proceso de envejecimiento en el miocardio de roedores. 210 Existe una creciente evidencia que sugiere que el estrés / daño oxidativo puede ser un factor causal importante en el proceso de envejecimiento. 211 El nivel de estrés oxidativo y la susceptibilidad de los tejidos al estrés oxidativo inducido experimentalmente parecen aumentar durante el proceso de envejecimiento. Actualmente se desconoce si las cantidades aumentadas de daño oxidativo molecular, observadas durante el proceso de envejecimiento, están causalmente asociadas con una actividad disminuida de HSF1 y, por implicación, la expresión del gen Hsp. La disponibilidad de modelos transgénicos y de eliminación de genes permitirá que los estudios futuros establezcan el papel de la expresión génica de choque térmico inducible por estrés durante el envejecimiento normal o la adaptación fisiológica a los factores de riesgo cardíaco asociados a la enfermedad.

Chaperonas moleculares en estados de enfermedad cardíaca causadas por la expresión de proteínas mutantes

Los niveles elevados de proteínas mal plegadas o desnaturalizadas, así como la microinyección de proteínas anormales, son potentes inductores de la expresión del gen HSP. 14 59 Estudios recientes que indican que la chaperona Hsc70 interactúa indirectamente con el CFTR que alberga la mutación de plegamiento común ΔF508 apoyan esta noción general de su papel biológico en las enfermedades humanas. 20

Desde la perspectiva de la biología de la chaperona, las enfermedades cardíacas que surgen de mutaciones en genes que codifican componentes del aparato contráctil o proteínas de los canales iónicos son esencialmente problemas de proteínas anormales. Se han implicado múltiples mutaciones de proteínas sarcoméricas en la patogenia de la miocardiopatía hipertrófica familiar, incluidas las cadenas ligeras y pesadas de miosina, las subunidades de troponina I y T, la proteína C que se une a la miosina y la tropomiosina (Referencia 6 6 y revisada en la Referencia 7 7). Mientras que la chaperona Hsp27 juega un papel en la polimerización de actina y la chaperonina TRiC está involucrada en el plegamiento de actina y tubulina, el papel fisiológico de los sistemas de chaperona y chaperonina en el plegamiento y ensamblaje de estructuras sarcoméricas, en condiciones normales o en enfermedad, sigue siendo un misterio. Posiblemente, las chaperonas pueden influir en la reparación o degradación de proteínas sarcoméricas mutantes, que, en última instancia, afectan las relaciones estructura-función y el fenotipo de la enfermedad. 212 Primero se necesitan análisis in vitro para determinar si la función de la chaperona puede afectar el plegamiento de proteínas productivas causado por las mutaciones relevantes, que pueden validarse en modelos animales apropiados. 18 213

Chaperonas moleculares en biología vascular

Existen numerosas oportunidades para diseccionar las funciones de chaperona durante la síntesis y secreción de péptidos y proteínas biológicos activos, la proliferación celular, la señalización intracelular y el reordenamiento citoesquelético. Los resultados de tales estudios pueden identificar los objetivos específicos de la proteína HSP y la especificidad entre los diversos tipos de células en la promoción de los efectos protectores vasculares del estrógeno. 214 215 Las funciones esenciales de Hsp90 y cochaperonas en la biología del receptor de esteroides sugieren que las chaperonas de HSP desempeñan un papel clínicamente significativo en los efectos de la terapia de reemplazo hormonal en mujeres posmenopáusicas. 216 217 Los estudios epidemiológicos han encontrado que el beneficio protector contra la enfermedad coronaria en mujeres premenopáusicas se elimina en los años posmenopáusicos. 218 219 220 Las posibles acciones protectoras de los estrógenos se han atribuido a sus propiedades antioxidantes y vasoprotectoras, disminución de lípidos y lipoproteínas en sangre y efectos directos sobre la pared de los vasos. 221 Será importante definir si la expresión de Hsp inducible por estrés en ratones modificados genéticamente juega un papel en la respuesta vascular a la lesión en animales machos y hembras. 215

Chaperona molecular y enfermedades inmunológicas

En contraste con sus funciones citoprotectoras bien establecidas, ciertas proteínas de estrés se han implicado en la patogenia de las enfermedades cardiovasculares. Por ejemplo, se han demostrado niveles elevados de anticuerpos en suero contra el homólogo bacteriano de Hsp60 de mamífero en pacientes con miocardiopatía y diabetes, en individuos asintomáticos con estenosis carotídea y en lesiones ateroscleróticas en conejos y humanos (revisado en la Referencia 222222). Una hipótesis es que la enfermedad autoinmune resulta de la reactividad cruzada de péptidos inmunogénicos, que se derivan de chaperonas bacterianas y mitocondriales y Hsp60 (chaperonina) y son reconocidos por linfocitos T activados γ / δ. 223224 Respuestas inmunes humorales y marcadores seropositivos contra la familia Hsp70 (especialmente ER Grp78 y Hsc70) del parásito protozoario Trypanosoma cruzi han sido implicados en la patogenia de la enfermedad de Chagas, 224A, la causa más común de insuficiencia cardíaca congestiva en América Latina (ver Tabla). Aunque estos estudios correlativos tienen limitaciones inherentes, la investigación futura para establecer la causalidad podría abrir vías para desarrollar vacunas u otras terapias novedosas para el tratamiento y la prevención.

Aplicaciones terapéuticas potenciales de las chaperonas moleculares

Las estrategias que podrían aumentar la tasa de recuperación fisiológica después del aturdimiento postinfarto y la disfunción ventricular siguen siendo objetivos importantes en el tratamiento de los pacientes con infarto agudo de miocardio. Debido a que las maniobras que utilizan hipertermia tisular o de todo el cuerpo son engorrosas y poco prácticas en humanos conscientes, las estrategias farmacológicas que aumentan la expresión de proteínas de estrés para la protección isotérmica tienen un mérito potencial contra el daño isquémico del corazón, los riñones y el cerebro. Los inhibidores del proteasoma, que elevan transitoriamente el nivel de proteínas desplegadas dentro de las células, es un enfoque potencial. 225 Los enfoques alternativos pueden implicar el desarrollo de pequeñas moléculas y péptidos 226 226A que imitan las acciones in vivo de las chaperonas con beneficios terapéuticos.

Perspectivas

El papel de las proteínas del estrés en la cardioprotección ha sido reconocido como una de las direcciones futuras más importantes de la investigación en la cardiopatía isquémica.227 Dado que el número de personas afectadas es tan grande, una intervención terapéutica que contribuya a un pequeño cambio en la morbilidad y mortalidad postinfarto de miocardio, por ejemplo, puede tener efectos dramáticos en los resultados clínicos generales. Las oportunidades para abordar las funciones fisiológicas de los acompañantes citoprotectores en las enfermedades cardíacas deben ampliarse para incluir sus funciones probables durante las afecciones crónicas (aterosclerótica, hipertensión, diabetes, trastornos genéticos y valvulopatías) que convergen a través de vías comunes, lo que resulta en insuficiencia cardíaca y la muerte súbita. Las alianzas estratégicas entre equipos de investigación podrían forjar nuevas direcciones y acelerar el progreso en esta área prometedora, que, en última instancia, podría tener éxito en la explotación de vías endógenas para mejorar la salud fisiológica y reducir el desgaste fisiológico asociado con las enfermedades cardiovasculares.

Abreviaturas y acrónimos seleccionados

CFTR=fibrosis quística regulador de la conductancia transmembrana
ER=retículo endoplásmico
ERK=quinasa extracelularmente sensible
Grp=proteína relacionada con la glucosa
HO=hemo oxigenasa
Hsc=cognado de choque térmico
HSF=factor de transcripción de choque térmico
HSP=familia de choque térmico de proteínas de estrés
Hsp=proteína de choque térmico
JNK=c-Jun quinasa N-terminal
MAPK=proteína quinasa activada por mitógenos
MAPKAP=Proteína quinasa activada por MAPK
MW=peso molecular
ROS=especies de oxígeno reactivas
SAPK=proteína quinasa activada por estrés
TRiC=Complejo de anillo TCP-1
VSMC=célula de músculo liso vascular

Figura 1. Un resumen de las principales señales fisiopatológicas que activan la síntesis de HSP (a la izquierda de la línea continua vertical) y las funciones potenciales de las HSP (a la derecha de la línea continua vertical). La lesión celular se manifiesta por una mayor generación de ROS, disponibilidad de hierro con actividad redox, peroxidación de los lípidos de la membrana y daño de las proteínas, entre otros. 92 Las fuentes extracelulares de ROS (A) podrían ser células endoteliales, CMLV e incluso miocitos en el tejido circundante. El transporte de electrones mitocondriales de oxígeno molecular (B) puede ser la principal fuente intracelular para la generación de ROS. El calcio intracelular libre (C), que aumenta 10 veces en los 10 minutos posteriores a la reperfusión, 228 229 se ha implicado en la activación de proteasas (D), que, a su vez, se cree que contribuyen a la lesión miocárdica intracelular. 230 231 232 El daño al citoesqueleto (E) es un evento temprano de lesión isquémica, que causa disfunción ventricular o “aturdimiento miocárdico” cuando la lesión es reversible. 87 La lesión miocárdica también podría ocurrir por el reclutamiento de leucocitos polimorfonucleares (PMN) por múltiples mecanismos en el territorio isquémico y por la liberación de radicales libres derivados del oxígeno (A), enzimas lisosomales citotóxicas (F), proteasas extracelulares (G) y complemento. activación (H) (revisado en la Referencia 233). Se cree que diversas señales fisiológicas activan el HSF1 (I) inducible por estrés, que se une al elemento de choque térmico específico de secuencia (HSE) (J), contenido en los promotores de todas las HSP (K). Aunque el mecanismo preciso de protección isquémica mediada por Hsp70 es poco conocido, se atribuye ampliamente a la propiedad biológica de las "chaperonas moleculares", que se propone ayudar en el ensamblaje o reparación de proteínas recién sintetizadas o dañadas. 11 234235 En términos fisiológicos, las funciones potenciales de las chaperonas moleculares en el corazón isquémico incluyen las siguientes: plegamiento de proteínas de polipéptidos recién sintetizados esenciales para mantener el metabolismo oxidativo después del daño de los miocitos (L), protección de las mitocondrias de ROS y citocinas como TNFα 204 236 y translocación de proteínas recién sintetizadas durante la reparación de orgánulos (M), reparación de proteínas estructurales críticas después de alteraciones citoesqueléticas inducidas por isquemia (N), reciclaje de vesículas de membrana (Hsc70) (O) 237, transporte de subproductos tóxicos potenciales para su degradación por el proteasoma (P), 78238239 supresión de citocinas proinflamatorias como la pro-interleucina-1β (Q), 204236240 supresión de NADPH oxidasa y el estallido oxidativo por la respuesta al choque térmico (R), protección 241 por la producción de NO de síntesis inducible de la expresión de HSP (S), 61 242 243 244 245 246 prevención de la apoptosis ya sea a través de la unión del citocromo de la chaperona mitocondrial Hsp60 C y / o unión de Hsp70 de dianas citosólicas (T), 36 204 reparación del canal iónico (U), síntesis de colágeno por la chaperona Hsp47 para la fibrosis reparativa (V), 180 y modulación de la lesión isquémica inmunomediada (W). 241

