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Herramientas para encontrar miRNA ID

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¿Cómo puedo obtener números de acceso de miARN de trigo harinero por sus secuencias? ¿Cuáles son las herramientas o el sitio web que se pueden utilizar?


  1. Si tiene una secuencia, ejecute una búsqueda BLAST de nucleótidos en NCBI, especificando Triticum aestivum (taxid: 4565) como organismo.

  2. La página de miRBase para Triticum aestivum tiene detalles de los microARN de trigo y una página donde puede hacer una búsqueda de secuencia con BLAST o SSEARCH (como @WYSIWYG señaló amablemente).

  3. Quizás el Triticum aestivum La página en PlantGDB puede ayudar.


Características comunes de las herramientas de predicción de objetivos de microARN


  • 1 Centro de Medicina Molecular, Instituto de Investigación del Centro Médico de Maine, Scarborough, ME, EE. UU.
  • 2 Escuela de Graduados en Ciencias Biomédicas e Ingeniería, Universidad de Maine, Orono, ME, EE. UU.
  • 3 Departamento de Ciencias de la Computación, Universidad del Sur de Maine, Portland, ME, EE. UU.

El genoma humano codifica más de 1800 microARN (miARN), que son moléculas cortas de ARN no codificantes que funcionan para regular la expresión génica postranscripcionalmente. Debido a la posibilidad de que un miARN se dirija a múltiples transcripciones de genes, los miARN se reconocen como un mecanismo principal para regular la expresión génica y la traducción del ARNm. La predicción computacional de objetivos de miRNA es un paso inicial crítico en la identificación de interacciones objetivo de miRNA: mRNA para la validación experimental. Las herramientas disponibles para la predicción de objetivos de miARN abarcan una gama de diferentes enfoques computacionales, desde el modelado de interacciones físicas hasta la incorporación del aprendizaje automático. Esta revisión proporciona una descripción general de los principales enfoques computacionales para la predicción de objetivos de miARN. Nuestra discusión destaca tres herramientas por su facilidad de uso, dependencia de versiones relativamente actualizadas de miRBase y rango de capacidades, y estas son DIANA-microT-CDS, miRanda-mirSVR y TargetScan. En comparación con todas las herramientas de predicción de objetivos de miARN, cuatro aspectos principales de la interacción miARN: el objetivo de ARNm emergen como características comunes en las que se basa la mayor parte de la predicción de blancos: coincidencia de semillas, conservación, energía libre y accesibilidad al sitio. Esta revisión explica estas características e identifica cómo se incorporan a las herramientas de predicción de objetivos disponibles actualmente. La predicción de objetivos de ARNm es un campo dinámico en el que se presta cada vez más atención al desarrollo de nuevas herramientas de análisis. Esta revisión intenta proporcionar una evaluación integral de estas herramientas de una manera que sea accesible en todas las disciplinas. Comprender la base de estas metodologías de predicción ayudará en la selección del usuario de las herramientas adecuadas y la interpretación de la salida de la herramienta.


Introducción

Las enfermedades priónicas (o encefalopatías espongiformes transmisibles) son una clase invariablemente fatal de trastornos neurodegenerativos progresivos, incluida la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob esporádica (sCJD) y el síndrome de Gerstmann-Straüssler-Scheinker (GSS) en humanos 1. La patología de la enfermedad se debe a la conversión conformacional de la PrP C celular normal en la isoforma PrP Sc asociada a la enfermedad que conduce a la vacuolación espongiforme característica en el cerebro y la pérdida progresiva de neuronas. La sCJD comúnmente se presenta como una encefalopatía demencial con mioclonías, ataxia cerebelosa y la duración típica de la enfermedad con una mediana de supervivencia de cuatro meses 2. El diagnóstico clínico de las enfermedades priónicas se realiza en una etapa avanzada de deterioro neurológico, donde los individuos afectados suelen estar inmóviles y no transmisibles. La confirmación de un diagnóstico de enfermedades priónicas se realiza mediante una biopsia cerebral o una autopsia. Para mejorar las estrategias de diagnóstico e intervención para la enfermedad priónica, necesitamos comprender mejor la patogénesis de las enfermedades priónicas y los reguladores clave de los procesos moleculares durante la infección que impulsa la infectividad priónica y la propagación de la enfermedad. Aquí, buscamos determinar la huella molecular de los cambios de microARN (miARN) en el cerebro y el suero de ratones infectados con priones que podrían usarse como marcadores preclínicos y clínicos de sCJD.

Las moléculas de miARN han sido reconocidas como un modulador clave en la represión traduccional o degradación del ARNm al unirse a la región no traducida 3 '(UTR) de sus sitios diana. En el contexto de las enfermedades priónicas, los modelos animales han revelado una lista de firmas de miARN que son responsables de vías biológicas vitales, incluida la plasticidad sináptica, el desarrollo neuronal y la supervivencia celular 3,4,5,6. Además, los miARN que se encuentran empaquetados en vesículas extracelulares (VE), como los exosomas, se han estudiado cada vez más para determinar si pueden servir como biomarcadores de diagnóstico cuando se aíslan de la sangre 7,8,9. Recientemente, el aislamiento de exosomas derivados de los nervios en sangre 10 sugiere que los exosomas derivados del cerebro pueden eludir la barrera hematoencefálica (BHE). Esto puede permitir la capacidad de diagnosticar enfermedades neurodegenerativas a través de un análisis de sangre no invasivo conocido como biopsia cerebral líquida.

Para investigar los patrones de expresión de miARN temporal en una región específica del cerebro, hemos utilizado un modelo de ratón in vivo bien caracterizado con la cepa priónica M1000 que es una cepa humana adaptada al ratón aislada de un paciente que murió de GSS 11,12. Estos ratones infectados desarrollan los primeros signos de neuropatología después del período de incubación medio, 13 semanas después de la inoculación (wpi), en el tálamo y el hipocampo, que se extiende a la corteza occipital y el tallo cerebral a partir de 14 wpi con priones M1000 3. En este estudio, se recogió la región del cerebro del tálamo de los ratones infectados con M1000 y se usó para perfilar el miARN en puntos de tiempo que representan la etapa preclínica de la enfermedad (3 y 13 wpi, semana 3 infectada con prión M1000 (norte = 6), semana 13 (norte = 5) y semana 3 sin infección (norte = 6), semana 13 (norte = 6)) para identificar posibles marcadores de miARN preclínicos. A modo de comparación, también se recolectaron tejidos en la etapa clínica en la que los ratones infectados muestran síntomas (20 wpi, terminal, terminal infectado con prion M1000 (norte = 6) y terminal no infectado (norte = 5)). Además, para identificar posibles biomarcadores preclínicos basados ​​en sangre para la sCJD, también perfilamos los EV aislados del suero correspondiente para identificar la relación temporal entre los cambios de expresión de miARN en el tálamo y los EV séricos a lo largo del curso de la enfermedad y cómo se producen estos cambios. implicado en la patogenia de las enfermedades priónicas. Los biomarcadores séricos podrían usarse para desarrollar un método para monitorear la etapa de progresión de la enfermedad en pacientes con ECJc y ayudar en el tratamiento y los ensayos terapéuticos.

Se seleccionaron los miARN estadísticamente significativos identificados en el modelo de ratón infectado con M1000 en los momentos preclínicos y clínicos para su validación en un conjunto de muestras clínicas humanas recogidas de pacientes y controles con sCJD. Las enfermedades priónicas incluyen tres formas: esporádica, familiar y adquirida por una infección que puede presentar diferentes características patológicas. Si bien el período de incubación o el período preclínico puede ser largo (hasta cuatro décadas), la sCJD puede progresar muy rápidamente tras el diagnóstico clínico. El codón 129 del gen de la proteína priónica (PRNP) es el sitio de un polimorfismo común de metionina (M) / valina (V) que está asociado con ciertos fenotipos de enfermedades priónicas humanas como la sCJD. En la población caucásica, el 52% de los individuos son homocigotos M (MM), el 36% son heterocigotos (MV) y el 12% son homocigotos V (VV) 13. El inicio medio de la enfermedad en los que son homocigotos con MM o heterocigotos con VM es de 65 años y la duración clínica media es de cuatro meses con un rango de 1 a 18 meses. Se ha observado que los homocigotos V tienen una duración clínica de 3 a 18 meses, donde la edad media de aparición es de 41 a 81 años (revisado en la ref. 14).

Un análisis de sangre no invasivo sería una herramienta invaluable para la sCJD, ya que generalmente es una condición difícil y rara de diagnosticar. Los pacientes a menudo reciben un diagnóstico erróneo debido a medidas clínicas deficientes y a la falta de tratamientos farmacológicos sistémicos eficaces. Los paneles de miARN identificados en este estudio identificaron biomarcadores potenciales para el diagnóstico temprano y para mejorar los resultados de los pacientes con sospecha de sCJD (demencia progresiva rápida) que tiene una duración clínica corta.


Resultados y discusión

Los sitios diana de miARN canónicos funcionan principalmente en las UTR 3 ′ de Drosophila

Para adquirir conjuntos de datos adecuados para el análisis cuantitativo de miARN dirigido a células de mosca, monitoreamos los cambios en los niveles de ARNm después de cotransfectar células S2 con uno de seis dúplex de miARN diferentes y un plásmido que codifica la proteína verde fluorescente (GFP). Los seis miARN transfectados (miR-1, miR-4, miR-92a, miR-124, miR-263a y miR-994) se eligieron porque ellos (o miARN relacionados en la misma familia de semillas) no se expresaron endógenamente en S2. células [8], y tenían diversas identidades de nucleótidos de partida, un rango de contenido de GC dentro de sus semillas y un rango de moderado a alto de abundancias de sitios diana pronosticados. Después de enriquecer las células positivas para GFP transfectadas mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), se realizó la secuencia de ARNm y se calcularon los cambios de pliegue de ARNm para cada condición de transfección de miARN en relación con una transfección simulada, en la que el plásmido de GFP se transfectó sin cualquier dúplex de miARN (Archivo adicional 1: Tabla S1). Luego, normalizamos los datos para reducir los efectos por lotes (archivo adicional 2: Figura S1A-D), algunos de los cuales fueron atribuibles a una modesta pero estadísticamente significativa de-represión de los objetivos predichos de miARN endógenos altamente expresados, como el miARN bantam (archivo adicional 2: Figura S1E – G) [50, 51]. Con este nuevo conjunto de datos, comenzamos a investigar las características de los sitios objetivo de miARN que se correlacionan con la represión del ARNm en las células de Drosophila.