Figura 2. Un esquema propuesto para el ciclo de reacción del complejo de chaperona Hsc70 en el plegado de un sustrato hipotético en la célula. Comenzando en la parte inferior de la figura, la chaperona Hsc70 (A) consta de una ATPasa N-terminal y un dominio C-terminal para la unión del sustrato diana. Hsp40 (B), el homólogo eucariota de DnaJ, se une primero a proteínas desplegadas (UP) (C) y luego se une a Hsc70.ADP, o se une al complejo Hsc70.ADP.UP (D), que tiene una concentración baja de / tasa de descuento para UPs. Se prevén varios destinos diferentes para el complejo Hsc70.ADP.UP, cada uno de los cuales depende del reemplazo de Hsp40 por diferentes socios accesorios, específicamente, Hip (proteína que interactúa con Hsc70), Hop (proteína organizadora de Hsc70 / Hsp90) y Hap (Proteína accesoria Hsc70). 166247248 Después de la liberación de Hsp40, Hip se une al dominio ATPasa de Hsc70 (E), estimula su actividad y luego permanece unida para estabilizar el complejo ADP-Hsc70-sustrato, lo que sugiere que puede desempeñar un papel en el transporte de sustratos. dentro de las celdas (F). 166 Hop sirve como enlazador físico entre Hsc70 y Hsp90 (G), presumiblemente para facilitar la transferencia de UP entre estos acompañantes. Si Hop cambia o no la actividad de ATPasa de Hsc70 es controvertido. 249 La función de Hup, que estimula la liberación de UP de Hsc70 (H) y convierte los oligómeros de Hsc70 en monómeros (I), aún no se ha establecido. La energía transferida de la hidrólisis de ATP, el paso limitante del ciclo de chaperona eucariota, se usa en ciclos sucesivos para ayudar al plegamiento y prevenir la agregación y degradación. Con este fin, dos proteínas relacionadas, BAG-1 (no mostrada) y Hap (J), que se unen al dominio de la ATPasa Hsc70, también inhiben la unión de Hsp70 al sustrato proteico no plegado in vitro, lo que sugiere que estas proteínas pueden desempeñar un papel en el mantenimiento de control de calidad dirigiendo interacciones no productivas hacia la degradación 250 (ilustración proporcionada amablemente por LE Hightower, Universidad de Connecticut, Storrs).

Tabla 1. Principales clases de PAS en biología cardiovascular

mHsp75 indica Hsp75 HIF-1 mitocondrial, factor de transcripción 1 inducible por hipoxia y MKBP, proteína quinasa de distrofia miotónica.

El Dr. Benjamin recibió el apoyo de la Fundación Estadounidense para la Investigación Médica, los Institutos Nacionales de Salud y un Premio al Investigador Establecido de la Asociación Estadounidense del Corazón. Agradecemos a R. S. Williams, R. Meidell, A. Davis, P. Thomas y R. Sohal por sus comentarios críticos sobre nuestro manuscrito.


Publicaciones

Los últimos años han visto una mejora espectacular en la metodología de diseño de proteínas. Sin embargo, la mayoría de los métodos exigen la intervención de expertos, lo que limita su adopción generalizada. Por el contrario, el algoritmo PROSS para mejorar la estabilidad de las proteínas y los niveles de expresión heteróloga se ha aplicado con éxito a una variedad de enzimas desafiantes y proteínas de unión. Aquí, comparamos la aplicación de PROSS como una herramienta independiente para los científicos de proteínas con poca o ninguna experiencia en modelado. Doce laboratorios de la Asociación de Producción y Purificación de Proteínas en Europa (P4EU) desafiaron el algoritmo PROSS con 14 dianas proteicas no relacionadas sin el apoyo de los desarrolladores de PROSS. Para cada objetivo, se evaluaron hasta seis diseños para los niveles de expresión y, en algunos casos, para la estabilidad térmica y la actividad. En nueve objetivos, los diseños mostraron niveles de expresión heterólogos aumentados en sistemas de expresión procariotas y / o eucariotas en condiciones experimentales que se adaptaron a cada proteína diana. Además, observamos una mayor estabilidad térmica en nueve de diez objetivos probados. En dos ejemplos principales, el factor de células madre humanas (hSCF) y el dominio similar a la cadherina humana (CLD12) del receptor RET, las proteínas de tipo salvaje no se podían expresar como proteínas solubles en E. coli, sin embargo, los diseños PROSS mostraron altos niveles de expresión. en células de E. coli y HEK293, respectivamente, y estabilidad térmica mejorada. Llegamos a la conclusión de que PROSS puede mejorar la estabilidad y la expresibilidad en diversos casos, y que la mejora normalmente requiere condiciones de expresión específicas del objetivo. Este estudio demuestra las fortalezas de los esfuerzos de toda la comunidad para probar la generalidad de nuevos métodos y recomienda áreas de investigación futura para avanzar en algoritmos prácticamente útiles para la ciencia de las proteínas.

Los sitios funcionales de muchas familias de proteínas están dominados por diversas regiones de la columna vertebral que carecen de estructura secundaria (bucles) pero se pliegan de manera estable en su estado funcionalmente competente. Sin embargo, el diseño de regiones de bucle estructurado desde cero, especialmente en sitios funcionales, ha encontrado grandes dificultades. Por lo tanto, desarrollamos un enfoque, llamado AbDesign, para explotar la modularidad natural de muchas familias de proteínas y ensamblar computacionalmente una gran cantidad de nuevos esqueletos mediante la combinación de fragmentos modulares de origen natural. Esta estrategia produjo proteínas grandes, atómicamente precisas y altamente eficientes, incluidos anticuerpos y enzimas que exhibían docenas de mutaciones de cualquier proteína natural. El espacio combinatorio de conformación de la columna vertebral al que puede acceder AbDesign incluso para una familia de homólogos de tamaño modesto puede exceder la diversidad en todo el PDB, proporcionando el nivel de control sub ‐ Ångstrom sobre el posicionamiento de los grupos de sitios activos que es necesario para obtener proteínas muy activas. Este manuscrito describe cómo implementar la canalización utilizando código que está disponible gratuitamente en https://github.com/Fleishman-Lab/AbDesign_for_enzymes.

Nuestra capacidad para diseñar actividades biomoleculares nuevas o mejoradas depende de la comprensión de las relaciones secuencia-función en las proteínas. Sin embargo, el gran tamaño y la complejidad de la mayoría de las proteínas oscurecen estas relaciones, y los métodos de optimización de proteínas continúan dependiendo de laboriosas iteraciones experimentales. Recientemente, una comprensión más profunda de las funciones de los efectos del umbral de estabilidad y la epistasis biomolecular en las proteínas ha llevado al desarrollo de métodos híbridos que combinan el análisis filogenético con cálculos de diseño atomístico. Estos métodos permiten una optimización confiable e incluso en un solo paso de la estabilidad, expresibilidad y actividad de proteínas en proteínas que se consideraron fuera del alcance del diseño computacional. Además, la reconstrucción de secuencias ancestrales proporciona información sobre los eslabones perdidos en la evolución de enzimas y aglutinantes que pueden utilizarse en el diseño de proteínas. A través de la combinación de cálculos filogenéticos y atomísticos, el objetivo de larga data de los métodos computacionales generales que se pueden aplicar universalmente para estudiar y optimizar proteínas finalmente parece estar al alcance.

Muchos patógenos humanos utilizan receptores de la superficie de la célula huésped para unirse e invadir las células. A menudo, la afinidad de interacción huésped-patógeno es baja, lo que presenta oportunidades para bloquear la invasión utilizando un imitador soluble de alta afinidad de la proteína huésped. El homólogo 5 de la proteína de unión a reticulocitos de Plasmodium falciparum (RH5) proporciona un candidato interesante para el mimetismo: está altamente conservado y su afinidad moderada se une al receptor humano basigin (K
D ≥ 1 μM) es un paso esencial en la invasión de eritrocitos por este parásito de la malaria. Usamos un escaneo mutacional profundo de un fragmento soluble de basigin humano para caracterizar sistemáticamente mutaciones puntuales que mejoran la afinidad de basigin por RH5 y luego usamos Rosetta para diseñar una variante dentro del espacio de secuencia de mutaciones que mejoran la afinidad. El diseño resultante de siete mutaciones exhibió una afinidad 1900 veces mayor (K
D aproximadamente 1 nM) para RH5 con una velocidad de enlace muy lenta (0,23 h
-1) y redujo la concentración inhibidora del crecimiento de Plasmodium eficaz en al menos 10 veces en comparación con la basigina humana. El diseño proporciona un punto de partida favorable para la ingeniería de mejoras continuas que probablemente sean esenciales para alcanzar una inhibición del crecimiento terapéuticamente eficaz.

Se plantea la hipótesis de que la estabilización de la glicoproteína de la envuelta metaestable (Env) del VIH-1 mejora la inducción de anticuerpos ampliamente neutralizantes. Mejoramos el rendimiento de expresión y la estabilidad de la glicoproteína de la envoltura del VIH-1 BG505SOSIP.664 gp140 mediante una secuencia automatizada descrita anteriormente y un enfoque de termoestabilización computacional guiada por la estructura, PROSS. Esto combina la información de conservación de la secuencia con la evaluación computacional de la estabilización de mutantes, aprovechando así la amplia variación de la secuencia natural presente en la Env del VIH-1. PROSS se utiliza para diseñar tres variantes de gp140 con 17-45 mutaciones en relación con la construcción parental. Se ha observado experimentalmente que uno de los diseños tiene una mejora de cuatro veces en el rendimiento y un incremento de 4 ° C en la termoestabilidad. Además, los inmunógenos diseñados tienen perfiles de antigenicidad similares a la versión de enlazador flexible nativo del tipo salvaje, BG505SOSIP.664 gp140 (NFL Wt) a los principales epítopos dirigidos por anticuerpos ampliamente neutralizantes. PROSS elimina el laborioso proceso de selección de muchas variantes para determinar la estabilidad y la funcionalidad, proporcionando una prueba del principio del método para la estabilización y mejora del rendimiento sin comprometer la antigenicidad de los candidatos a vacunas complejas y altamente glicosiladas de próxima generación.