En los mamíferos, la presencia de una A opuesta al primer nucleótido de un miARN se conserva preferentemente y se correlaciona con una mayor represión, independientemente de la identidad del primer nucleótido del miARN, observaciones explicadas por un bolsillo dentro del Argonaute2 humano (hsAGO2) que se une preferentemente este A [34, 37, 39, 52]. En las moscas, una A en esta posición del sitio objetivo también se asocia con una mejor conservación en comparación con los sitios idénticos que carecen de esta A [20], mientras que en los nematodos la conservación y la eficacia de un sitio con apareamiento perfecto con los nucleótidos de miARN 2-8 seguidos de una U (sitios 8mer-U1) se parece a la de los sitios 8mer-A1 [20, 53, 54]. Por lo tanto, examinamos la influencia del nucleótido en la posición 1 de la diana en las moscas, considerando los datos de todas las transfecciones de miARN agrupadas. De los ARNm que poseen una sola coincidencia con los nucleótidos de miARN 2-8 en su 3 ′ UTR, aquellos con un miARN A opuesto a la posición 1 (es decir, aquellos con el sitio 8mer-A1) tienden a estar más reprimidos que aquellos con cada uno de los otros. tres posibilidades opuestas a la posición 1 del miARN (8mer-C1, 8mer-G1 y 8mer-U1, respectivamente), y la identidad de las otras tres posibilidades tiene poca influencia sobre la represión (Fig. 1a). Como se esperaba según la observación de que la primera posición del ARN guía está enterrada dentro de Argonaute y no está disponible para el emparejamiento [52, 55, 56], esta observación generalmente se mantuvo al considerar cada transfección de miARN de forma independiente, independientemente de si la identidad del primer nucleótido del miARN era una U (archivo adicional 2: Figura S2). Por tanto, Drosophila muestra una preferencia por A en la posición diana 1 que se asemeja a la de los mamíferos, lo que implica que este nucleótido diana es reconocido por un bolsillo dentro de dmAgo1 que se asemeja al de hsAGO2. Con respecto a la nomenclatura, estos resultados respaldaron aún más la consideración del sitio 8mer-A1 como el sitio 8mer canónico de Drosophila, como se hizo originalmente en mamíferos [34].

Los miARN de Drosophila median la represión del ARNm a través de la orientación de tipos de sitios canónicos, preferentemente en 3 'UTR. a La mayor eficacia en Drosophila de los sitios con una A frente a la posición 1 del miARN. Se muestra la respuesta de los ARNm a la transfección de un miARN (miR-1, miR-4, miR-92a, miR-124, miR-263a, o miR-994). Los datos se combinaron en estos seis experimentos independientes. Se representan gráficamente las distribuciones acumulativas de los cambios de pliegues de ARNm observados tras la transfección de miARN para ARNm que contenían un único sitio del tipo indicado para el miARN transfectado. Los tipos de sitios comparados son 8mers que coinciden perfectamente con las posiciones de miARN 2-7 y tienen el nucleótido especificado (A, C, G o U) frente a la posición 1 del miARN. También se representa gráficamente para comparación la distribución acumulativa de los cambios de pliegues de ARNm para ARNm que no contenían un sitio canónico de 7 u 8 nt al ARN transfectado en su UTR 3 '(sin sitio). La similitud de las distribuciones que contienen sitios con la distribución sin sitios se probó con la prueba unilateral de Kolmogorov – Smirnov (K – S) (PAG valores). Se muestran entre paréntesis el número de ARNm analizados en cada categoría. B Los seis tipos de sitios canónicos para los que se detectó una señal de represión después de transfectar un miARN en células de Drosophila. Cmi La eficacia de los tipos de sitios canónicos observados en las UTR 3 ′ de Drosophila (C), ORF (D) y 5 ′ UTR (mi). Estos paneles son como en a, pero compare las distribuciones de cambio de veces para los ARNm que poseen un único sitio canónico en la región indicada con las que no tienen sitios canónicos en la totalidad del ARNm. Ver también archivo adicional 2: Figuras S1 y S2

Análisis análogos de valores de cambio de pliegues de ARNm en sistemas de mamíferos han demostrado la función y eficacia relativa de los sitios 8mer, 7mer-m8, 7mer-A1, 6mer y offset 6mer [37, 57]. En consecuencia, examinamos la función de estos tipos de sitios en Drosophila, nuevamente agrupando los datos y centrándonos en los ARNm con un solo sitio para el miARN afín. También consideramos un sexto tipo de sitio, el sitio 6mer-A1, que tiene una función implícita en los nematodos [20] y completa el conjunto de todas las posibles coincidencias perfectas de 8, 7 y 6 nt con la región de semillas de 8 nt, a los que nos referimos como tipos de sitios canónicos (Fig. 1b observe la distinción entre la semilla de 6 nt y la región de semilla de 8 nt). Cuando se ubica en el contexto de 3 ′ UTR, cada tipo de sitio canónico se asoció con la represión, con la magnitud de la represión siguiendo la jerarquía de 8mer & gt 7mer-m8 & gt 7mer-A1 & gt 6mer

6mer-A1 (Fig. 1c), como se indica en las pruebas estadísticas de las diferencias en las distribuciones de cambio de pliegues (archivo adicional 3: Tabla S2). Esta jerarquía se parecía a la de los mamíferos, excepto que en los mamíferos la eficacia de los diferentes sitios de 6 nt es mucho más distinta, con 6mer & gt offset 6mer & gt 6mer-A1, y con 6mer-A1 difícil de distinguir del fondo [37, 57 ].

También examinamos la eficacia de los sitios canónicos en las regiones de ARNm fuera del 3 ′ UTR. Se observó algo de represión para los ARNm con un sitio en su marco de lectura abierto (ORF) (y ningún sitio canónico en otra parte del ARNm), de manera más convincente para los sitios 8mer, aunque la eficacia de estos sitios fue mucho menor que la observada en 3 ′ UTR (Figura 1d). Estas observaciones son consistentes con las de los mamíferos [37, 58, 59]. Sin embargo, en contraste con las observaciones en mamíferos, también se observó represión para los ARNm con un sitio 8mer en su UTR 5 '(Fig. 1e). Tomando estos hallazgos en conjunto, llegamos a la conclusión de que los miRNA dirigidos a las moscas se parecen a los de los mamíferos, excepto que la eficacia de los tres sitios canónicos de 6 nt es más uniforme en las moscas y la represión de los mRNA endógenos se detecta más fácilmente en las 5 ′ UTR de las moscas.

Conservación generalizada de sitios objetivo de miARN canónicos en UTR de Drosophila

Un análisis evolutivo previo de los sitios objetivo de miARN de mamíferos proporcionó un marco para estimar la probabilidad de que los sitios objetivo de miARN predichos se conserven en todas las especies, al tiempo que se controlan factores como la relación diferencial de especies, la conservación de fondo diferencial en las UTR y las tasas diferenciales de sustituciones de dinucleótidos [57 ]. Aunque este enfoque también se ha aplicado a los genomas de Drosophila [20], lo mejoramos y ampliamos (1) actualizando las clasificaciones de familias de miARN conservadas y anotaciones 3 ′ UTR, (2) utilizando un árbol evolutivo ampliado que incorporó especies de insectos adicionales, (3 ) extendiendo los análisis a Drosophila 5 ′ UTRs, (4) usando una tubería de análisis evolutiva modificada [51], y (5) comparando nuestros resultados evolutivos con nuestros datos funcionales. Con este fin, compilamos anotaciones de miARN de múltiples estudios [8, 10, 11, 15] y clasificamos 91 familias de miARN como ampliamente conservadas entre las especies de Drosophila, 29 de las cuales se han conservado desde el último ancestro bilateriano (Archivo adicional 4: Tabla S3 ). También extrajimos múltiples alineaciones de secuencia correspondientes a anotado D. melanogaster 5 ′ UTR y 3 ′ UTR, asignando cada UTR a uno de los cinco contenedores en función de sus tasas de conservación de UTR de fondo [20]. Para cada contenedor, calculamos árboles filogenéticos con una topología de árboles de especies fijas que abarcó 27 especies de insectos, lo que permitió que las longitudes de las ramas variables capturaran tasas de sustitución más lentas o más rápidas entre las UTR del contenedor (Fig. 2a). Estos árboles se utilizaron luego para asignar una puntuación de longitud de rama (BLS) [17] a cada ocurrencia de motivo en D. melanogaster UTR, que cuantificaron el grado de conservación de esa ocurrencia controlando la tasa de conservación de fondo de su contexto general de UTR [57]. Por ejemplo, a una ocurrencia de motivo detectada entre todas las especies de Sophophora en la alineación de UTR 3 'se le asignaría un BLS de 4.50, 2.53 o 1.69, dependiendo de si la UTR 3' correspondiente en la que residía estaba en la primera, tercera o quinto contenedor de conservación, respectivamente (Fig. 2a).

Conservación evolutiva de sitios canónicos en Drosophila 5 ′ UTR y 3 ′ UTR. a Árbol filogenético de las 27 especies utilizadas para examinar la conservación del sitio de miARN. Grupos externos del género Drosophila incluir Musca domestica (la mosca doméstica), Anopheles gambiae (El mosquito), Apis mellifera (la abeja europea), y Tribolium castaneum (el escarabajo rojo de la harina). D. melanogaster Las UTR 3 'se asignaron a uno de los cinco contenedores de conservación basándose en la conservación media de nucleótidos en toda la UTR 3'. El árbol se dibuja utilizando las longitudes de las ramas y la topología informada de las alineaciones de todo el genoma en UCSC Genome Browser. A la izquierda del árbol, están codificado por colores puntajes de longitud de rama correspondientes a un sitio conservado entre un subgrupo completo de especies indicado por una barra del mismo color, que muestra puntajes para un sitio dentro de un UTR de 3 ′ en los contenedores de conservación más bajo, medio y más alto, etiquetados entre paréntesis como contenedores 1, 3 o 5, respectivamente. B, C Relaciones de señal a fondo para los tipos de sitios indicados en cortes de longitud de rama crecientes, calculados para sitios ubicados en UTR de 3 ′ (B) o UTR de 5 ′ (C). Líneas discontinuas indican límites de confianza un 5% más bajos (prueba z). Estos paneles se modelaron a partir del que se mostró originalmente para el análisis de sitios 3 ′ UTR de mamíferos [57]. D, mi Señal sobre el fondo para los tipos de sitios indicados en cortes de longitud de rama crecientes, calculados para sitios ubicados en UTR de 3 ′ (D) o UTR de 5 ′ (mi). Líneas discontinuas indican límites de confianza un 5% más bajos (prueba z). Estos paneles se modelaron a partir del que se mostró originalmente para el análisis de sitios 3 ′ UTR de mamíferos [57]. F Relaciones de señal a fondo para los sitios 8mer de 91 familias de semillas de miARN conservadas, calculadas a una sensibilidad casi óptima (un corte de longitud de rama de 1.0), comparando las razones observadas para sitios en UTR 5 ′ con las de sitios en UTR 3 ′ (rs Correlación de Spearman). Las familias de semillas conservadas desde el antepasado de los animales bilaterales se distinguen de las que surgieron más recientemente (naranja y azul, respectivamente). Diagramas de caja a los lados muestran las distribuciones de razones para estos dos conjuntos de familias, con significancia estadística para las diferencias en estas distribuciones evaluadas usando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon unilateral (*PAG & lt 0,01). Consulte también Archivo adicional 4: Tabla S3. gramo Relación entre la tasa de conservación del sitio y la eficacia de la represión. La fracción de sitios conservados por encima del fondo se calculó como ([Señal - Fondo] / Señal) con un límite de longitud de rama de 1,0. La fracción mínima de sitios que confieren desestabilización se determinó a partir de las distribuciones acumulativas (por ejemplo, las del archivo adicional 2: Figura S2), considerando el desplazamiento vertical máximo de la distribución sin sitio (barras de error, desviación estándar, norte = 6 miARN). Colores y formas representan los tipos de sitios canónicos y la ubicación de UTR, respectivamente. Este panel se modeló a partir del que se mostró originalmente para el análisis de sitios 3 ′ UTR de mamíferos [57]. h Relación entre la eficacia del sitio y el sitio PAGConnecticut. Los ARNm se seleccionaron para que tuvieran un sitio 7mer-A1, un 7mer-m8 o un sitio UTR 3 '8mer para el miARN transfectado y ningún otro sitio UTR 3' canónico. Los ARNm con sitios de cada tipo se agruparon en seis contenedores iguales según el sitio PAGConnecticut. Para cada bin, se representa gráficamente el cambio medio de veces del ARNm en los datos de transfección (barras de error, error estándar) con respecto a la media. PAGConnecticut, con el líneas puntedas mostrando el ajuste de mínimos cuadrados a los datos. Las pendientes para cada uno son negativas y significativamente diferentes de cero (PAG value & lt 10 - 10, regresión lineal usando datos no agrupados)

Para cada tipo de sitio de cada una de las 91 familias de miARN ampliamente conservadas, calculamos la "señal" como el número de veces que ese sitio ocurrió en D. melanogaster UTR y tenían un BLS que igualaba o sobrepasaba un valor particular (es decir, el "límite de longitud de rama"). En paralelo, también calculamos el "fondo" como el número de ocurrencias conservadas esperadas por casualidad, en función de la fracción media de instancias de motivos conservados para 50 coincidencias de longitud k-mer controles, cada uno de los cuales se predijo que tendría una conservación de fondo similar a la del sitio de miARN, según lo estimado a partir de las tasas de conservación de dinucleótidos agregados [57]. Esto nos permitió calcular una relación señal-fondo en cada corte de longitud de rama, que representaba el enriquecimiento estimado de sitios de miARN conservados preferentemente en las UTR de mosca (Fig. 2b yc). También nos permitió calcular la señal por encima del fondo, que representaba el número estimado de sitios de miARN que se han conservado preferentemente en las UTR de moscas (Fig. 2d y e).