Los anticuerpos desarrollados para la investigación y las aplicaciones clínicas pueden presentar una estabilidad, expresibilidad o afinidad subóptimas. Las estrategias de optimización existentes se centran en mutaciones superficiales, mientras que la maduración por afinidad natural también introduce mutaciones en el núcleo del anticuerpo, mejorando simultáneamente la estabilidad y la afinidad. Para mapear sistemáticamente la tolerancia mutacional de un fragmento variable de anticuerpo (Fv), realizamos una exhibición de levadura y aplicamos un escaneo mutacional profundo a un anticuerpo anti-lisozima y encontramos que muchas de las mutaciones potenciadoras de la afinidad se agrupaban en la interfaz de cadena ligera-pesada variable, dentro del núcleo del anticuerpo. El diseño de Rosetta combinó mutaciones potenciadoras, produciendo una variante con una afinidad diez veces mayor y una estabilidad sustancialmente mejorada. Para que este enfoque sea ampliamente accesible, desarrollamos AbLIFT, un servidor web automatizado que diseña mutaciones centrales multipunto para mejorar los contactos entre cadenas ligeras y pesadas de Fv específicas (http://AbLIFT.weizmann.ac.il). Aplicamos AbLIFT a dos anticuerpos no relacionados dirigidos a los antígenos humanos VEGF y QSOX1. Sorprendentemente, los diseños mejoraron la estabilidad, la afinidad y los rendimientos de expresión. Los resultados proporcionan una prueba de principio para eludir los laboriosos ciclos de ingeniería de anticuerpos a través del diseño automatizado de estabilidad y afinidad computacional.

El diseño de proteínas de membrana es un área de investigación emocionante y cada vez más exitosa que ha llevado a hitos que incluyen el diseño de proteínas integrales de membrana estables y precisas basadas en motivos de espirales enrolladas. Sin embargo, el diseño de proteínas topológicamente más complejas, como la mayoría de los receptores, canales y transportadores, exige una función energética que equilibre las contribuciones de los contactos intraproteicos y las interacciones proteína-membrana. Los avances recientes en las funciones de energía de todos los átomos solubles en agua han aumentado la precisión en los puntos de referencia de predicción de estructuras. Sin embargo, la membrana plasmática impone diferentes limitaciones físicas a la solvatación de proteínas. Para comprender estas limitaciones, recientemente desarrollamos una pantalla experimental de alto rendimiento, llamada dsTβL, e inferimos energías de inserción aparentes para cada aminoácido en docenas de posiciones a través de la membrana plasmática bacteriana. Aquí, expresamos estos perfiles como términos de energía de lipofilia en Rosetta y demostramos que la nueva función de energía supera a las anteriores en los puntos de referencia de modelado y diseño. Las simulaciones de Rosetta ab initio a partir de una cadena extendida recapitulan dos tercios de las estructuras determinadas experimentalmente de homooligómeros que atraviesan la membrana con una desviación de la raíz cuadrada media de & lt2.5Å dentro de los cinco modelos predichos superiores (disponible en línea: http: // tmhop.weizmann.ac.il). Además, en dos puntos de referencia de diseño de secuencia, la función de energía mejora la discriminación de mutaciones puntuales estabilizadoras y recapitula secuencias naturales de proteína de membrana de estructura conocida, recomendando así esta nueva función de energía para el modelado y diseño de proteína de membrana.

Los métodos para la predicción de la estructura de anticuerpos se basan en la homología de secuencia con estructuras determinadas experimentalmente. Los modelos resultantes pueden ser precisos, pero a menudo están sometidos a tensión estereoquímica, lo que limita su utilidad en los flujos de trabajo de modelado y diseño. Presentamos el servidor web AbPredict 2, que en lugar de utilizar la homología de secuencia, realiza una búsqueda basada en Monte Carlo de combinaciones de baja energía de conformaciones de la columna vertebral para producir estructuras de anticuerpos precisas y sin tensiones.

El plegamiento de las proteínas a su conformación funcional es primordial para la vida. Aunque el 75% del proteoma consiste en proteínas de múltiples dominios, nuestro conocimiento del plegamiento se ha basado principalmente en estudios realizados en proteínas de un solo dominio y de plegado rápido. No obstante, la complejidad de los paisajes de plegamiento exhibidos por proteínas multidominio ha recibido un mayor escrutinio en los últimos años. Estudiamos la proteína adenilato quinasa de tres dominios de E. coli (AK), que se ha demostrado que se pliega a través de una serie de vías que involucran varios estados intermedios. Utilizamos el método de diseño de proteínas para manipular el panorama de plegamiento de AK y la espectroscopia FRET de molécula única para estudiar los efectos sobre el proceso de plegado. Se ha encontrado que las mutaciones introducidas en el dominio de unión a NMP (NMPbind) de la proteína tienen efectos inesperados en el panorama de plegamiento. Por tanto, mientras que las mutaciones estabilizadoras en el núcleo del dominio NMPbind retienen las principales vías de plegamiento de la AK de tipo salvaje, una mutación desestabilizadora en la interfaz entre los dominios NMPbind y CORE provoca un reparto significativo del flujo entre las vías de plegado. Nuestros resultados demuestran la plasticidad sobresaliente del paisaje de plegamiento de AK y revelan cómo mutaciones específicas en la estructura primaria se traducen en cambios en la dinámica de plegado. La combinación de metodologías introducidas en este trabajo debería resultar útil para profundizar nuestra comprensión del proceso de plegamiento de proteínas multidominio.

La caracterización de las proteínas sobreexpresadas es esencial para evaluar su calidad y proporcionar información para el rediseño y la optimización iterativos. Este proceso generalmente se lleva a cabo siguiendo procedimientos de purificación que requieren un costo considerable de tiempo y mano de obra. Por lo tanto, la evaluación de la calidad de las proteínas recombinantes sin purificación previa ofrece una gran ventaja.Aquí, presentamos un método de espectrometría de masas nativa que permite la caracterización de proteínas sobreproducidas directamente de los medios de cultivo. Propiedades como solubilidad, peso molecular, plegamiento, estado de ensamblaje, estructura general, modificaciones postraduccionales y unión a biomoléculas relevantes se revelan de inmediato. Mostramos la aplicabilidad del método para la caracterización en profundidad de proteínas recombinantes secretadas de sistemas eucariotas como levaduras, insectos y células humanas. Este método, que puede extenderse fácilmente al análisis de alto rendimiento, acorta considerablemente el intervalo de tiempo entre la producción y la caracterización de proteínas, y es particularmente adecuado para caracterizar proteínas modificadas y mutadas, y optimizar el rendimiento y la calidad de las proteínas sobreexpresadas.

Las redes de proteínas en todos los organismos comprenden pares homólogos que interactúan. En estas redes, algunas proteínas son específicas e interactúan con uno o unos pocos compañeros de unión, mientras que otras son multiespecíficas y se unen a una variedad de objetivos. Describimos un algoritmo que parte de un par que interactúa y diseña docenas de nuevos pares con diversas conformaciones de la columna vertebral en el sitio de unión, así como nuevas orientaciones y secuencias de unión. Aplicado a un par de bacterias de alta afinidad, el algoritmo da como resultado 18 nuevas, con afinidades afines de pico a micromolar. Tres pares exhiben 3-5 órdenes de cambio de magnitud en la especificidad en relación con el tipo salvaje, mientras que otros son multiespecíficos, formando colectivamente una red de interacción de proteínas. El análisis cristalográfico confirma la precisión del diseño, incluso en nuevas redes troncales e interacciones polares. Las redes de interacción polar preorganizadas son responsables de una alta especificidad, definiendo así principios de diseño que se pueden aplicar para programar redes de interacción celular sintéticas de la afinidad y especificidad deseadas.

La fotorrespiración recicla el producto de oxigenación ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa / oxigenasa (Rubisco), 2-fosfoglicolato, de vuelta al ciclo de Calvin. La fotorrespiración natural, sin embargo, limita la productividad agrícola al disipar energía y liberar CO2. Anteriormente se sugirieron varias derivaciones de la fotorrespiración, pero se limitaron a las enzimas y vías existentes que liberan CO2. Aquí, aprovechamos el poder de la ingeniería enzimática y metabólica para establecer rutas sintéticas que eviten la fotorrespiración sin liberación de CO2. Al definir reglas de reacción específicas, identificamos sistemáticamente rutas prometedoras que asimilan el 2-fosfoglicolato en el ciclo de Calvin sin pérdida de carbono. Además, desarrollamos un modelo cinético-estequiométrico que indica que las derivaciones sintéticas identificadas podrían mejorar potencialmente la tasa de fijación de carbono en el rango fisiológico de irradiación y CO2, incluso si la mayoría de sus enzimas operan a una décima parte de la actividad de carboxilación máxima de Rubisco. La reducción de glicolato a glicolaldehído es esencial para varias de las derivaciones sintéticas, pero no se sabe que ocurra de forma natural. Por lo tanto, utilizamos el diseño computacional y la evolución dirigida para establecer esta actividad en dos reacciones secuenciales. Se diseñó una acetil-CoA sintetasa para una mayor estabilidad y síntesis de glicolil-CoA. Se diseñó una propionil-CoA reductasa para una mayor selectividad por glicolil-CoA y para el uso de NADPH sobre NAD (+), favoreciendo así la reducción sobre la oxidación. El módulo de reducción de glicolato diseñado se combinó luego con la condensación aguas abajo y la asimilación de glicolaldehído a ribulosa 1,5-bisfosfato, proporcionando así una prueba de principio para una vía de fotorrespiración que conserva el carbono.

Las mejoras sustanciales en la actividad enzimática exigen múltiples mutaciones en posiciones espacialmente proximales en el sitio activo. Sin embargo, tales mutaciones exhiben a menudo efectos epistáticos (no aditivos) impredecibles sobre la actividad. Aquí describimos FuncLib, un método automatizado para diseñar mutaciones multipunto en sitios activos de enzimas utilizando análisis filogenético y cálculos de diseño de Rosetta. Aplicamos FuncLib a dos enzimas no relacionadas, una fosfotriesterasa y una acetil-CoA sintetasa. Todos los diseños eran activos y la mayoría mostraba perfiles de actividad que diferían significativamente del tipo salvaje y entre sí. Varias docenas de diseños con sólo 3-6 mutaciones en el sitio activo exhibieron eficiencias de 10 a 4000 veces más altas con una variedad de sustratos alternativos, incluida la hidrólisis de los agentes nerviosos organofosforados tóxicos somán y ciclosarina y la síntesis de butiril-CoA. FuncLib se implementa como un servidor web (http://FuncLib.weizmann.ac.il) que elude pantallas experimentales iterativas de alto rendimiento y abre el camino para diseñar repertorios catalíticos altamente eficientes y diversos.

Un método poderoso para determinar el acoplamiento energético entre aminoácidos es el análisis de doble ciclo mutante. En este método, se mutan dos residuos por separado y en combinación y se determinan los efectos energéticos de las mutaciones. Una desviación del efecto de la doble mutación de la suma de los efectos de las mutaciones individuales indica que los dos residuos interactúan directa o indirectamente. Aquí, mostramos que el análisis de doble ciclo mutante por espectrometría de masas nativa puede llevarse a cabo para interacciones en extractos de células crudas de Escherichia coli, obviando así la necesidad de purificación de proteínas y generando isotermas de unión. Nuestros resultados indican que las fuerzas de los enlaces de hidrógeno intermoleculares no se ven afectadas por las condiciones de más hacinamiento en los lisados ​​celulares.

Los anticuerpos monoclonales anti-carbohidratos (mAb) son muy prometedores como terapias y diagnósticos del cáncer. Sin embargo, su especificidad se puede mezclar y la caracterización detallada es problemática, porque los complejos de anticuerpo-glucano son difíciles de cristalizar. Aquí, desarrollamos un enfoque generalizable que emplea técnicas de alto rendimiento para caracterizar la estructura y especificidad de tales mAb, y lo aplicamos al mAb TKH2 desarrollado contra el antígeno de carbohidrato asociado a tumores sialil-Tn (STn). La especificidad del mAb se definió mediante los valores de KD aparentes determinados mediante el cribado cuantitativo de micromatrices de glucanos. Los residuos clave en el sitio de combinación del anticuerpo se identificaron mediante mutagénesis dirigida al sitio, y la superficie de contacto glicano-antígeno se definió usando RMN de diferencia de transferencia de saturación (STD-NMR). Estas características se emplearon luego como métricas para seleccionar el modelo 3D óptimo del complejo anticuerpo-glucano, entre miles de opciones plausibles generadas por el acoplamiento automatizado y la simulación de dinámica molecular. La especificidad de STn se validó adicionalmente mediante el cribado computacional del modelo 3D del anticuerpo seleccionado frente a la sialil-Tn-glicoma humana. Este enfoque experimental computacional permitiría el diseño racional de potentes anticuerpos dirigidos a los carbohidratos.

El diseño automatizado de enzimas con propiedades catalíticas de tipo salvaje ha sido un objetivo de larga data pero difícil de alcanzar. A continuación, presentamos un método general y automatizado para el diseño de enzimas mediante el ensamblaje combinatorio de la columna vertebral. A partir de un conjunto de estructuras enzimáticas homólogas pero estructuralmente diversas, el método ensambla nuevas combinaciones de esqueletos y utiliza Rosetta para optimizar la secuencia de aminoácidos, al tiempo que conserva residuos catalíticos clave. Aplicamos este método a dos familias de enzimas no relacionadas con pliegues TIM-barril, xilanasas de glucósido hidrolasa 10 (GH10) y lactonasas similares a fosfotriesterasas (PLL), diseñando 43 y 34 proteínas, respectivamente. Hay 21 diseños GH10 y siete PLL activos, incluidos diseños derivados de plantillas con & lt25% de identidad de secuencia. Además, cuatro diseños son tan activos como las enzimas naturales en estas familias. La precisión atómica en un diseño de GH10 de alta actividad se confirma aún más mediante análisis cristalográfico. Por tanto, el ensamblaje y diseño combinatorio del esqueleto pueden usarse para generar enzimas estables, activas y estructuralmente diversas con selectividad o actividad alterada.

Las proteínas se utilizan cada vez más en la investigación biomédica básica y aplicada. Sin embargo, muchas proteínas son solo marginalmente estables y pueden expresarse en cantidades limitadas, lo que dificulta la investigación y las aplicaciones. La investigación ha revelado los principios y mecanismos termodinámicos, celulares y evolutivos que subyacen a la estabilidad marginal. Con esta comprensión cada vez mayor, los métodos de diseño de estabilidad computacional han avanzado en las últimas dos décadas a partir de métodos que abordaron selectivamente solo algunos aspectos de la estabilidad marginal. Los métodos actuales son más generales y, al combinar el análisis filogenético con el diseño atomístico, han mostrado mejoras drásticas en la solubilidad, estabilidad térmica y resistencia a la agregación mientras se mantiene la actividad molecular primaria de la proteína. El diseño de estabilidad está abriendo el camino a la ingeniería racional de enzimas, terapias y vacunas mejoradas y a la aplicación de la metodología de diseño de proteínas a proteínas grandes y actividades moleculares que han demostrado ser un desafío en el pasado.

El sistema de chaperonina GroE en Escherichia coli comprende GroEL y GroES y facilita el plegamiento de proteínas dependiente de ATP in vivo e in vitro. Las proteínas con secuencias y estructuras muy similares pueden diferir en su dependencia de GroEL para un plegado eficaz. Una fuente potencial pero no verificada de dependencia de GroEL es la frustración, en la que no todas las interacciones en el estado nativo se optimizan energéticamente, lo que potencia el plegado lento y el plegado incorrecto. Aquí, elegimos una proteína fluorescente verde mejorada como sistema modelo y la sometimos a mutagénesis aleatoria, seguida de un cribado de variantes cuyo plegamiento in vivo muestra una mayor o menor dependencia de GroEL. Confirmamos la dependencia GroEL alterada de estas variantes con ensayos de plegamiento in vitro. Sorprendentemente, se encontró que las mutaciones en posiciones que se predice que serían altamente frustradas se correlacionaban con una menor dependencia de GroEL. Por el contrario, se encontró que las mutaciones en posiciones con baja frustración se correlacionan con una mayor dependencia de GroEL. Se obtuvo más apoyo para este hallazgo al mostrar que el plegamiento de una variante de proteína fluorescente verde mejorada diseñada computacionalmente para reducir la frustración es, de hecho, menos dependiente de GroEL. Nuestros resultados indican que los cambios en la frustración local también afectan la partición in vivo entre el plegamiento espontáneo y mediado por chaperonina. Por tanto, el diseño de secuencias mínimamente frustradas puede reducir la dependencia de la chaperonina y mejorar los niveles de expresión de proteínas.

Las proteínas naturales deben plegarse en una conformación estable y ejercer su función molecular. Hasta la fecha, el diseño computacional ha producido con éxito proteínas estables y atómicamente precisas utilizando los llamados pliegues "ideales" ricos en estructuras secundarias regulares y casi desprovistos de bucles y elementos desestabilizadores, como cavidades. Sin embargo, la función molecular, como la unión y la catálisis, a menudo exige características no ideales, incluidos bucles grandes e irregulares y redes de interacción polar enterradas, que siguen siendo un desafío para el diseño de pliegues. A través de cinco ciclos de diseño / experimento, aprendimos los principios para diseñar fragmentos variables de anticuerpos (Fvs) estables y funcionales. Específicamente, (i) usamos restricciones de diseño de secuencia derivadas de alineamientos de secuencia múltiple de anticuerpos, y (ii) durante el diseño de la columna vertebral, mantuvimos las interacciones estabilizadoras observadas en los anticuerpos naturales entre el marco y los bucles de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) 1 y 2 Los Fv diseñados unieron sus ligandos con afinidades midnanomolares y eran tan estables como los anticuerpos naturales, a pesar de tener mutaciones & gt30 de líneas germinales de anticuerpos de mamíferos. Además, el análisis cristalográfico demostró precisión atómica en todo el marco y en cuatro de seis CDR en un diseño y precisión atómica en todo el Fv en otro. Los principios que aprendimos son generales y se pueden implementar para diseñar otros pliegues no ideales, generando anticuerpos y enzimas estables, específicos y precisos.

Si bien se introdujeron potentes anticuerpos monoclonales contra la ricina a lo largo de los años, la cuestión de si el aumento de la afinidad del anticuerpo permite una mejor neutralización de la toxina aún no se ha abordado por completo. El objetivo de este estudio fue caracterizar la contribución de la afinidad del anticuerpo al potencial de neutralización de la ricina del anticuerpo. Se aisló el anticuerpo monoclonal cHD23 que se dirige a la subunidad B de la toxina e interfiere con su unión a los receptores membranales. Con el fin de crear clones de anticuerpos con una afinidad mejorada hacia la ricina, se construyó una biblioteca de presentación de fagos scFv que contenía versiones mutadas de las regiones variables de cHD23 y se aislaron los clones con unión mejorada de ricina. El modelado estructural de estos mutantes sugiere que las mutaciones insertadas pueden aumentar la flexibilidad conformacional del anticuerpo mejorando así su capacidad para unirse a ricina. Si bien se encontró que los clones seleccionados exhibían una mejor neutralización de la ricina, la correlación entre los valores K-D y la potencia fue solo menor (r = 0,55). Sin embargo, existe una correlación positiva (r = 0,84) entre los valores fuera de velocidad (k (apagado)) de los clones maduros por afinidad y su capacidad para neutralizar la ricina. Como las membranas celulares muestran cantidades desmesuradamente grandes de sitios potenciales de unión a la superficie para la ricina, se sugiere que los anticuerpos con valores mejorados de velocidad bloquean la capacidad de la toxina para unirse a los receptores diana, de una manera altamente eficiente. Actualmente, la terapia basada en anticuerpos es el tratamiento más eficaz para la intoxicación por ricina y se prevé que los hallazgos de este estudio proporcionarán información útil y una posible estrategia para diseñar una terapia basada en anticuerpos mejorada para la toxina.

La regulación alostérica es la base de la capacidad de las células vivas para detectar cambios en las concentraciones de nutrientes y moléculas de señalización, pero la capacidad de diseñar computacionalmente la regulación alostérica en proteínas no alostéricas ha sido difícil de alcanzar. El diseño del sitio alostérico se complica por el requisito de codificar las estabilidades relativas de las conformaciones activas e inactivas de la misma proteína en presencia y ausencia tanto del ligando como del efector. Para abordar este desafío, utilizamos Rosetta para diseñar la columna vertebral de la región 3 que determina la complementariedad de la cadena pesada flexible (HCDR3), y usamos la optimización de secuencia y coincidencia geométrica para colocar un sitio de coordinación de Zn2 + en un anticuerpo de unión a fluoresceína. Predijimos que debido a la flexibilidad de HCDR3, el bolsillo de unión a fluoresceína se configuraría correctamente solo con la aplicación de Zn2 +. Descubrimos que la regulación por Zn2 + era reversible y sensible a la identidad del ión divalente, y tenía el costo de reducir la estabilidad del anticuerpo y la afinidad de unión a la fluoresceína. La fluoresceína se unió a un orden de magnitud mayor de afinidad en presencia de Zn2 + que en su ausencia, y el aumento de la afinidad de la fluoresceína se debió casi por completo a una velocidad de activación de la fluoresceína más rápida, lo que sugiere que Zn2 + preorganizó el anticuerpo para la unión de la fluoresceína. El análisis de mutaciones demostró la extrema sensibilidad de la regulación de Zn2 + en los detalles atómicos en y alrededor del sitio de coordinación de metales. El anticuerpo diseñado podría servir para estudiar cómo la regulación alostérica evolucionó a partir de proteínas de unión no alostéricas y sugiere una forma de diseñar sensores moleculares para objetivos ambientales y biomédicos.