Como se esperaba, las proporciones de señal a fondo aumentaron a medida que los criterios de conservación evolutivos se volvieron más estrictos, con 8mers en 3 ′ UTR alcanzando una proporción de casi cinco sitios conservados por cada sitio de control en los cortes de longitud de rama más grandes (Fig. 2b). ). Para cada tipo de sitio, las proporciones fueron consistentemente mayores en las UTR 3 ′ que en las UTR 5 ′ (Fig. 2b yc). Por ejemplo, en 5 ′ UTR, la relación señal / fondo para 8mers no superó 1,6 (Fig. 2c). Estos resultados mostraron que es más probable que los sitios se conserven si residen en 3 ′ UTR, presumiblemente porque es aquí donde también son más efectivos (Fig. 1). No obstante, al comparar las proporciones de señal a fondo para diferentes familias de miARN, las proporciones en 5 ′ UTR se correlacionaron con las de 3 ′ UTR (Fig. 2f Archivo adicional 4: Tabla S3). Las mayores proporciones tendían a ser para las familias de miARN de mosca que se han conservado desde el antepasado de los animales bilaterales (Fig. 2f), como podría esperarse de estas familias antiguas que han tenido más tiempo para adquirir más roles en las redes reguladoras de genes.

Aunque la jerarquía de señal a fondo de conservación de secuencia de 8mer & gt 7mer & gt 6mer observada tanto en 5 'como en 3' UTR coincidía con la jerarquía observada para la eficacia, se observaron algunas diferencias. Más notablemente, la señal de conservación para el sitio 6mer fue robustamente por encima del fondo, mientras que los de los sitios 6mer y 6mer-A1 compensados ​​eran indistinguibles del fondo (Fig.2b), a pesar de que estos tres sitios de 6-nt tenían eficacias similares en nuestro análisis. datos de represión (Fig. 1c). Por el contrario, el sitio 5 'UTR 7mer-A1 exhibió una señal detectable para la conservación (Fig. 2b), aunque no tuvo una eficacia detectable en la mediación de la represión (Fig. 1c).

Para sitios tanto en 3 ′ como en 5 ′ UTR, la señal por encima del fondo alcanzó su punto máximo cerca de un límite de longitud de rama de 1.0 (Fig. 2d). En este y otros puntos de corte de longitud de rama, la señal por encima del fondo fue mucho más alta en el 3 ′ UTR que en el 5 ′ UTR (Fig.2d y e), lo que puede atribuirse a una mayor fracción de los sitios preferentemente conservados en 3 ′ UTR, como lo indica la mayor relación señal / fondo en 3 ′ UTR, y más sitios que residen en 3 ′ UTR, principalmente como consecuencia de que las 3 ′ UTR generalmente son más largas que las 5 ′ UTR. Incluyendo los tipos de sitios cuyos intervalos de confianza más bajos del 5% excedieron cero, nuestros resultados proporcionaron una estimación de

12,285 sitios conservados por encima del fondo en 3 ′ UTRs (2738 ± 31 8mer, 2837 ± 68 7mer-m8, 4062 ± 100 7mer-A1, 2128 ± 221 sitios 6mer y 520 ± 244 sitios 6mer compensados, calculados en un corte de longitud de rama de 1.0 y reportado ± 90% de intervalo de confianza) (Fig. 2d). Cuando se agrega a nuestra estimación de

840 sitios conservados por encima del fondo en 5 ′ UTR (350 ± 18 8mer, 165 ± 46 7mer-m8 sitios y 325 ± 44 7mer-A1 sitios) (Fig.2e), el número estimado de sitios UTR preferentemente conservados en Drosophila UTR totalizó

13,125. Las simulaciones que consideraron todas las instancias conservadas de tipos de sitios, y luego contabilizaron aquellas que se estimaron conservadas al azar en 5 ′ UTR y 3 ′ UTR, indicaron que estos 13,125 sitios conservados preferentemente residen dentro de 5035 ± 83 (90% de confianza intervalo) de los 13.550 mRNA únicos con UTR anotadas de Drosophila, lo que implica que los mRNA del 37,2% ± 0,6% de los genes de Drosophila son dianas conservadas de los miRNA ampliamente conservados.

La comparación adicional de los resultados de nuestros análisis de la conservación del sitio y la eficacia del sitio reveló que, como se observó en los sitios 3 ′ UTR de mamíferos [57], hubo una correlación sorprendente entre la fracción de sitios conservados por encima del fondo para cada tipo de sitio y la fracción correspondiente. de sitios que median la desestabilización del ARNm (Fig. 2g). Ligeramente desviados de esta tendencia se encontraban los sitios 3 ′ UTR 6mer-A1, que parecían mediar algo de represión a pesar de carecer de una señal para la conservación, y los sitios 5′UTR 7mer-A1, que tenían una modesta señal para la conservación a pesar de la eficacia indetectable de la represión (Fig. .2g).

Para estimar el grado en que cada instancia de cada uno de los tres sitios más efectivos se ha conservado preferentemente, calculamos la probabilidad de focalización conservada (PAGConnecticut) puntuación para cada uno de los sitios 8mer, 7mer-m8 y 7mer-A1 que residen en D. melanogaster 3 ′ UTR. PAGConnecticut las puntuaciones, que van de 0 a 1, resumen la probabilidad estimada de que un sitio determinado se haya conservado evolutivamente debido a su apareamiento con el miARN afín, mientras se controlan otros factores, como su longitud, el contexto genómico circundante y el contenido de dinucleótidos [57 ]. Estas puntuaciones proporcionan un recurso valioso para los biólogos que deseen centrarse en las interacciones de focalización conservadas. También pueden ayudar a predecir la eficacia de la focalización [51, 57]. De hecho, los sitios con mayor PAGConnecticut los puntajes tendían a conferir más represión (Fig. 2h), lo que implica que, como se esperaba, los sitios conservados tenían más probabilidades de residir en contextos que favorecían su eficacia.

Funciones útiles para predecir la eficacia del sitio en moscas

Antes de comenzar a explorar las características del contexto del sitio asociadas con la eficacia del sitio, mejoramos las anotaciones 3 ′ UTR en las células S2, la línea celular en la que habíamos adquirido nuestros datos funcionales. Razonamos que una anotación más precisa de estos UTR nos permitiría reducir el impacto de los sitios falsos positivos mientras ponderamos adecuadamente los sitios por la frecuencia de su inclusión dentro de las isoformas 3 ′ UTR [51, 60]. El conocimiento de abundantes isoformas alternativas 3 'UTR para los ARNm de un gen también proporcionaría una evaluación más informada de las características relacionadas con 3' UTR, como la longitud de 3 'UTR y la distancia desde el extremo 3' UTR más cercano. En consecuencia, identificamos y cuantificamos las isoformas 3 ′ UTR de las células S2 utilizando perfiles de posición poli (A) mediante secuenciación (3P-seq) [20]. Aunque la mayoría de los sitios poli (A) compatibles con 3P-seq correspondían a isoformas 3 ′ UTR que habían sido previamente anotadas por FlyBase o un estudio a gran escala que anotó sitios poli (A) adicionales [61], casi el 47% de los sitios poli (A) soportados por 3P-seq no se correspondían con las anotaciones existentes, y la mayoría de estos nuevos sitios podrían estar vinculados a un gen cercano con el apoyo de la evidencia de RNA-seq (Fig. 3a). En los casos en los que la isoforma de 3 ′ UTR más larga para un gen anotado usando 3P-seq difería de la anotada en FlyBase, fue más a menudo más larga, aunque para casi 1000 genes los resultados de 3P-seq implicaron el uso dominante de un 3 ′ más corto Isoforma UTR en células S2 (Fig. 3b). Con esta información, compilamos un conjunto de 3826 ARNm que pasaron nuestro umbral de expresión en las células S2 y para los cuales ≥ 90% de las etiquetas 3P-seq correspondían a una única isoforma dominante 3 ′ UTR en estas células, y usamos este conjunto para investigar las características del contexto del sitio asociadas con la eficacia del sitio.

Refinamiento de las anotaciones 3 ′ UTR en células S2 y desarrollo de un modelo de regresión que predice la eficacia de direccionamiento de miARN en Drosophila. a Sitios poli (A) detectados en células S2 por 3P-seq, clasificados con respecto a su estado de anotación anterior. B Extensión y contracción de las isoformas 3 ′ UTR más largas en relación con las anotaciones FlyBase. Para cada gen con un sitio poli (A) detectado usando 3P-seq, la diferencia entre la isoforma 3 'UTR más larga anotada usando 3P-seq se comparó con la isoforma 3' UTR más larga anotada en FlyBase. A continuación, estas diferencias se clasificaron como se indica y se trazó el número de sitios asignados a cada ubicación. C Optimización de la puntuación del apareamiento suplementario 3 ′ predicho en moscas. Se calcularon las puntuaciones de energía termodinámica previstas para el emparejamiento entre una región de 9 nt aguas arriba de los sitios canónicos 3'UTR de 7 a 8 nt y una región de longitud variable del miARN con el tamaño indicado (tamaño de ventana) que comenzaba en la posición indicada del miARN. los mapa de calor muestra las correlaciones parciales entre estas puntuaciones y la represión asociada con los sitios correspondientes, determinadas mientras se controla el tipo de sitio. D Optimización de la puntuación de accesibilidad estructural prevista en moscas. Los puntajes de accesibilidad estructural de ARN predichos se calcularon como las probabilidades de emparejamiento promedio para regiones de longitud variable (tamaño de ventana) que se centraron en la posición de ARNm indicada, mostrada con respecto a la coincidencia de semillas de cada sitio canónico de 7–8 nt 3 ′ UTR. los mapa de calor muestra las correlaciones parciales entre estos valores y la represión asociada con los sitios correspondientes, determinadas mientras se controla por tipo de sitio. mi Las contribuciones del tipo de sitio y cada una de las seis características del modelo de contexto. Para cada tipo de sitio, los coeficientes de la regresión lineal múltiple se trazan para cada característica. Debido a que las características se puntuaron en una escala similar, la contribución relativa de cada característica en la discriminación entre sitios más o menos efectivos fue aproximadamente proporcional al valor absoluto de su coeficiente. También se trazan las intersecciones, que indican aproximadamente el poder discriminatorio del tipo de sitio. Barras indicar los intervalos de confianza del 95% de cada coeficiente. Consulte también el archivo adicional 2: Tabla S4, Tabla S5 y Figura S3A

Con este conjunto de ARNm y valores de represión en la mano, examinamos dos de las características más complejas del contexto del sitio, confirmando sus efectos en las células de Drosophila y desarrollando esquemas de puntuación que se correlacionaban mejor con su influencia en estas células. La primera de estas dos características fue el emparejamiento suplementario 3 ', es decir, el emparejamiento con el objetivo mediante nucleótidos de miARN fuera de la región de la semilla. La fuerza de este emparejamiento se evaluó como la energía termodinámica predicha del emparejamiento entre la región 3 'del miARN y una región de ARNm correspondiente aguas arriba de la coincidencia de semillas. Esta energía predicha de emparejamiento se evaluó para los ARNm que poseían un único sitio UTR de 7 a 8 nt en 3 'para el miARN transfectado y luego se comparó con la represión observada para los ARNm en la transfección de miARN calculando una correlación parcial entre las energías de emparejamiento suplementarias 3' y cambios de ARNm, controlando el tipo de sitio.