Mejorar la eficacia catalítica inicialmente baja de una enzima con un nuevo sustrato diana en un orden de magnitud o dos puede requerir solo unas pocas rondas de mutagénesis y cribado o selección. Sin embargo, las rondas posteriores de optimización tienden a producir grados decrecientes de mejora (rendimientos decrecientes) que eventualmente conducen a una meseta de optimización. Nuestro objetivo era optimizar la eficacia catalítica de la fosfotriesterasa bacteriana (PTE) hacia los agentes nerviosos de tipo V. Anteriormente, mejoramos la eficiencia catalítica de la PTE de tipo salvaje hacia el agente nervioso VX en 500 veces, hasta una eficiencia catalítica (k (cat) / KM) de 5 x 10 (6) M (-1) min (-1 ). Sin embargo, la desintoxicación in vivo eficaz exige una enzima con una eficacia catalítica de & gt 10 (7) M-1 min (-1). Aquí, después de ocho rondas adicionales de evolución dirigida y el diseño computacional de una variante estabilizada, desarrollamos variantes de PTE que desintoxican VX con ak (cat) / KM & gt = 5 x 10 (7) M (-1) min (-1) y ruso VX (RVX) con ak (cat) / KM & gt = 10 (7) M-1 min (-1). Estas últimas mejoras de 10 veces fueron las que consumieron más tiempo y fueron las más laboriosas, ya que la mayoría de las bibliotecas arrojaron mejoras menores o ninguna. Estabilizar la enzima en evolución y evitar las compensaciones en la actividad con diferentes sustratos, nos permitió obtener mejoras adicionales más allá de la meseta de optimización y desarrollar variantes de PTE que en general se mejoraron en & gt 5000 veces con VX y en & gt 17000 veces con RVX. Las variantes resultantes también hidrolizan agentes nerviosos de tipo G con alta eficiencia (GA, GB at k (cat) / KM & gt 5 x 10 (7) M-1 min (-1)) y, por lo tanto, pueden servir como candidatos para nervios de amplio espectro. profilaxis con agentes y terapia posterior a la exposición utilizando dosis bajas de enzimas.

El reempaquetado de núcleos de proteínas es una prueba estándar del software de modelado de proteínas. Un estudio reciente de seis paquetes de software de modelado diferentes mostró que tienen más éxito en predecir las conformaciones de la cadena lateral del núcleo en comparación con los residuos de la superficie. Todo el software de modelado probado tiene funciones de energía multicomponente, que generalmente incluyen contribuciones de solvatación, electrostática, enlaces de hidrógeno e interacciones de Lennard-Jones, además de términos estadísticos basados ​​en estructuras de proteínas observadas. Investigamos hasta qué punto una función de energía simplificada que incluye solo restricciones estereoquímicas e interacciones repulsivas de esfera dura puede reempaquetar correctamente los núcleos de proteínas. Para el reenvasado colectivo y de residuo único, el modelo de esfera dura recapitula con precisión las conformaciones de cadena lateral observadas para Ile, Leu, Phe, Thr, Trp, Tyr y Val. Este resultado muestra que no hay conformaciones de cadena lateral alternativas, permitidas estéricamente, de residuos centrales. El análisis del mismo conjunto de núcleos de proteínas utilizando el paquete de software Rosetta reveló que el modelo de esfera dura y Rosetta se desempeñan igualmente bien en Ile, Leu, Phe, Thr y Val, el modelo de esfera dura se desempeña mejor en Trp y Tyr y Rosetta se desempeña mejor en Ser. Concluimos que la alta precisión de predicción en núcleos de proteínas obtenida por el software de modelado de proteínas y nuestro enfoque simplificado de esfera dura refleja la alta densidad de núcleos de proteínas y el dominio de la repulsión estérica.

Muchas vacunas candidatas prometedoras de virus, bacterias y parásitos patógenos son inestables y no pueden producirse a bajo precio para uso clínico. Por ejemplo, el homólogo 5 de la proteína de unión a reticulocitos de Plasmodium falciparum (PfRH5) es esencial para la invasión de eritrocitos, está altamente conservado entre los aislados de campo y provoca anticuerpos que neutralizan in vitro y protegen en un modelo animal, lo que lo convierte en un candidato líder para la vacuna contra la malaria.Sin embargo, el RH5 funcional solo se puede expresar en sistemas eucariotas y exhibe una tolerancia moderada a la temperatura, lo que limita su utilidad en países cálidos y de bajos ingresos donde prevalece la malaria. Los enfoques actuales para la estabilización de inmunógenos implican la aplicación iterativa de un diseño racional o semirracional, mutagénesis aleatoria y caracterización bioquímica. Normalmente, cada ronda de optimización produce una mejora menor en la estabilidad y se requieren múltiples rondas. Por el contrario, desarrollamos una estrategia de diseño de una sola etapa utilizando análisis filogenético y cálculos atomísticos de Rosetta para diseñar variantes de PfRH5 con mejor empaquetado y polaridad de la superficie. Para demostrar la solidez de este enfoque, probamos tres diseños de PfRH5, todos los cuales mostraron una estabilidad mejorada en relación con el tipo salvaje. El mejor, con 18 mutaciones en relación con PfRH5, expresado en forma plegada en bacterias a & gt1 mg de proteína por L de cultivo, y tenía una tolerancia térmica 10-15 grados C más alta que el tipo salvaje, al tiempo que conservaba la unión de ligando y las propiedades inmunogénicas indistinguibles. de tipo salvaje, demostrando su valor como inmunógeno para una futura generación de vacunas contra la etapa sanguínea de la malaria. Prevemos que esta eficiente metodología de diseño de estabilidad computacional también se utilizará para mejorar las propiedades biofísicas de otras vacunas candidatas recalcitrantes de patógenos emergentes.

Los métodos actuales para la predicción de la estructura de anticuerpos se basan en la homología de secuencia con estructuras conocidas. Aunque esta estrategia a menudo produce predicciones precisas, los modelos pueden someterse a tensión estereoquímica. Aquí, presentamos un algoritmo totalmente automatizado, llamado AbPredict, que ignora la homología de secuencia y, en su lugar, utiliza una búsqueda de Monte Carlo para conformaciones de baja energía construidas a partir de segmentos de columna vertebral y orientaciones de cuerpo rígido que aparecen en estructuras moleculares de anticuerpos. Encontramos casos en los que AbPredict selecciona plantillas de bucle precisas con una identidad de secuencia tan baja como 10%, mientras que la plantilla de identidad de secuencia más alta diverge sustancialmente de la conformación de la consulta. En consecuencia, en varios casos informados en el reciente punto de referencia Antibody Modeling Assessment, los modelos AbPredict fueron más precisos que los de cualquier participante, y la calidad estereoquímica de los modelos fue consistentemente alta. Además, en dos casos ciegos que nos proporcionaron los cristalógrafos antes de la determinación de la estructura, el método logró una precisión global de la columna vertebral de & lt1,5 Ångstrom. El modelado preciso de las estructuras de anticuerpos no tensados ​​permitirá el diseño y la ingeniería de aglutinantes mejorados para la investigación biomédica directamente a partir de la secuencia.

La energía de las interacciones membrana-proteína determina la topología y estructura de la proteína: la hidrofobicidad impulsa la inserción de segmentos helicoidales en la membrana y las cargas positivas orientan la proteína con respecto al plano de la membrana de acuerdo con la regla del interior positivo. Sin embargo, hasta hace poco tiempo, la cuantificación de estas contribuciones resultaba difícil, lo que impedía el análisis sistemático de la base energética de la topología de proteínas de membrana. Recientemente desarrollamos el método dsT beta L, que utiliza secuenciación profunda y selección in vitro de segmentos insertados en la membrana plasmática bacteriana para inferir perfiles de energía de inserción para cada residuo de aminoácido a través de la membrana, y cuantificamos la contribución de inserción de la hidrofobicidad y el positivo. -regla interior. Aquí, presentamos un algoritmo de predicción de topología llamado TopGraph, que se basa en una búsqueda de secuencia de energía de inserción mínima de dsT beta L. Mientras que la energía de inserción promedio asignada por escalas experimentales anteriores fue positiva (desfavorable), la media asignada por TopGraph en un conjunto no redundante es -6,9 kcal / mol. Al cuantificar las contribuciones tanto de la hidrofobicidad como de la regla del interior positivo, encontramos además que en aproximadamente la mitad de las proteínas de membrana grandes se insertan segmentos polares en la membrana para colocar cargas más positivas en el citoplasma, lo que sugiere una interacción entre estas dos contribuciones de energía. Debido a que los residuos polares incrustados en la membrana son cruciales para la unión del sustrato y el cambio conformacional, los resultados implican la regla del interior positivo en la determinación de las arquitecturas de los sitios funcionales de la proteína de la membrana. Esta información puede ayudar a la predicción de la estructura, la ingeniería y el diseño de proteínas de membrana. TopGraph está disponible en línea (topgraph.weizmann.ac.il).

Los ingenieros de proteínas somos ambivalentes acerca de la evolución: por un lado, la evolución nos inspira con innumerables ejemplos de aglutinantes, sensores y catalizadores biomoleculares, por otro lado, estos ejemplos rara vez se adaptan bien a las tareas de ingeniería que tenemos en mente. Por lo tanto, los ingenieros de proteínas han modificado las proteínas naturales mediante sustituciones puntuales e intercambios de fragmentos en un esfuerzo por generar nuevas funciones. Un contrapunto a tales esfuerzos de diseño, que se están llevando a cabo ahora con mayor éxito, es evitar por completo los materiales de partida proporcionados por la naturaleza y diseñar nuevas funciones de proteínas desde cero mediante el uso de modelos y diseños moleculares de novo. Si bien se han logrado avances importantes en ambas direcciones, algunas áreas del diseño de proteínas aún están fuera de su alcance. Con este fin, abogamos por una síntesis de estas dos estrategias: mediante el uso de cálculos de diseño para recombinar y optimizar fragmentos de proteínas naturales, podemos construir estructuras estables y aún sin muestrear, otorgando así acceso a un repertorio ampliado de conformaciones y funciones deseadas. Proponemos que los métodos futuros que combinen el análisis filogenético, la bioinformática de estructura y secuencia, y el modelado atomístico pueden tener éxito donde cualquiera de estos enfoques haya fallado por sí solo.