En células de mamíferos, el apareamiento suplementario 3 'es más influyente cuando se centra en los nucleótidos 13-17 [37], pero en las moscas no se han identificado las posibilidades de apareamiento más importantes para la represión. Para examinar sistemáticamente estas posibilidades, variamos tres parámetros: (1) la posición de inicio de la región de miRNA considerada, examinando todas las posibilidades de inicio desde las posiciones 9 a 19, (2) la longitud de la región de miRNA considerada, examinando longitudes de 4 a 13 nt, y (3) la longitud de la región objetivo aguas arriba de la coincidencia de semillas, examinando longitudes de 4 a 20 nt. Una búsqueda en cuadrícula de todas las combinaciones de parámetros reveló que la energía predicha de la energía de emparejamiento suplementaria 3 ′ fue óptimamente predictiva de la eficacia de la represión cuando se calculó para el emparejamiento que puede ocurrir entre los nucleótidos de miARN 13-17 y una región de 9 nt corriente arriba de la semilla. partido (Fig. 3c).

La segunda característica que investigamos fue la influencia de la estructura 3 ′ UTR en la accesibilidad del sitio de destino. Esta característica ha sido evaluada previamente usando dos enfoques, ya sea evaluando la composición de nucleótidos cerca del sitio, razonando que los sitios que residen en un alto contenido de AU local serían más accesibles [37], o intentando predecir la accesibilidad del sitio usando varios algoritmos de plegamiento de ARN [38, 51, 62,63,64,65]. Con respecto al segundo enfoque, un método desarrollado originalmente para predecir la accesibilidad del sitio objetivo de ARN de interferencia pequeño (ARNip) [62] parece ser uno de los métodos más eficaces para predecir la accesibilidad del sitio objetivo de miARN en mamíferos [51]. Este método pliega la región de 80 nt centrada en la coincidencia de semillas y luego reporta una puntuación de accesibilidad estructural (SA) calculada como las probabilidades no apareadas medias para una ventana más pequeña en las proximidades de la coincidencia de semillas [51, 62]. Para determinar la ubicación óptima y el ancho de esta ventana para calificar SA en moscas, nuevamente calculamos correlaciones parciales, esta vez entre las probabilidades medias de emparejamiento y los cambios de ARNm, variando dos parámetros: (1) la posición del centro de la ventana dentro del objetivo ARNm, examinando cada posición dentro de los 20 nt de la coincidencia de semillas, y (2) el tamaño de esta ventana, considerando tamaños de 1 a 25 nt. Una búsqueda en cuadrícula sobre todas las combinaciones de parámetros indicó que una ventana de 25 nt centrada en el nucleótido que se empareja con la posición 7 del miARN era óptima para calcular SA en moscas (Fig. 3d). Aunque el tamaño de ventana óptimo cayó en el borde del rango, las ventanas más grandes no se consideraron porque eran más propensas a extenderse más allá de los límites de 3 ′ UTR, lo que redujo el tamaño de la muestra.

Un modelo cuantitativo para predecir la eficacia del sitio en moscas

Para identificar y evaluar características adicionales asociadas con la eficacia del sitio en moscas y generar un recurso para colocar miARN de mosca en redes reguladoras de genes, desarrollamos un modelo cuantitativo de eficacia de focalización de miARN para moscas, que se asemeja a nuestros modelos desarrollados para mamíferos [37, 51, 66 ]. El alcance más pequeño de nuestro conjunto de datos de moscas impuso algunas limitaciones en las características que pudimos examinar en las moscas, así como en la estrategia utilizada para entrenar el modelo. En particular, la cantidad de ejemplos de entrenamiento fue un orden de magnitud menor en el conjunto de datos de moscas en relación con el conjunto de datos humanos. Esto se debió a (1) menos conjuntos de datos de transfección de ARN pequeño en las células S2 en comparación con los disponibles en las células HeLa, (2) un número menor de genes expresados ​​en las células S2 en comparación con los expresados ​​en las células HeLa y (3) más cortos 3 ′ UTR en moscas, lo que disminuyó aún más el número de 3 ′ UTR con un sitio para un miARN de interés. Por lo tanto, no consideramos las características relacionadas con la identidad de la semilla de miARN, como la abundancia estimada del sitio objetivo dentro del transcriptoma, la estabilidad predicha del emparejamiento de semillas y la identidad de nucleótidos en el miARN o la posición objetivo 8, que son informativas para predecir la eficacia de la focalización en células humanas [51, 66]. Además, en lugar de considerar las características de cada tipo de sitio de forma independiente, entrenamos un único modelo de regresión unificado que consideraba el tipo de sitio en sí mismo como una característica potencial de la orientación. Además del tipo de sitio, otras siete características de los sitios y su contexto circundante y nueve características de los ARNm diana se consideraron como potencialmente informativos de la eficacia de la orientación, ya sea porque se había demostrado previamente que se correlacionan con la eficacia de la orientación en moscas o mamíferos, o porque se relacionaron con características que se ha demostrado que se correlacionan con la eficacia (Tabla 1).

Comenzando con estas características, entrenamos modelos de eficacia de focalización utilizando una variedad de algoritmos de aprendizaje automático. Para evaluar cada algoritmo, dividimos nuestro conjunto de datos en 1000 muestras de arranque para estimar el rendimiento de la predicción retenida.Cada muestra incluyó el 70% de los ARNm con un único sitio UTR de 7–8 nt 3 ′ de cada experimento de transfección de miARN (seleccionado al azar sin reemplazo) y reservamos el 30% restante para la prueba. Entre los diferentes algoritmos, una estrategia de regresión escalonada que maximizó el criterio de información de Akaike (AIC) condujo al mejor rendimiento empírico (archivo adicional 2: Figura S3A). Esta estrategia de regresión paso a paso fue el mismo algoritmo que habíamos utilizado recientemente para construir un modelo de eficacia dirigida a miARN de mamíferos [51]. En relación con un modelo que consideró solo el tipo de sitio (el modelo de "solo sitio"), el modelo de regresión paso a paso que consideró las características del contexto del sitio mejoró de dos a tres veces en la predicción de las mediciones de cambio de pliegues de ARNm (mediana r 2 de 0,08 y 0,19, respectivamente PAG & lt 0.001, prueba de rango con signo de Wilcoxon emparejado Archivo adicional 2: Figura S3A).

A primera vista, un r 2 de solo 0.19 para el mejor algoritmo podría parecer una preocupación, ya que implica que el método representa solo el 19% de la variabilidad observada en nuestros conjuntos de datos. Sin embargo, ningún modelo de focalización de miRNA puede explicar la variabilidad derivada del ruido experimental o de los efectos secundarios de la represión de los objetivos primarios, que en conjunto contribuyen con una gran fracción de la variabilidad observada en los conjuntos de datos de transfección de miRNA. De hecho, nuestro análisis de los cambios observados para los objetivos predichos de un miARN cuando se transfectó otro miARN indicó que el ruido experimental y los efectos secundarios juntos representaron casi la mitad de la variabilidad observada en nuestros conjuntos de datos, lo que implica que un modelo perfecto de orientación directa podría explicar en la mayoría del 52% de la variabilidad (Archivo adicional 2: Figura S3B). Por lo tanto, la r 2 de 0,19, que se parecía al obtenido en análisis de mamíferos [51], implicaba que el modelo explicaba

37% de la variabilidad atribuible a la focalización directa.

Las características más informativas para el modelo de regresión escalonada fueron presumiblemente las que tenían el mayor impacto en la eficacia del sitio en las moscas. Para identificar estas características clave, cuantificamos el porcentaje de muestras bootstrap en las que se eligió cada característica (Tabla 1). Se seleccionaron siete de las 17 características en ≥ 90% de las muestras de bootstrap (Tabla 1), y los modelos de regresión lineal múltiple entrenados con solo estas siete características se desempeñaron al menos tan bien como aquellos que consideraron las 17 características (mediana r 2 de 0,20 Archivo adicional 2: Figura S3A). Aparte del tipo de sitio, que se ha considerado durante mucho tiempo en TargetScanFly [8], estas características seleccionadas de manera sólida incluyeron tres características del sitio: energía del emparejamiento suplementario 3 '(3P_energy), SA y conservación evolutiva (PAGConnecticut) y tres características del ARNm: longitud de ORF (len_ORF), longitud de UTR 3 '(len_3UTR) y el número de sitios débiles dentro del ARNm (otros_sitios) (Tabla 1). En particular, todas estas características se seleccionaron previamente al modelar la eficacia del sitio en mamíferos [51], con el matiz de que en las moscas 3P_energy superó a 3P_score, otro método para evaluar el emparejamiento suplementario 3 ′ que se había optimizado en datos de mamíferos [37]. Sin embargo, dos características fuertemente asociadas con la eficacia del sitio en mamíferos no fueron seleccionadas de manera consistente en el análisis de moscas. Estos incluyeron la composición de AU en la vecindad del sitio objetivo (local_AU) y la distancia mínima de un sitio desde los límites 3 ′ UTR (min_dist) [37]. Quizás estas características no discriminaban fuertemente los objetivos efectivos de los ineficaces en las moscas porque, en comparación con las 3 ′ UTR de mamíferos, las moscas 3 ′ UTR son constitutivamente más ricas en AU y mucho más cortas. (La longitud mediana de 3 ′ UTR es 661 nt y 202 nt para humanos y moscas, respectivamente, considerando la anotación UTR más larga por gen después de eliminar los genes con las anotaciones UTR más largas ≤2 nt).