Tras la sobreexpresión heteróloga, muchas proteínas se pliegan incorrectamente o se agregan, lo que da como resultado rendimientos funcionales bajos. La acetilcolinesterasa humana (hAChE), una enzima que media la transmisión sináptica, es un caso típico de una proteína humana que necesita sistemas de mamíferos para obtener una expresión funcional. Desarrollamos una estrategia computacional y diseñamos una variante de AChE con 51 mutaciones que mejoraron el empaquetamiento del núcleo, la polaridad de la superficie y la rigidez de la columna vertebral. Esta variante se expresó a niveles similares a 2.000 veces más altos en E. coli en comparación con la hAChE de tipo salvaje y exhibió una termoestabilidad 20 grados C más alta sin cambios en las propiedades enzimáticas o en la configuración del sitio activo según lo determinado por cristalografía. Para demostrar una amplia utilidad, diseñamos de manera similar otras cuatro proteínas humanas y bacterianas. Al probar como máximo tres diseños por proteína, obtuvimos una mayor estabilidad y / o mayores rendimientos de proteína soluble y activa en E. coli. Nuestro algoritmo requiere solo una estructura 3D y varias docenas de secuencias de homólogos naturales, y está disponible en http://pross.weizmann.ac.il.

Durante la última década, los científicos han logrado avances interesantes en el diseño de pliegues de proteínas completamente en la computadora y luego sintetizarlos con éxito en el laboratorio (1-5). Estas proteínas de diseño tenían la misma estructura en el experimento que en el modelo y eran muy estables, sin embargo, carecían de características estructurales importantes que se ven en las interfaces de proteínas y en los sitios activos de las enzimas. En dos informes de las páginas 680 y 687 de este número, Boyken et al. (6) y Jacobs et al. (7) utilice el software de modelado biomolecular Rosetta para diseñar proteínas que incluyan algunas de estas características. Los experimentos muestran que estos nuevos diseños conservan una alta precisión y estabilidad estructural.

La inserción de segmentos formadores de hélice en la membrana y su asociación determina la estructura, función y niveles de expresión de todas las proteínas de la membrana plasmática. Sin embargo, la cuantificación sistemática y confiable de la energía de las proteínas de membrana ha sido un desafío. Desarrollamos un método de escaneo mutacional profundo para monitorear los efectos de cientos de mutaciones puntuales en la inserción de la hélice y la autoasociación dentro de la membrana interna bacteriana. El ensayo cuantifica la energía de inserción para todos los aminoácidos naturales en 27 posiciones a través de la membrana, revelando que la hidrofobicidad de las membranas biológicas es significativamente mayor de lo que se cree. Además, cuantificamos las contribuciones a la inserción de proteínas de membrana a partir de residuos cargados positivamente en la interfaz citoplasma-membrana y revelamos grandes e inesperadas diferencias entre estos residuos. Finalmente, derivamos paisajes mutacionales completos en los dominios de membrana de la glicoforina A y el oncogén ErbB2, y encontramos que la inserción y la autoasociación están fuertemente acopladas en los homodímeros del receptor.

El catalizador de disulfuro secretado Quiescin sulfhidril oxidasa-1 (QSOX1) afecta la organización de la matriz extracelular y se sobreexpresa en varios adenocarcinomas y estromas asociados. La inhibición de QSOX1 humano extracelular por un anticuerpo monoclonal disminuyó la migración de células tumorales en un modelo de cocultivo celular y, por tanto, puede tener potencial terapéutico. Sin embargo, la especificidad de especie del anticuerpo monoclonal QSOX1 ha sido un retroceso en la evaluación de su utilidad como agente antimetastásico in vivo, un problema común en la industria de la terapia de anticuerpos. Por lo tanto, utilizamos ingeniería guiada estructuralmente para expandir la especificidad de la especie de anticuerpo, mejorando su afinidad hacia QSOX1 de ratón en al menos cuatro órdenes de magnitud. Una estructura cristalina de la variante rediseñada, complejada con su antígeno de ratón, reveló que el anticuerpo logra la selección de especies duales a través de contactos alterados entre sus cadenas pesadas y ligeras, además de la sustitución de aromáticos voluminosos por cadenas laterales flexibles y versátiles polares con puentes de agua. interacciones. En paralelo, producimos un anticuerpo sustituto dirigido a QSOX1 de ratón que exhibe un nuevo modo de inhibición de QSOX1. Este conjunto de tres anticuerpos inhibidores de QSOX1 es compatible con varios modelos de ratón para ensayos preclínicos y aplicaciones biotecnológicas. En este estudio proporcionamos información sobre los bloques estructurales para la reactividad cruzada y establecemos guías para el diseño y la reingeniería de anticuerpos exitosos.

El diseño computacional de la función de las proteínas ha logrado un progreso sustancial, generando nuevas enzimas, aglutinantes, inhibidores y nanomateriales nunca antes vistos en la naturaleza. Sin embargo, la capacidad de diseñar nuevas cadenas principales de proteínas para la función esencial para ejercer control sobre todos los grados de libertad de los polipéptidos sigue siendo un desafío crítico. La mayoría de los intentos anteriores de diseñar nuevas redes troncales calcularon la cadena principal desde cero. Aquí, en cambio, describimos un algoritmo combinatorio de optimización de secuencia y columna vertebral llamado AbDesign, que aprovecha la gran cantidad de secuencias y estructuras moleculares de anticuerpos determinadas experimentalmente para construir nuevos modelos de anticuerpos, acoplarlos contra superficies objetivo y optimizar su secuencia y conformación de columna vertebral para altas estabilidad y afinidad de unión. Usamos el algoritmo para producir diseños de anticuerpos que se dirigen a las mismas superficies moleculares que nueve anticuerpos naturales de alta afinidad en cinco casos, la identidad de la secuencia de interfaz es superior al 30%, y en cuatro de ellos, la conformación de la columna vertebral en el núcleo de la superficie de unión del anticuerpo es dentro de 1 angstrom de desviación cuadrática media de la raíz de los anticuerpos naturales. Los diseños recapitulan las redes de interacción polar observadas en los complejos naturales, y la rigidez de la cadena lateral de aminoácidos en la superficie de unión diseñada, que probablemente es importante para la afinidad y la especificidad, es alta en comparación con los estudios de diseño anteriores. En los anticuerpos anti-lisozima diseñados, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) en la periferia de la interfaz, como L1 y H2, muestran una mayor diversidad de conformación del esqueleto que las CDR en el núcleo de la interfaz y aumentan el área de superficie de unión en comparación con el anticuerpo natural, potenciando potencialmente la afinidad y la especificidad.

Antecedentes: los tipos de cohesina-dockerina celulosomal se invierten en Bacteroides cellulosolvens. Resultados: Los enfoques cristalográficos y computacionales combinados de una cohesina solitaria produjeron un modelo estructural del complejo cohesina-dockerina que se verificó experimentalmente. Conclusión: El modo de unión dual de dockerin no es exclusivo de la integración enzimática en los celulosomas, sino que también caracteriza la unión a la superficie celular. Importancia: este enfoque combinado proporciona una plataforma para generar hipótesis comprobables de la interacción cohesina-dockerina de alta afinidad. Las interacciones cohesina-dockerina orquestan el ensamblaje de uno de los complejos multienzimáticos más elaborados de la naturaleza, el celulosoma. Los celulosomas son producidos exclusivamente por microbios anaeróbicos y median la hidrólisis altamente eficiente de los polisacáridos estructurales de las plantas, como la celulosa y la hemicelulosa. En el modelo canónico de ensamblaje de celulosomas, los módulos de dockerin de tipo I de las enzimas se unen a módulos de cohesina de tipo I reiterados de un andamio primario. Cada dockerina de tipo I contiene dos sitios de unión a cohesina altamente conservados, que confieren flexibilidad cuaternaria al complejo multienzimático. El andamio también lleva un dockerin de tipo II que ancla todo el complejo a la superficie de la célula uniendo cohesinas de tipo II de andamios de anclaje. En Bacteroides cellulosolvens, sin embargo, la organización de los tipos cohesina-dockerina se invierte, por lo que los pares de cohesina-dockerina de tipo II integran las enzimas en la andamiaje primario, y los módulos de tipo I median la unión del celulosoma a una andamiaje de anclaje. Aquí, informamos de la estructura cristalina de una cohesina de tipo I de B. cellulosolvens andamiaje de anclaje en ScaB a una resolución de 1,84 angstrom. La estructura se asemeja a otras cohesinas de tipo I, y es probable que el sitio putativo de unión a la dockerina, centrado en las cadenas 3, 5 y 6, se conserve en otras cohesinas de B. cellulosolvens de tipo I. El modelado computacional combinado, la mutagénesis y los estudios de unión basados ​​en afinidad revelaron redes de enlaces de hidrógeno similares entre los residuos de reconocimiento de Ser / Asp putativos en la dockerina en las posiciones 11/12 y 45/46, lo que sugiere que un modo de unión dual no es exclusivo de la integración de enzimas en celulosomas primarios, pero también puede caracterizar el ensamblaje de policelulosomas y la unión a la superficie celular. Este enfoque general puede proporcionar información estructural valiosa de la interfaz cohesina-dockerina, en lugar de una estructura cristalina definitiva.

El gen del regulador autoinmune (AIRE) es crucial para establecer la tolerancia inmunológica central y prevenir la autoinmunidad. Las mutaciones en AIRE causan una enfermedad autosómica recesiva rara, el síndrome poliendocrino autoinmune tipo 1 (APS-1), que se distingue por autoinmunidad multiorgánica. Hemos identificado múltiples casos y familias con mutaciones mono-alélicas en el primer dedo de zinc del homeodominio vegetal (PHD1) de AIRE que siguió a la herencia dominante, típicamente caracterizada por un inicio tardío, fenotipos más leves y penetrancia reducida en comparación con el APS-1 clásico. Estas mutaciones de PHD1 sin sentido suprimieron la expresión génica impulsada por AIRE de tipo salvaje de una manera dominante negativa, a diferencia de CARD o mutantes AIRE truncados que carecían de dicha capacidad dominante. El análisis de la matriz del exoma reveló que los mutantes dominantes de PHD1 se encontraron con una frecuencia relativamente alta (& gt0.0008) en poblaciones mixtas. Nuestros resultados proporcionan información sobre la acción molecular de AIRE y demuestran que las mutaciones que causan enfermedades en el locus AIRE son más comunes de lo que se pensaba anteriormente y causan fenotipos autoinmunes más variables.

Para llevar a cabo sus actividades, las macromoléculas biológicas equilibran diferentes rasgos físicos, como estabilidad, afinidad de interacción y selectividad. La forma en que se codifican rasgos tan a menudo opuestos en un sistema macromolecular es fundamental para nuestra comprensión de los procesos evolutivos y la capacidad de diseñar nuevas moléculas con las funciones deseadas. Presentamos un marco para restringir las simulaciones de diseño para equilibrar diferentes características físicas. Cada rasgo está representado por la ocupación fraccional de equilibrio del estado deseado en relación con sus alternativas, que van desde la ocupación nula hasta la ocupación completa, y los diferentes rasgos se combinan utilizando operadores booleanos para lograr un lenguaje lógico "difuso" para codificar cualquier combinación de rasgos. En otro artículo, presentamos un nuevo algoritmo de diseño de esqueleto combinatorio AbDesign donde se utilizó el marco de lógica difusa para optimizar los esqueletos y secuencias de proteínas para la estabilidad y la afinidad de unión en la simulación de diseño de anticuerpos. Ahora ampliamos este marco y encontramos que las simulaciones de diseño de lógica difusa reproducen los principios de diseño de secuencias y estructuras vistos en la naturaleza para subyacer a la exquisita especificidad por un lado y la multiespecificidad por el otro. El lenguaje de lógica difusa es ampliamente aplicable y podría ayudar a definir el espacio de mutaciones toleradas y beneficiosas en sistemas biomoleculares naturales y diseñar moléculas artificiales que codifiquen características complejas. (C) 2014 MRC Laboratorio de Biología Molecular. Publicado por Elsevier Ltd.


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Desafíos en la nanomedicina del cáncer

El destino de un nanosistema administrado a un organismo está influenciado por una gran red de factores. En particular, la eficacia de las nanoestructuras antitumorales está limitada por las dificultades en la focalización, los cambios dinámicos in vivo de los materiales y las múltiples barreras biológicas. Estos obstáculos complejos e interconectados requieren contramedidas de varios niveles que solo se pueden lograr con multifuncionalidad.

La progresión del cáncer es un resultado colectivo de numerosos eventos patológicos 14, que a menudo no son específicos de un tumor, sino que involucran procesos fisiológicos normales distorsionados por la enfermedad. Además, las células tumorales son muy heterogéneas y tienen altas tasas de mutación, lo que da como resultado diferencias patológicas entre diferentes tipos de cánceres, individuos y regiones intratumorales. Para abordar esta heterogeneidad, se están explorando terapias combinatorias o de múltiples objetivos basadas en nanoestructuras. Por ejemplo, el acoplamiento de métodos dirigidos a células tumorales con estrategias que modulan el microambiente tumoral (TME) (Box & # x000a01) permite adaptar la terapia a distintas características tumorales. En los tumores altamente fibróticos, los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) o las células estrelladas pueden co-dirigirse, además de las células cancerosas, para inhibir la secreción de factores de crecimiento y citocinas proinflamatorias y para distribuir terapias administradas por nanoestructura a través del estroma denso. 15 & # x0201317. Además, la recurrencia de tumores después de la oclusión de la vasculatura mediante la administración dirigida de trombina puede reducirse considerablemente mediante la administración conjunta de doxorrubicina, probablemente porque la quimioterapia ayuda a erradicar las regiones tumorales que están menos pobladas por vasos sanguíneos [18].

Aunque el desarrollo de un fármaco específico para el tumor es extremadamente difícil, optimizar la farmacocinética y la biodistribución de un fármaco menos específico puede aumentar sustancialmente su eficacia. De hecho, la capacidad de administración dirigida al tumor, ya sea a través de la orientación pasiva basada en el efecto de permeabilidad y retención mejoradas (EPR), la orientación activa o la liberación de fármacos que responden a los estímulos, se ha considerado una ventaja clave de las nanomedicinas en el tratamiento del cáncer 2. Sin embargo, en comparación con las formulaciones de fármacos convencionales, el comportamiento in vivo y el destino de las nanoestructuras multifuncionales son más complejos, lo que puede hacerlas particularmente propensas a inconsistencias entre pacientes y entre modelos preclínicos y aplicaciones clínicas 19.

Las propiedades de las nanoestructuras se ven afectadas instantáneamente cuando ingresan al cuerpo por interacciones en la interfaz nano & # x02013bio. Estas interacciones pueden conducir a inestabilidades, como agregación de partículas, descomposición, pérdida de unidades funcionales o liberación de especies peligrosas, que afectan en gran medida la eficiencia de la entrega y la bioseguridad 20. El contacto con los fluidos fisiológicos también conduce al encubrimiento de la nanoestructura con las proteínas del suero (la corona de proteínas), protegiendo potencialmente las funcionalidades de la superficie (como los ligandos dirigidos) e interfiriendo con la liberación del fármaco 21. Las modificaciones antiincrustantes, como el recubrimiento con poli (etilenglicol) (PEG), a menudo se aplican para reducir las interacciones entre nanopartículas y proteínas.También se han descrito alternativas basadas en biomoléculas, especialmente proteínas y péptidos 22,23. Además, la interferencia de la corona de proteínas con las funcionalidades de la superficie depende de la técnica de funcionalización, por ejemplo, los anticuerpos preadsorbidos en nanopartículas poliméricas conservan su capacidad de direccionamiento mejor que las moléculas conjugadas químicamente, quizás debido a una cobertura de superficie más robusta 24. Adaptando las modificaciones de la nano-superficie, la composición de la corona de proteínas puede manipularse y explotarse para aumentar la circulación, reducir la toxicidad o mejorar la focalización 21,25. Por ejemplo, Onpattro, una formulación de ARN de interferencia pequeño (ARNip) disponible comercialmente, recluta la proteína que se dirige al hígado, la apolipoproteína E, en la superficie de la nanopartícula lipídica que contiene colesterol in vivo 26. También se han utilizado péptidos cortos para manipular los modos de unión de las apolipoproteínas séricas en la superficie de las nanopartículas para mejorar la administración a través de la barrera hematoencefálica 27. Aunque la interferencia de la adsorción no específica debe caracterizarse cuidadosamente 28, este enfoque sugirió la posibilidad de modular las proteínas corona con mayor precisión y usarlas como funcionalidad adicional.

En el torrente sanguíneo, los fagocitos se adhieren fácilmente a las nanoestructuras proteicas recubiertas de corona a través de receptores específicos, lo que conduce a la eliminación de las nanoestructuras de la circulación por el sistema reticuloendotelial (RES) 29. Por lo tanto, los recubrimientos antiincrustantes, como el PEG, se utilizan comúnmente para prolongar el tiempo de circulación de las nanoestructuras. No obstante, la modificación de PEG sólo reduce parcialmente la inmunogenicidad, y la estimulación de los anticuerpos que se unen a PEG ha planteado problemas de seguridad 30,31. Las estrategias antiincrustantes más activas incluyen la decoración de la superficie con restos basados ​​en CD47 32,33, una proteína & # x02018automarcadora & # x02019 que inhibe la fagocitosis, o con membranas de células sanguíneas extraídas (que muestran CD47 en su superficie) 31,34, para ayudar a los nanomateriales a evadir el aclaramiento de los fagocitos. En modelos de ratón, estos métodos han demostrado propiedades de sigilo superiores en comparación con la PEGilación 31,32,34. Sin embargo, el aclaramiento mediado por corona también puede beneficiar la administración dirigida a los órganos de RES o macrófagos. Por ejemplo, alternando con precisión la carga de los liposomas catiónicos, pueden dirigirse selectivamente al hígado y al bazo para administrar genes [35].

Para llegar al tejido tumoral, los nanosistemas primero necesitan extravasar de la circulación 1,36, lo que durante mucho tiempo se pensó que estaba habilitado por la vasculatura sanguínea del tumor con fugas. Sin embargo, el efecto de EPR varía mucho entre tumores e incluso entre diferentes regiones del mismo tumor, y su importancia clínica sigue siendo controvertida 37 & # x0201339. Las nanopartículas multifuncionales pueden aumentar activamente la extravasación intratumoral creando hipertensión local, provocando relajación vascular o induciendo daño adicional en los vasos sanguíneos del tumor. Tales estrategias pueden abordar en parte el problema de la heterogeneidad de la EPR 38,40, pero la estratificación de los pacientes y la medicina personalizada guiada por imágenes resultarán esenciales para adaptar las estrategias terapéuticas basadas en nanomateriales 1,2,41.

Además, la eficiencia de la extravasación se ve afectada por las propiedades de los nanomateriales, por ejemplo, en la sangre que fluye, las nanopartículas esféricas tienden a permanecer cerca del centro del vaso, mientras que las estructuras en forma de varilla o placa tienen más probabilidades de desplazarse hacia las paredes del vaso y exhibir fuertes interacciones con las células endoteliales, debido a la mayor área de contacto 36,42. La suavidad de la superficie de las vesículas extracelulares impacta sustancialmente en la extravasación y la captación celular in vivo 43. La adhesión endotelial y, por tanto, la extravasación, puede mejorarse revistiendo nanopartículas con membranas celulares derivadas de leucocitos 44. En general, se cree que la extravasación se produce por fugas paracelulares; sin embargo, otros mecanismos, como el transporte activo por las células endoteliales 39,45, también desempeñan un papel y están recibiendo atención en términos de diseño de nanosistemas y orientación 46,47.

La mayoría de las nanoformulaciones contra el cáncer están diseñadas para uso intravenoso. Es de destacar que los desafíos que plantean las barreras biológicas durante el transporte de nanopartículas están relacionados con la vía de administración, por ejemplo, las estrategias multifuncionales aún no han abordado el problema de la acumulación de nanomateriales inyectados por vía intravenosa en el hígado, lo que puede ayudar a reducir la toxicidad de los medicamentos administrados a otros tejidos. y mejorar la tolerancia general 12, pero sigue siendo un problema para la administración eficaz del fármaco al tumor. La vía de administración determina el patrón de biodistribución de los fármacos, y se exploran vías alternativas a la inyección intravenosa con las estrategias de dirección correspondientes para cánceres específicos (Cuadro & # x000a02). La inyección intradérmica y subcutánea, por ejemplo, puede ser particularmente útil para apuntar al sistema linfático para la inmunización tumoral 48, mientras que las nanopartículas administradas por vía oral pueden apuntar al cáncer de colon 49.