Usando las siete características seleccionadas consistentemente y todo el conjunto de datos de 3 ′ UTR que contienen sitios únicos 7mer-A1, 7mer-m8 u 8mer, entrenamos modelos independientes de regresión lineal múltiple para cada uno de estos tres sitios canónicos. Estos tres modelos se combinaron luego para generar un modelo para la focalización de miRNA de mosca, que llamamos el "modelo de contexto" porque se parecía a nuestros modelos de contexto desarrollados para la focalización de miRNA de mamíferos en que modelaba el contexto del sitio además del tipo de sitio. El signo de cada coeficiente reveló la relación de cada característica con la represión (Fig. 3e). Por ejemplo, los ARNm con ORF más largos o UTR 3 'más largos, y los sitios con energía de emparejamiento suplementaria 3' más débil eran más refractarios a la represión (como lo indica un coeficiente positivo), mientras que los sitios diana que eran más estructuralmente accesibles o más conservados, y los ARNm con otros sitios débiles eran más propensos a la represión (como lo indica un coeficiente negativo). La normalización de las puntuaciones de cada característica a una escala similar permitió evaluar la contribución relativa de cada característica al modelo de contexto (Fig. 3e). Como era de esperar, el tipo de sitio también fue un predictor importante de represión en el modelo, como lo indica la gran magnitud del término de intersección (Fig. 3e). Los signos y las magnitudes relativas de las características en gran parte fueron paralelos a los encontrados en los mamíferos [51], lo que indica que la influencia de estas características podría reflejar aspectos conservados evolutivamente de los miRNA dirigidos a especies bilaterales. Una diferencia fue que PAGConnecticut Los puntajes contribuyeron relativamente más al modelo de contexto de la mosca que al modelo análogo de mamíferos [51], lo que implica que la detección y puntuación de las características moleculares de la eficacia del objetivo tienen más margen de mejora en las moscas, presumiblemente porque hay menos datos disponibles en las moscas. para la identificación y evaluación de características.

Comparación con el rendimiento de métodos anteriores

A continuación, comparamos el rendimiento del modelo de contexto de mosca con el de los métodos informados anteriormente, midiendo con qué éxito cada método predijo y clasificó los ARNm que responden a la ganancia o pérdida de un miARN en Drosophila. Para el entrenamiento, nuestro modelo de contexto había considerado solo los ARNm que tenían un único sitio de 7-8 nt para el miARN afín dentro de su 3 ′ UTR, pero para las pruebas era necesario extenderlo a los ARNm que tenían múltiples sitios para el mismo miARN dentro de su 3 ′ UTR. En consecuencia, para cada objetivo predicho, generamos una puntuación de contexto total, calculada como la suma de las puntuaciones de contexto de los sitios al miRNA afín [37], y usamos estas puntuaciones de contexto totales para clasificar todos los objetivos predichos para cada miRNA. La respuesta de los objetivos mejor clasificados se comparó luego con la de los 14 métodos informados anteriormente, elegidos porque las predicciones para los objetivos de Drosophila estaban disponibles en línea, al igual que la información necesaria para clasificar las predicciones. Habiendo generado ya el PAGConnecticut puntuaciones de los sitios de Drosophila, también combinamos las puntuaciones de múltiples sitios canónicos de 7 a 8 nt cuando están presentes dentro de las mismas UTR de 3 ′ para generar agregados PAGConnecticut puntuaciones, que también se utilizaron para clasificar las predicciones basándose únicamente en la probabilidad de que fueran objetivos preferentemente conservados del miARN [57].

Tomamos precauciones para realizar una comparación justa de los algoritmos. Primero, para cada algoritmo, consideramos solo los objetivos predichos que correspondían a los ARNm expresados ​​por encima del umbral de cuantificación en la muestra del conjunto de prueba relevante que carece del miARN. En segundo lugar, evitamos probar el modelo de contexto en los mismos datos de transfección sobre los que se entrenó. Más específicamente, implementamos una estrategia de validación cruzada al probar los resultados del modelo de contexto utilizando los conjuntos de datos de transfección, manteniendo secuencialmente cada conjunto de datos y volviendo a entrenar los coeficientes para las características en nuestro modelo de contexto utilizando los cinco conjuntos de datos de transfección restantes antes de generar predicciones para el conjunto de datos retenido. Reducir aún más la preocupación por el sobreajuste fue la observación de que la mayoría de los objetivos mejor clasificados contenían dos o más sitios canónicos de 3 ′ UTR y, por lo tanto, no se utilizaron durante el desarrollo y entrenamiento de nuestro modelo. En tercer lugar, para todas las pruebas del modelo de contexto, utilizamos coeficientes reentrenados en anotaciones FlyBase 3 ′ UTR disponibles públicamente, razonando que el entrenamiento en anotaciones 3 ′ UTR mejoradas derivadas de nuestros datos 3P-seq habría impartido una ventaja a nuestro modelo.

Otra consideración clave para la comparación justa del desempeño de la predicción es la elección del enfoque utilizado para evaluar el desempeño. El uso de métodos estándar para evaluar un clasificador binario, como una curva de característica operativa del receptor (ROC), no es apropiado por varias razones. En primer lugar, para las predicciones de objetivos de miARN, no existe un conjunto adecuado de verdaderos positivos o negativos verdaderos conocidos, porque las bases de datos de objetivos validados pasan por alto muchos de los objetivos reales y están fuertemente sesgadas a favor de los algoritmos de predicción utilizados para identificar los candidatos objetivo que luego son validado. En ausencia de conjuntos adecuados de positivos y negativos conocidos, los análisis de ROC se pueden realizar utilizando los efectos moleculares de perturbar el miARN, pero este enfoque requiere elegir un umbral para separar los ARNm que responden de los que no lo hacen. La elección de un umbral estricto omite muchos de los objetivos auténticos, mientras que la elección de un umbral menos estricto que tenga la posibilidad de capturar la mayoría de los objetivos auténticos genera demasiados falsos positivos. Los problemas con las curvas ROC se complican al intentar comparar el rendimiento de diferentes algoritmos, algunos de los cuales predicen 100 veces más objetivos que otros. Elegir un límite de alta rigurosidad no hace justicia a los algoritmos que proporcionan muchas predicciones con el objetivo de lograr una mayor sensibilidad de predicción, mientras que elegir un límite de baja rigurosidad es injusto para los algoritmos que proporcionan relativamente pocas predicciones en un esfuerzo por lograr una mayor predicción. especificidad. Además, el uso de un umbral binario oscurece la precisión con la que los algoritmos clasifican sus objetivos predichos. Por estas razones, no es apropiado reformular el fenómeno cuantitativo del direccionamiento de miARN como un problema de clasificación binaria, y no es posible comparar de manera justa el desempeño de la predicción usando curvas ROC.

Reconociendo estos problemas, se ha desarrollado un nuevo enfoque para evaluar el rendimiento de predicción de objetivos de miARN [67], que primero implementamos utilizando nuestros seis conjuntos de datos, cada uno de los cuales examinaba los cambios de ARNm después de transfectar un miARN en células S2 (Fig. 4a). Para cada algoritmo y cada miARN transfectado, calculamos el cambio de veces medio de ARNm de los objetivos mejor clasificados del miARN transfectado y luego graficamos el valor medio de los seis miARN diferentes en varios umbrales de clasificación, resumiendo así la eficacia de represión de los primeros clasificados. objetivos en cada umbral. Este enfoque de graficar la represión media sobre un rango de umbrales de clasificación tiene varias características clave que lo hacen adecuado para comparar de manera justa el rendimiento de la predicción de objetivos: (1) Está diseñado para probar el rendimiento utilizando mediciones moleculares globales y, por lo tanto, no requiere el conocimiento de verdaderos positivos. y verdaderos negativos, (2) utiliza un umbral deslizante y por lo tanto permite comparaciones simultáneas en todos los límites de rigurosidad, (3) su umbral deslizante es muy adecuado para evaluar la capacidad de los algoritmos para clasificar los objetivos predichos (dada por la relación entre la represión media y umbral de rigurosidad).

Actuaciones de diferentes algoritmos de predicción de objetivos en moscas. a La capacidad diferencial de los algoritmos para predecir los ARNm más sensibles a los miARN transfectados en células de Drosophila. Se muestra para cada algoritmo en el llave son los cambios medios del pliegue del ARNm observados para las dianas pronosticadas mejor clasificadas, evaluadas sobre un umbral de sensibilidad deslizante utilizando los seis conjuntos de datos de transfección de miARN. Algunos métodos, como PicTar, que generó relativamente pocas predicciones, pudieron evaluarse en solo unos pocos umbrales, mientras que otros, como RNA22 y TargetSpy, podrían evaluarse en muchos más. Para cada algoritmo, las predicciones para cada uno de los seis miARN se clasificaron de acuerdo con sus puntuaciones, y los valores medios de cambio de veces se trazaron en cada umbral de sensibilidad. Por ejemplo, en un umbral de 16, se identificaron las 16 predicciones principales para cada miARN (sin considerar las predicciones de los ARNm expresados ​​demasiado bajos para cuantificarlos con precisión). Los valores de pliegue de ARNm para estas predicciones se recogieron a partir de las transfecciones afines, y se calcularon los valores medios de pliegue de cambio para cada transfección para la que el umbral no excedió el número de predicciones informadas. A continuación, se representó gráficamente la media de los valores medios disponibles. También se representa gráficamente la media de los cambios medios en el pliegue del ARNm para todos los ARNm con al menos un sitio canónico afín de 7 a 8 nt en su 3 ′ UTR (Linea discontinua), la media del cambio de veces medio para todos los ARNm con al menos un sitio canónico análogo conservado de 7 a 8 nt en su 3 ′ UTR (linea punteada) y el intervalo de confianza del 95% para los cambios de veces promedio de los ARNm seleccionados al azar, determinados usando 1000 remuestreos (sin reemplazo) en cada punto de corte (sombreado). Los sitios se consideraron conservados si sus puntajes de longitud de rama excedían un límite con una relación señal: fondo de 2: 1 para el tipo de sitio correspondiente (límites de 1.0, 1.6 y 1.6 para los sitios 8mer, 7mer-m8 y 7mer-A1, respectivamente Fig. 2b). Se indican los umbrales en los que la distribución de los cambios de pliegues para los objetivos predichos del modelo de contexto fue significativamente mayor que la de cualquier otro modelo (*, prueba de suma de rangos de Wilcoxon unilateral, PAG valor & lt 0.05). Consulte también Archivo adicional 2: Figura S4. B La capacidad diferencial de los algoritmos para predecir los ARNm que responden mejor a la eliminación de miARN en las moscas. Se muestra para cada algoritmo en el llave son los cambios medios del pliegue del ARNm observados para las dianas pronosticadas mejor clasificadas, evaluadas sobre un umbral de sensibilidad deslizante utilizando los tres conjuntos de datos knockout. De lo contrario, este panel es como en a. C y D La capacidad diferencial de los algoritmos para predecir objetivos que responden al miARN a pesar de carecer de un sitio canónico 3 ′ UTR de 7–8 nt. Estos paneles son como en a y B, excepto que trazan los resultados solo para los objetivos predichos que carecen de un sitio canónico de 7 a 8 nt en su 3 ′ UTR. No se muestran los resultados de nuestro modelo de contexto y otros algoritmos que solo predicen objetivos con sitios canónicos de 7–8 nt 3 ′ UTR. En cambio, los resultados se muestran para un modelo de contexto de 6mer, que considera solo los efectos aditivos de los sitios 6mer, 6mer offset y 6mer-A1 y sus características de contexto correspondientes. mi y F La dificultad de predecir los ARNm que responden a la transfección o desactivación de miARN a pesar de que carecen de sitios canónicos de 6 a 8 nt 3 ′ UTR. Estos paneles son como en C y D, respectivamente, excepto que trazan los resultados de los ARNm con 3 ′ UTR que carecen de un sitio canónico de 6 a 8 nt

Al aplicar este análisis de rendimiento, encontramos que todos los algoritmos excepto RNA22 predijeron objetivos reprimidos mejor de lo esperado por casualidad (Fig. 4a). Sin embargo, algunos, incluidos ComiR, PicTar, MinoTar, RNAhybrid, TargetSpy y mirSVR, se desempeñaron de manera similar o peor que una estrategia ingenua de seleccionar todos los ARNm que tienen al menos un sitio canónico de 7-8 nt en su UTR 3 ′. De los algoritmos informados anteriormente, TargetScanFly, EMBL y PITA.Top obtuvieron los mejores resultados. Sin embargo, nuestro modelo de contexto funcionó mejor que todos los métodos anteriores, proporcionando predicciones que respondieron mejor a la transfección del miARN en cada umbral probado (Fig. 4a).

Aunque nuestra estrategia de validación cruzada evitó probar nuestro modelo en las mismas medidas que se usaron para su entrenamiento, persistieron algunas preocupaciones con respecto a las pruebas en los datos de transfección, porque estos datos se usaron para optimizar la puntuación de algunas características de nuestro modelo. Además, la transfección introduce altas concentraciones de miARN en las células en las que normalmente no actúan, lo que plantea la preocupación de que un modelo desarrollado y probado únicamente en conjuntos de datos de transfección no pueda predecir con precisión la respuesta de los miARN en sus contextos fisiológicos endógenos. Por lo tanto, buscamos un conjunto de pruebas que no se había utilizado para desarrollar ninguno de los algoritmos y que monitoreaba la respuesta del transcriptoma a los miARN endógenos expresados ​​a niveles fisiológicos. En lugar de monitorear la nueva represión observada tras la adición ectópica de un miARN, un conjunto de pruebas de este tipo examinaría la des-represión observada tras la pérdida de un miARN endógeno. Examinando la literatura de Drosophila, identificamos tres conjuntos de datos de knockout de miARN con señales convincentes para la eliminación de la represión. Combinando estos conjuntos de datos, que monitorearon los cambios de ARNm después de eliminar miR-14 [31], miR-34 [32] o miR-277 [33], y llevando a cabo el mismo tipo de análisis que habíamos hecho para los conjuntos de datos de transfección ( pero el seguimiento de la des-represión después de la pérdida de un miARN en lugar de la represión después de la introducción de un miARN) reveló comportamientos que en general se parecían a los observados con los conjuntos de datos de transfección (Fig. 4b). Los rendimientos relativos de los métodos anteriores cambiaron un poco, con una mejora observada para el agregado PAGConnecticut, miRanda-MicroCosm y PicTar y se observó un empeoramiento para MinoTar, TargetScanFly y TargetSpy. Sin embargo, es importante destacar que cuando se prueban estas consecuencias de la focalización de miARN endógeno en moscas, el modelo de contexto nuevamente se desempeñó mejor que todos los modelos anteriores. Los resultados de miR-277 se parecieron a los de los otros dos miRNA (datos no mostrados), aunque miR-277 es inusual porque reside principalmente en Ago2 en lugar de Ago1 [2].

El uso del cambio de pliegue medio para evaluar la represión (o des-represión) de los objetivos mejor clasificados tenía varias limitaciones potenciales. Por ejemplo, puede exagerar la influencia de valores atípicos individuales o conjuntos de datos de mayor peso con una mayor variación en sus distribuciones de cambio de pliegues. No obstante, el examen de las parcelas que muestran la media de la mediana de los cambios de ARNm no cambió sustancialmente nuestra evaluación del rendimiento relativo de cada algoritmo, lo que indicó que no llegamos a conclusiones erróneas debido a valores atípicos (archivo adicional 2: Figura S4). Otra advertencia potencial es que nuestros conjuntos de prueba que analizan los cambios de ARNm podrían perder objetivos que están reprimidos solo en el nivel de traducción, sin cambios en la estabilidad del ARNm.Aunque tal represión de solo traducción está generalizada en los embriones de peces tempranos [68, 69], el examen de embriones posteriores y células y tejidos de mamíferos post-embrionarios no ha logrado encontrar un conjunto de objetivos regulados de manera convincente solo en el nivel de traducción [69,70]. , 71], y no tenemos ninguna razón para sospechar que tales objetivos existen en las moscas post-embrionarias. También influyó potencialmente en nuestras comparaciones el hecho de que para algunos algoritmos anteriores faltaban predicciones para algunos miARN de nuestros conjuntos de prueba. Por ejemplo, las predicciones de EMBL no estaban disponibles para miR-263a y miR-994, y debido a que los objetivos de estos dos miARN pasaron a sufrir menos represión en nuestras transfecciones, la prueba de EMBL solo en el resto de los conjuntos de datos de transfección supuestamente infló su rendimiento relativo. .

Se han desarrollado algoritmos de predicción de objetivos con prioridades divergentes con respecto a la precisión de la predicción. Debido a la preocupación por la especificidad de la predicción, algunos, incluido nuestro modelo de contexto, consideran solo las predicciones con los tipos de sitios más efectivos, es decir, sitios con emparejamiento de semillas de 7 a 8 nt dentro de las UTR de 3 ′. Por el contrario, otros algoritmos, preocupados por la sensibilidad de la predicción, no limitan sus predicciones a aquellos con estos tipos de sitios más efectivos, y algunos de estos incluyen predicciones con una amplia gama de sitios no canónicos que no muestran evidencia de eficacia cuando se prueban. utilizando datos de mamíferos y peces [51]. Para comenzar a explorar las compensaciones de estas prioridades divergentes al predecir objetivos de miARN en moscas, eliminamos las predicciones que contienen sitios canónicos de 7-8 nt para el miARN afín en sus 3 ′ UTR, y probamos el comportamiento de las predicciones restantes que carecían de estos más. sitios canónicos efectivos. Al probar los datos de transfección, la mayoría de los algoritmos que no se centran estrictamente en 3 ′ UTR con sitios canónicos de 7-8 nt generaron predicciones que fueron reprimidas más de lo esperado por casualidad (Fig. 4c).

Alentados por estos resultados, utilizamos nuestras características de contexto para construir un modelo que consideró predicciones que carecían de sitios canónicos de 7 a 8 nt 3 ′ UTR pero que tenían al menos un sitio de desplazamiento 6mer, 6mer o 6mer-A1 en su 3 ′ UTR. Al usar cualquiera de los conjuntos de prueba y probar solo las predicciones que carecían de sitios canónicos de 7 a 8 nt 3 ′ UTR para el miARN afín, este modelo, que llamamos el modelo de "contexto 6mer", funcionó mejor que todos los algoritmos existentes, aunque una mejora estadísticamente significativa se observó en sólo dos umbrales cuando se probaron sobre la eliminación de la represión de objetivos endógenos (Fig. 4c yd). El otro algoritmo que produjo predicciones consistentemente reprimidas mejor que el fondo fue DIANA-microT-CDS, que incluye predicciones con solo sitios ORF canónicos. Por lo tanto, tomados en conjunto, nuestro análisis indica que dos estrategias distintas que se centran solo en sitios marginalmente efectivos pueden ser predictivas en moscas, a juzgar por los resultados de transfección y nocaut, un enfoque se centra en sitios canónicos de 6 nt en 3 ′ UTR, y el otro se centra en sitios ORF canónicos. Sin embargo, en el mejor de los casos, la represión promedio de las cuatro a ocho predicciones principales de estos enfoques fue mucho menor que la de los principales objetivos del modelo de contexto estándar y, en cambio, se asemejó a la de los cientos de ARNm que contenían 7-8 nt canónicos 3 ′ Sitios UTR (Fig. 4a-d).

La observación de que se podrían construir modelos que predijeran con éxito objetivos con solo sitios canónicos marginales fue consistente con la eficacia demostrada de estos sitios marginales en células de Drosophila (Fig. 1). Un desafío mayor ha sido predecir sitios no canónicos efectivos, que carecen de una coincidencia perfecta de al menos 6 nt con la región semilla. Aunque dos tipos de sitios no canónicos, conocidos como sitios complementarios 3 ′ y sitios centrados, pueden mediar en la represión, estos sitios son raros, de hecho tan raros que es difícil observar una señal de su acción en células de mamíferos sin agregar muchos conjuntos de datos [ 5, 72]. No obstante, algunos algoritmos producen muchas predicciones que solo tienen sitios no canónicos. Los análisis de conjuntos de datos de mamíferos indican que estas predicciones no están más reprimidas de lo esperado por casualidad [51], lo que plantea la cuestión de si alguno de los algoritmos podría predecir con éxito sitios no canónicos en Drosophila. Para responder a esta pregunta, utilizamos nuestros dos conjuntos de pruebas para medir la respuesta de las predicciones que carecían de cualquier sitio canónico de 6-8 nt al miARN afín en su 3 ′ UTR (Fig. 4e, f). Las únicas predicciones con una señal convincente por encima del fondo en cualquiera de los conjuntos de prueba fueron las de EMBL, DIANA-microT-CDS y MinoTar. El examen manual de las predicciones mejor clasificadas de EMBL reveló que la señal observada para sus predicciones era atribuible a sitios canónicos ubicados en ORF y 3 ′ UTR de últimos exones alternativos, mientras que la señal para las predicciones de DIANA-microT-CDS y MinoTar era atribuible a sitios ORF canónicos. Concluimos que en las moscas, como en los mamíferos [51], los sitios no canónicos solo rara vez median en la represión, aunque no podemos excluir la posibilidad formal de que los sitios no canónicos efectivos sean abundantes pero por alguna razón no se predijo por encima de los antecedentes por ninguno de los existentes. algoritmos.

TargetScanFly (v7)

Habiendo descubierto que el modelo de contexto funcionó mejor que los modelos que han estado proporcionando predicciones de objetivos a la comunidad de investigación de Drosophila (Fig. 4a, b), revisamos TargetScanFly (disponible en targetscan.org) para mostrar estas predicciones mejoradas. Debido a los rendimientos decrecientes de los objetivos de predicción con solo sitios marginales (Fig. 4c-f), continuamos limitando TargetScanFly a predicciones con sitios canónicos de 3 ′ UTR de 7 a 8 nt, con rangos impulsados ​​por una versión del modelo de contexto que fue entrenado en todo el conjunto de datos de transfección.

Para simplificar, hemos desarrollado el modelo de contexto utilizando ARNm sin abundantes isoformas alternativas 3 ′ UTR (Fig.3), y para hacer comparaciones justas con el resultado de modelos anteriores, hemos probado el modelo de contexto utilizando solo la isoforma anotada FlyBase más larga (Figura 4). Sin embargo, debido a que considerar el uso de isoformas alternativas 3 ′ UTR mejora significativamente el rendimiento de los modelos de focalización de miARN [51, 60], nuestra revisión de las predicciones de TargetScanFly incorporó tanto las puntuaciones de contexto como la información actual de isoformas al clasificar los ARNm con canónicos 7-8- nt sitios de miARN en sus 3 'UTR.

Debido a que las principales bases de datos de anotación de genes (p. Ej., Ensembl / FlyBase) todavía estaban en el proceso de incorporar la información disponible sobre las isoformas de 3 ′ UTR, el primer paso en la revisión fue compilar un conjunto de 3 ′ UTR de referencia que representaban la más larga Isoformas 3 'UTR para ORF representativos de la mosca. Estos ORF representativos se eligieron entre el conjunto de anotaciones de transcripción que comparten el mismo codón de parada, con los últimos exones alternativos que generan múltiples ORF representativos por gen. Para compilar este conjunto de UTR 3 ′ de mosca, comenzamos con anotaciones FlyBase [73] para las cuales se extendieron las UTR 3 ′, cuando fue posible, utilizando isoformas UTR 3 ′ largas identificadas recientemente [74] y lecturas en el extremo 3 ′ que marcan una división distal adicional y sitios de poliadenilación. La extensión de estos 3 ′ UTR condujo a un aumento sustancial en el número de interacciones regulatorias previstas, con el número medio de objetivos para miRNA conservados aumentando en un 78% con respecto a la versión anterior de TargetScanFly (archivo adicional 2: Figura S5).