El tumor y la TME también proporcionan una barrera para la administración de fármacos basada en nanoestructuras. La alta presión del líquido intersticial y el estroma desmoplásico limitan la penetración de nanoestructuras 6,36. Además, las regiones tumorales más profundas están menos pobladas por vasos sanguíneos. Además, las nanopartículas pueden ser capturadas por macrófagos asociados a tumores (TAM) en lugar de células tumorales después de la extravasación 41. Estas complicaciones intratumorales han motivado el desarrollo de estrategias de focalización de TME (Box & # x000a01), explotando objetivos potenciales que son más accesibles que las células tumorales. De hecho, los objetivos relacionados con la TME, como la proteína de activación de fibroblastos en los CAF 16, el complejo de fibrina y fibronectina en los vasos sanguíneos del tumor 18 o los TAM 50,51, ya se han aplicado para la administración de nanopartículas. Para las terapias que requieren administración intracelular (por ejemplo, administración de genes y administración de antígenos), se necesitan la captación celular y el escape endosómico. Sin embargo, a diferencia de los pequeños fármacos hidrófobos, las nanopartículas no pueden difundirse pasivamente a través de la membrana plasmática. Por lo tanto, se utilizan ligandos dirigidos a proteínas de membrana, péptidos que penetran en las células o materiales fusogénicos para promover la captación celular 5,52.

Recuadro 1 Objetivos de microambiente tumoral para nanoestructuras multifuncionales

Estroma y fibroblastos

En el microambiente tumoral (TME), las células estromales inactivas se vuelven proliferativas y altamente secretoras, lo que da como resultado una matriz extracelular densa (MEC), que actúa como una barrera intratumoral contra la penetración del fármaco. Además, los componentes de la ECM, las citocinas y las quimiocinas secretadas por los fibroblastos activados asociados al cáncer y las células estromales mesenquimales promueven la proliferación de células tumorales, la invasión y la adquisición de resistencia a los fármacos 15. Las proteínas de las células estromales (como la proteína de activación de fibroblastos & # x003b1) y los componentes ECM (especialmente las enzimas ECM) pueden usarse como dianas para la administración o liberación selectiva de fármacos 16. Los fármacos que se dirigen a las anomalías del estroma se pueden combinar con estrategias de focalización de TME para revertir la activación de las células estromales, inhibir la señalización protumoral o reducir la síntesis y secreción de componentes fibróticos de la ECM como el hialuronano y el colágeno 15,17.

Vasos sanguineos

En muchos (pero no todos) los tumores sólidos 241, la angiogénesis se desplaza hacia el estado proangiogénico, lo que conduce a una red vascular tortuosa e interrumpida, que limita la perfusión del fármaco. Las células endoteliales vasculares condicionadas por la TME participan activamente en la exclusión o metástasis de las células T, y el estado procoagulativo de los tumores conduce a la activación de las plaquetas, que pueden promover la invasión tumoral 242 & # x02013244. Los receptores endoteliales y los microtrombos asociados a tumores pueden dirigirse para localizar nanoestructuras en la vasculatura del tumor 40. Se pueden liberar fármacos en la TME para modular la señalización angiogénica intratumor (por ejemplo, la vía del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)) o ​​para neutralizar factores proangiogénicos excesivos, que se generan en respuesta a terapias citotóxicas 245.

Células inmunes

La mayoría de las nanoterapias dirigidas a células inmunitarias tienen como objetivo mejorar la respuesta de las células T citotóxicas contra el cáncer. Los tratamientos que se dirigen directamente a las células T mediante el uso de inhibidores de puntos de control inmunológico (proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) o proteína 1 de muerte celular programada (PD-1)) se han mostrado prometedores contra los tumores calientes, en los que las células T activas pueden infiltrarse, pero están funcionalmente bloqueados por la señalización de los puestos de control inmunitarios 246. En los tumores fríos, las células T no se activan debido a la presencia de células inmunes inmunosupresoras, que pueden ser dirigidas para mejorar el reclutamiento de células T. Las nanovacunas que administran antígenos tumorales y agentes inmunoestimuladores a las células dendríticas pueden mejorar su maduración y presentación de antígenos 247,248. La reprogramación de los macrófagos protumorales a fenotipos antitumorales puede reactivar su actividad citotóxica antitumoral y estimular las respuestas de las células T 50,51. Las células asesinas naturales (NK) atacan espontáneamente a las células cancerosas sin requerir sensibilización al antígeno. Dirigirse a las células NK con citocinas (por ejemplo, IL-15) o anticuerpos que inducen estimulación y expansión proporciona una alternativa a la inmunoterapia basada en células T 249.

Vasos linfáticos

Los tumores sólidos carecen de drenaje linfático funcional; sin embargo, los vasos linfáticos son vías importantes para la metástasis de las células cancerosas. De hecho, los altos niveles de linfangiogénesis en los tumores se correlacionan con un resultado deficiente 250,251. Las células endoteliales linfáticas asociadas a tumores sobreexpresan moléculas inmunosupresoras, como PD-L1, pero también promueven la migración de células dendríticas hacia los ganglios linfáticos, asociada con una alta infiltración de células T vírgenes 250. La linfangiogénesis tumoral se puede modular bloqueando VEGFR3, el receptor de VEGF-C, un factor linfangiogénico 251 secretado por células tumorales. Sin embargo, los ligandos dirigidos a los vasos linfáticos siguen siendo limitados (con el ejemplo del péptido LyP-1 252).

Recuadro 2 Vías de administración para nanoestructuras dirigidas al cáncer

Administracion intravenosa se caracteriza por una rápida respuesta terapéutica, una alta biodisponibilidad del fármaco y un alto control de la administración. Los nanosistemas estructuralmente complejos y biológicamente inestables a menudo no son adecuados para la absorción gastrointestinal o la inyección intramuscular y, por lo tanto, la inyección intravenosa es a menudo el método de elección. Además, las terapias anti-metástasis requieren la administración sistémica de fármacos. Sin embargo, la administración intravenosa adolece de un rápido aclaramiento del fármaco, una distribución y acumulación tisular no deseada y efectos secundarios adversos posteriores.

Entrega oral se beneficia de un buen cumplimiento por parte del paciente y puede proporcionar un fácil acceso para la orientación del tracto gastrointestinal. Sin embargo, el entorno hostil y complejo en el tracto gastrointestinal (alta variación de pH, enzimas metabólicas, aclaramiento mediado por moco) presenta desafíos para las nanoestructuras. Por lo general, se requieren elementos que se adhieran al moco y que penetran en el endotelio para aumentar la adsorción intestinal y la penetración de los nanomateriales.

Inhalación y administración intranasal. permitir el acceso al tracto respiratorio (por ejemplo, para el tratamiento del cáncer de pulmón) y permitir una focalización sostenida y menos invasiva, en comparación con la inyección intravenosa. Las nanoestructuras también requieren funcionalidades de adherencia al moco para mejorar la adhesión y penetración del moco (como ocurre con otras vías mucosas, como el parto vaginal) 253. Sin embargo, los fármacos administrados por vía intranasal o inhalados también pueden distribuirse sistémicamente, de hecho, se ha encontrado que los fármacos administrados por vía intranasal se acumulan en el sistema nervioso central 253.

Inyección e infusión directa en tejidos adyacentes al sitio del tumor es una opción si los tumores son fácilmente accesibles. Las rutas de administración local evitan muchas barreras biológicas (por ejemplo, los medicamentos administrados en el cerebro evitan la barrera hematoencefálica), pero aún se requiere la penetración de tejidos. Los enfoques para mejorar la penetración y retención de nanomateriales en la dermis y el tejido subcutáneo siguen siendo limitados 254. Las partículas pequeñas inyectadas localmente son propensas a un drenaje linfático rápido y, por lo tanto, la administración subcutánea puede entregar nanopartículas a los ganglios linfáticos y las células inmunes que residen en el sistema linfático.

Cada vía de administración conduce a una distribución de fármaco distinta y patrones distintos de efectos adversos. Deben tenerse en cuenta las cuestiones de seguridad relacionadas con las vías no intravenosas, como la inhalación o el contacto con la piel 255. Será fundamental realizar estudios sistemáticos de las toxicidades específicas de la ruta en el contexto de la nanomedicina contra el cáncer.


Información del autor: Gillooly JF 1, Gomez JP 2,3, Mavrodiev EV 4.

Fecha de publicación electrónica: febrero de 2017

Abstracto: Las diferencias en los límites y el rango de niveles de actividad aeróbica entre endotermos y ectotermos siguen siendo poco conocidos, aunque tales diferencias ayudan a explicar las diferencias básicas en las especies y estilos de vida (por ejemplo, patrones de movimiento, modos de alimentación y tasas de interacción). Comparamos los límites y el rango de actividad aeróbica en endotermos (aves y mamíferos) y ectotermos (peces, reptiles y anfibios) mediante la evaluación de la dependencia de masa corporal del VO2 máx., Alcance aeróbico y masa cardíaca en un contexto filogenético basado en un Supertárbol de vertebrados de nueva construcción. A diferencia de trabajos anteriores, los resultados no muestran diferencias significativas en la escala de masa corporal de las tasas de consumo de oxígeno mínimo y máximo con la masa corporal dentro de las endotermas o ectotermas. Para una masa corporal dada, las tasas de reposo y las tasas máximas fueron 24 veces y 30 veces más bajas, respectivamente, en ectotermos que en endotermos. El alcance aeróbico factorial osciló entre cinco y ocho en ambos grupos, con el alcance en endotermos mostrando una modesta dependencia de la masa corporal. Finalmente, las tasas de consumo máximo y el alcance aeróbico se correlacionaron positivamente con la masa cardíaca residual. Juntos, estos resultados cuantifican similitudes y diferencias en el potencial de actividad aeróbica entre ectotermos y endotermos de diversos entornos. Proporcionan información sobre los modelos y mecanismos que pueden subyacer a la dependencia de la masa corporal del consumo de oxígeno.


Información del autor

Estos autores contribuyeron igualmente: Jing Wang, Yiye Li.

Afiliaciones

Laboratorio clave CAS para efectos biomédicos de nanomateriales y nanoseguridad, Centro CAS para la excelencia en nanociencia, Centro Nacional de Nanociencia y Tecnología, China, Beijing, China

Jing Wang, Yiye Li y Guangjun Nie

Centro de Ciencia de Materiales e Ingeniería Optoelectrónica, Universidad de la Academia de Ciencias de China, Beijing, China

Jing Wang, Yiye Li y Guangjun Nie

Instituto de Innovación en Investigación de GBA para Nanotecnología, Guangdong, China

Instituto de Tecnología Avanzada de Henan, Universidad de Zhengzhou, Zhengzhou, China