Para cada una de estas isoformas de referencia 3 ′ UTR, se utilizaron conjuntos de datos del extremo 3 ′ para cuantificar la abundancia relativa de isoformas en tándem, generando así los perfiles de isoformas necesarios para puntuar características que varían con la longitud de 3 ′ UTR (len_3UTR y otros_ sitios) y asignar un peso a la puntuación de contexto de cada sitio, que representó la fracción de moléculas 3 ′ UTR que contiene el sitio [60]. Nuestros datos 3P-seq de las células S2 se combinaron con datos 3′-seq de una variedad de etapas de desarrollo de la mosca [74] para generar un perfil de isoforma meta 3 ′ UTR para cada ORF representativo, como se ilustra para Ultrabitórax (Ubx) (Fig. 5), que se sabe que se somete a una escisión y poliadenilación alternativas [75]. Aunque no se espera que este meta enfoque sea tan preciso como el uso de conjuntos de datos individuales para generar perfiles de isoformas y predicciones adaptadas a una etapa individual o tipo de célula [61, 75, 76, 77], simplifica la clasificación resumida de los objetivos predichos para cada miARN y aún supera el enfoque anterior de no considerar la abundancia de isoformas en absoluto, presumiblemente porque los perfiles de isoformas de muchos genes están altamente correlacionados en diversos tipos de células [60].

Un ejemplo de una página TargetScanFly, que muestra los sitios predichos de miARN conservados dentro del Ubx 3 ′ UTR. En la parte superior está el perfil de 3 ′ UTR, que muestra la expresión relativa de las isoformas de 3 ′ UTR en tándem, medidas utilizando 3 ′-seq [74], así como nuestros datos de 3P-seq. En este perfil se muestra el final de la anotación FlyBase más larga (línea vertical azul) y el número de lecturas del extremo 3 '(525) utilizadas para generar el perfil (etiquetado en la y-eje). Debajo del perfil se encuentran sitios conservados y mal conservados para miARN ampliamente conservados entre insectos (coloreado según la clave), con opciones para mostrar también sitios para miARN mal conservados y otras anotaciones de miRBase. En caja son los sitios miR-iab-8 predichos, con el sitio seleccionado por el usuario indicado con un caja más oscura. La alineación de secuencia múltiple muestra las especies en las que se puede detectar un sitio ortólogo (resaltado blanco) entre 27 especies de insectos. Debajo de la alineación está el emparejamiento consecuente predicho entre el miARN seleccionado y sus sitios conservados y mal conservados, mostrando también para cada sitio su posición, tipo de sitio, puntaje de contexto, percentil de puntaje de contexto, puntaje de contexto ponderado, puntaje de longitud de rama y PAGConnecticut puntaje

Para cada sitio canónico de 7-8 nt, utilizamos el perfil de UTR de 3 ′ correspondiente para calcular la puntuación de contexto y ponderar esta puntuación en función de la abundancia relativa de isoformas de UTR de 3 ′ en tándem que contenían el sitio [60]. Las puntuaciones de varios sitios de la misma familia de miARN también se combinaron para generar puntuaciones de contexto ponderadas acumulativas para el perfil 3 ′ UTR de cada ORF representativo, lo que proporcionó el enfoque predeterminado para clasificar los objetivos predichos con al menos un sitio de 7 a 8 nt para ese Familia de miARN [51]. Como opción, el usuario puede, en cambio, solicitar que los objetivos predichos de miARN ampliamente conservados se clasifiquen en función de su conjunto. PAGConnecticut puntuaciones [57], como se actualiza en este estudio. El usuario también puede obtener predicciones desde la perspectiva de cada gen codificador de proteínas, visto como el mapeo de los sitios de 7-8 nt que se muestran debajo del perfil 3 ′ UTR y por encima de la alineación de la secuencia 3 ′ UTR (Fig. 5), o como una tabla de miARN clasificados por puntaje de contexto ponderado acumulativo o agregado PAGConnecticut puntaje.


El material complementario electrónico está disponible en línea en https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.5015282.

Publicado por la Royal Society bajo los términos de la licencia de atribución Creative Commons http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, que permite el uso sin restricciones, siempre que se acredite el autor y la fuente originales.

Referencias

Hosaka T, Yamashita T, Tamaoka A, Kwak S

. 2019 ARN extracelulares como biomarcadores de esclerosis lateral amiotrófica esporádica y otras enfermedades neurodegenerativas. En t. J. Mol. Sci. 20, 3148. (doi: 10.3390 / ijms20133148) Crossref, ISI, Google Académico

. Ensayo clínico de fase I de 2017 sobre la seguridad de la L-serina para pacientes con ELA. Amiotrofo. Scler lateral. Parte delantera. Degener. 18, 107-111. (doi: 10.1080 / 21678421.2016.1221971) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2006 Identificación de biomarcadores potenciales de LCR en ELA. Neurología 66, 1218-1222. (doi: 10.1212 / 01.wnl.0000203129.82104.07) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2001 Disminución de la captación de glutamato plaquetario en pacientes con esclerosis lateral amiotrófica. Neurología 56, 270-272. (doi: 10.1212 / WNL.56.2.270) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2015 Niveles de cadena pesada de neurofilamentos en plasma y progresión de la enfermedad en la esclerosis lateral amiotrófica: conocimientos de un estudio longitudinal. J. Neurol. Neurourgo. Psiquiatría 86, 565-573. (doi: 10.1136 / jnnp-2014-307672) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Labra J, Menon P, Byth K, Morrison S, Vucic S

. 2016 Tasa de progresión de la enfermedad: un biomarcador pronóstico en la ELA. J. Neurol. Neurourgo. Psiquiatría 87, 628-632. (doi: 10.1136 / jnnp-2015-310998) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Shepheard SR, Wuu J, Cardoso M, Wiklendt L, Dinning PG, Chataway T, Schultz D, Benatar M, Rogers ML

. 2017 p75ECD urinario: un biomarcador de pronóstico, progresión de la enfermedad y farmacodinámica en la ELA. Neurología 88, 1137-1143. (doi: 10.1212 / WNL.0000000000003741) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

2019 Rendimiento diagnóstico y pronóstico de neurofilamentos en ELA. Parte delantera. Neurol. 9, 1167. (doi: 10.3389 / fneur.2018.01167) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Simpson EP, Henry YK, Henkel JS, Smith RG, Appel SH

. 2004 Aumento de la peroxidación de lípidos en sueros de pacientes con ELA: un biomarcador potencial de la carga de enfermedad. Neurología 62, 1758-1765. (doi: 10.1212 / WNL.62.10.1758) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Boylan K, Yang C, Crook J, Overstreet K, Heckman M, Wang Y, Borchelt D, Shaw G

. 2009 Inmunorreactividad de la subunidad H del neurofilamento axonal fosforilado (pNF-H) en sangre de roedores modelo de ELA y pacientes con ELA: evaluación del pNF-H en sangre como un biomarcador potencial de ELA. J. Neurochem. 111, 1182-1191. (doi: 10.1111 / j.1471-4159.2009.06386.x) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Wilson ME, Boumaza I, Lacomis D, Bowser R

. 2010 Cistatina C: un biomarcador candidato para la esclerosis lateral amiotrófica. Más uno 5, e15133. (doi: 10.1371 / journal.pone.0015133) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Bede P, Bokde ALW, Byrne S, Elamin M, Fagan AJ, Hardiman O

. 2012 Marcadores de la médula espinal en la ELA: consideraciones de diagnóstico y biomarcadores. Amiotrofo. Scler lateral. 13, 407-415. (doi: 10.3109 / 17482968.2011.649760) Crossref, PubMed, Google Académico

. 2012 Miografía de impedancia eléctrica como biomarcador para evaluar la progresión de la ELA. Amiotrofo. Scler lateral. 13, 439-445. (doi: 10.3109 / 17482968.2012.688837) Crossref, PubMed, Google Académico

Tarasiuk J, Kułakowska A, Drozdowski W, Kornhuber J, Lewczuk P

. 2012 Marcadores de LCR en la esclerosis lateral amiotrófica. J. Neural Transm. 119, 747-757. (doi: 10.1007 / s00702-012-0806-y) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Feneberg E, Steinacker P, Lehnert S, Schneider A, Walther P, Thal DR, Linsenmeier M, Ludolph AC, Otto M

. 2014 Papel limitado del TDP-43 libre como herramienta de diagnóstico en enfermedades neurodegenerativas. Amiotrofo. Scler lateral. Parte delantera. Degener. 15, 351-356. (doi: 10.3109 / 21678421.2014.905606) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2015 Cadena ligera del neurofilamento: un biomarcador pronóstico en la esclerosis lateral amiotrófica. Neurología 84, 2247-2257. (doi: 10.1212 / WNL.0000000000001642) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

2012 Seguimiento de las alteraciones del proteoma del LCR en la esclerosis lateral amiotrófica: obstáculos y perspectivas para trasladar un nuevo panel de marcadores a la clínica. Más uno 7, e44401. (doi: 10.1371 / journal.pone.0044401) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2018 Información mínima para estudios de vesículas extracelulares 2018 (MISEV2018): declaración de posición de la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares y actualización de las directrices MISEV2014. J. Extracell. Vesículas 7, 1535750. (doi: 10.1080 / 20013078.2018.1535750) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Cheruiyot C, Pataki Z, Ramratnam B, Li M

. 2018 Análisis proteómico de exosomas y su aplicación en la infección por VIH-1. Clínica de proteómica. Apl. 12, 1700142. (doi: 10.1002 / prca.201700142) Crossref, ISI, Google Académico

. 2018 Perfil de miARN asociado a exosomas como herramienta de pronóstico para el monitoreo de la respuesta a la terapia en pacientes con esclerosis múltiple. FASEB J. 32, 4241-4246. (doi: 10.1096 / fj.201701533R) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Meng Y, Sun J, Wang X, Hu T, Ma Y, Kong C, Piao H, Yu T, Zhang G

. Exosomas 2019: una vía prometedora para el diagnóstico del cáncer de mama. Technol. Cancer Res. Tratar. 18, 1533033818821421. (doi: 10.1177 / 1533033818821421) Crossref, ISI, Google Académico

Shi M, Jiang Y, Yang L, Yan S, Wang Y-G, Lu X-J

. 2018 Los niveles reducidos de miR-638 exosómico sérico predicen un mal pronóstico en el carcinoma hepatocelular. J. Cell. Biochem. 119, 4711-4716. (doi: 10.1002 / jcb.26650) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Chen B, Xia Z, Deng YN, Yang Y, Zhang P, Zhu H, Xu N, Liang S

. 2019 Biomarcadores emergentes de microARN para el diagnóstico y pronóstico del cáncer colorrectal. Abra Biol. 9, 180212. (doi: 10.1098 / rsob.180212) Enlace, ISI, Google Académico

Wu HZY, Ong KL, Seeher K, Armstrong NJ, Thalamuthu A, Brodaty H, Sachdev P, Mather K

. 2015 MicroARN circulantes como biomarcadores de la enfermedad de Alzheimer: una revisión sistemática. J. Alzheimer's Dis. 49, 755-766. (doi: 10.3233 / JAD-150619) Crossref, ISI, Google Académico

Zheng X, Zhang Y, Yue P, Liu L, Wang C, Zhou K, Hua Y, Wu G, Li Y

. 2019 Importancia diagnóstica de los miARN circulantes en el lupus eritematoso sistémico. Más uno 14, e0217523. (doi: 10.1371 / journal.pone.0217523) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2019 Una revisión de los biomarcadores de microARN en la lesión cerebral traumática. J. Exp. Neurosci. 13, 117906951983228. (doi: 10.1177 / 1179069519832286) Crossref, ISI, Google Académico

Zhou SS, Jin JP, Wang JQ, Zhang ZG, Freedman JH, Zheng Y, Cai L

. MiRNAS 2018 en enfermedades cardiovasculares: posibles biomarcadores, dianas terapéuticas y desafíos artículo de revisión. Acta Pharmacol. Pecado. 39, 1073-1084. (doi: 10.1038 / aps.2018.30) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Roser AE, Caldi Gomes L, Schünemann J, Maass F, Lingor P

. 2018 MiARN circulante como biomarcadores de diagnóstico para la enfermedad de Parkinson. Parte delantera. Neurosci. 12, 625. (doi: 10.3389 / fnins.2018.00625) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Piket E, Zheleznyakova GY, Kular L, Jagodic M

. 2019 Pequeños ARN no codificantes como importantes actores, biomarcadores y dianas terapéuticas en la esclerosis múltiple: una descripción general completa. J. Autoimmun. 101, 17-25. (doi: 10.1016 / j.jaut.2019.04.002) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Vaishya S, Sarwade RD, Seshadri V

. 2018 MicroARN, proteínas y metabolitos como nuevos biomarcadores de prediabetes, diabetes y complicaciones relacionadas. Parte delantera. Endocrinol. (Lausana) 9, 180. (doi: 10.3389 / fendo.2018.00180) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Mustapic M, Eitan E, Werner JKJ, Berkowitz ST, Lazaropoulos MP, Tran J, Goetzl EJ, Kapogiannis D

. 2017 Vesículas extracelulares de plasma enriquecidas para el origen neuronal: una posible ventana a los procesos patológicos cerebrales. Parte delantera. Neurosci. 11, 278. (doi: 10.3389 / FNINS.2017.00278) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Brooks BR, Miller RG, Swash M, Munsat TL

. 2000 El Escorial revisitado: criterios revisados ​​para el diagnóstico de esclerosis lateral amiotrófica. Amiotrofo. Scler lateral. 1, 293-299. (doi: 10.1080 / 146608200300079536) Google Académico

. 2011 Cutadapt elimina las secuencias de adaptadores de las lecturas de secuenciación de alto rendimiento. EMBnet.journal 17, 10. (doi: 10.14806 / ej.17.1.200) Crossref, Google Académico

. 2012 Alineación rápida de lectura con espacios vacíos con Bowtie 2. Nat. Métodos 9, 357-359. (doi: 10.1038 / nmeth.1923) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Robinson MD, McCarthy DJ, Smyth GK

. 2009 edgeR: un paquete de bioconductores para el análisis de expresión diferencial de datos digitales de expresión génica. Bioinformática 26, 139-140. (doi: 10.1093 / bioinformatics / btp616) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2010 Un método de normalización a escala para el análisis de expresión diferencial de datos de RNA-seq. Genome Biol. 11, R25. (doi: 10.1186 / gb-2010-11-3-r25) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Kozomara A, Griffiths-Jones S

. 2014 miRBase: anotación de microARN de alta confianza utilizando datos de secuenciación profunda. Ácidos nucleicos Res. 42, D68-D73. (doi: 10.1093 / nar / gkt1181) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2009 Las directrices MIQE: información mínima para la publicación de experimentos cuantitativos de PCR en tiempo real. Clin. Chem. 55, 611-622. (doi: 10.1373 / clinchem.2008.112797) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Andersen CL, Jensen JL, Ørntoft TF

. 2004 Normalización de datos de PCR con transcripción inversa cuantitativa en tiempo real: un enfoque de estimación de la varianza basado en modelos para identificar genes adecuados para la normalización, aplicado a conjuntos de datos de cáncer de vejiga y colon. Cancer Res. 64, 5245-5250. (doi: 10.1158 / 0008-5472.CAN-04-0496) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F.

2002 Normalización precisa de datos de RT-PCR cuantitativos en tiempo real mediante el promedio geométrico de múltiples genes de control interno. Genome Biol. 3, INVESTIGACIÓN0034. (doi: 10.1186 / gb-2002-3-7-research0034) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2013 Estandarización de los métodos de recolección, aislamiento y análisis de muestras en la investigación de vesículas extracelulares. J. Extracell. Vesículas 2, 20360. (doi: 10.3402 / jev.v2i0.20360) Crossref, Google Académico

Hill AF, Pegtel DM, Lambertz U, Leonardi T, O'Driscoll L, Pluchino S, Ter-Ovanesyan D, Nolte-‘t Hoen ENM

. Documento de posición del ISEV de 2013: análisis de ARN de vesículas extracelulares y bioinformática. J. Extracell. Vesículas 2, 22859. (doi: 10.3402 / jev.v2i0.22859) Crossref, Google Académico

Katsu M, Hama Y, Utsumi J, Takashina K, Yasumatsu H, Mori F, Wakabayashi K, Shoji M, Sasaki H

. 2019 Perfiles de expresión de microARN de vesículas extracelulares derivadas de neuronas en plasma de pacientes con esclerosis lateral amiotrófica. Neurosci. Letón. 708, 134176. (doi: 10.1016 / j.neulet.2019.03.048) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2012 La modulación de los monocitos inflamatorios con una firma genética de microARN única mejora la ELA murina. J. Clin. Invertir. 122, 3063-3087. (doi: 10.1172 / JCI62636) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

De Felice B, Guida M, Guida M, Coppola C, De Mieri G, Cotrufo R.

2012 Una firma de miARN en leucocitos de esclerosis lateral amiotrófica esporádica. Gene 508, 35-40. (doi: 10.1016 / j.gene.2012.07.058) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2017 MiARN sérico miR-206, 143-3p y 374b-5p como posibles biomarcadores de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Neurobiol. Envejecimiento 55, 123-131. (doi: 10.1016 / j.neurobiolaging.2017.03.027) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Liguori M, Nuzziello N, Introna A, Consiglio A, Licciulli F, D'Errico E, Scarafino A, Distaso E, Simone IL

. 2018 Desregulación de microARN y redes de genes diana en sangre periférica de pacientes con esclerosis lateral amiotrófica esporádica. Parte delantera. Mol. Neurosci. 11, 288. (doi: 10.3389 / fnmol.2018.00288) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2018 Correlación de micrornas séricas y parámetros clínicos en la esclerosis lateral amiotrófica. Nervio muscular 58, 261-269. (doi: 10.1002 / mus.26106) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Vrabec K, Boštjančič E, Koritnik B, Leonardis L, Dolenc Grošelj L, Zidar J, Rogelj B, Glavač D, Ravnik-Glavač M

. 2018 Expresión diferencial de varios miRNA y los genes del huésped AATK y DNM2 en leucocitos de pacientes con ELA esporádica. Parte delantera. Mol. Neurosci. 11, 106. (doi: 10.3389 / fnmol.2018.00106) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2014 miR-338-3p se sobreexpresa en sangre, SFC, suero y médula espinal de pacientes con esclerosis lateral amiotrófica esporádica. Neurogenética 15, 243-253. (doi: 10.1007 / s10048-014-0420-2) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Toivonen JM, Manzano R, Oliván S, Zaragoza P, García-Redondo A, Osta R

. 2014 MicroRNA-206: un potencial biomarcador circulante candidato para la esclerosis lateral amiotrófica. Más uno 9, e89065. (doi: 10.1371 / journal.pone.0089065) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Takahashi I, Hama Y, Matsushima M, Hirotani M, Kano T, Hohzen H, Yabe I, Utsumi J, Sasaki H

. 2015 Identificación de microARN plasmáticos como biomarcador de esclerosis lateral amiotrófica esporádica. Mol. Cerebro 8, 67. (doi: 10.1186 / s13041-015-0161-7) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Chen Y, Wei Q, Chen X, Li C, Cao B, Ou R, Hadano S, Shang H-F

. 2016 Aberración de la expresión de miARN en leucocitos de esclerosis lateral amiotrófica esporádica. Parte delantera. Mol. Neurosci. 9, 69. (doi: 10.3389 / fnmol.2016.00069) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

de Andrade HMT, de Albuquerque M, Avansini SH, de Rocha SC, Dogini DB, Nucci A, Carvalho B, Lopes-Cendes I

. 2016 Los microARN-424 y 206 son posibles marcadores de pronóstico en la esclerosis lateral amiotrófica de inicio espinal. J. Neurol. Sci. 368, 19-24. (doi: 10.1016 / j.jns.2016.06.046) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Tasca E, Pegoraro V, Merico A, Angelini C

. 2016 MicroARN circulantes como biomarcadores de diferenciación y atrofia muscular en ELA. Clin. Neuropathol. 35, 22-30. (doi: 10.5414 / NP300889) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2017 MicroARN circulantes enriquecidos en el cerebro como nuevos biomarcadores para la detección y diferenciación de enfermedades neurodegenerativas. Alzheimer's Res. El r. 9, 1-13. (doi: 10.1186 / s13195-017-0316-0) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Waller R, Wyles M, Heath PR, Kazoka M, Wollff H, Shaw PJ, Kirby J

. 2018 La secuenciación de ARN pequeño del líquido cefalorraquídeo de la esclerosis lateral amiotrófica esporádica revela miARN expresados ​​diferencialmente relacionados con la actividad neural y glial. Parte delantera. Neurosci. 11, 731. (doi: 10.3389 / fnins.2017.00731) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Benoist M, Palenzuela R, Rozas C, Rojas P, Tortosa E, Morales B, González-Billault C, Ávila J, Esteban JA

. 2013 La activación de Rac dependiente de MAP1B es necesaria para la endocitosis del receptor de AMPA durante la depresión a largo plazo. EMBO J. 32, 2287-2299. (doi: 10.1038 / emboj.2013.166) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2012 Regulación de la heterogeneidad funcional de los monocitos por miR-146a y Relb. Rep. Celular 1, 317-324. (doi: 10.1016 / j.celrep.2012.02.009) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2013 Modulación de la traducción de MAP1B dependiente de mGluR y endocitosis del receptor de AMPA por microARN miR-146a-5p. J. Neurosci. 33, 9013-9020. (doi: 10.1523 / JNEUROSCI.5210-12.2013) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Sison SL, Patitucci TN, Seminario ER, Villalon E, Lorson CL, Ebert AD

. 2017 MiR-146a producido por astrocitos como mediador de la pérdida de neuronas motoras en la atrofia muscular espinal. Tararear. Mol. Gineta. 26, 3409-3420. (doi: 10.1093 / hmg / ddx230) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Lu Y, Cao DL, Jiang BC, Yang T, Gao YJ

. 2015 MicroRNA-146a-5p atenúa el dolor neuropático mediante la supresión de la señalización de TRAF6 en la médula espinal. Cerebro. Behav. Immun. 49, 119-129. (doi: 10.1016 / j.bbi.2015.04.018) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Iyer A, Zurolo E, Prabowo A, Fluiter K, Spliet WGM, van Rijen PC, Gorter JA, Aronica E.

2012 MicroRNA-146a: un regulador clave de la respuesta inflamatoria mediada por astrocitos. Más uno 7, e44789. (doi: 10.1371 / journal.pone.0044789) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2012 Asociación de microARN-146a con enfermedades autoinmunes. Inflamación 35, 1525-1529. (doi: 10.1007 / s10753-012-9467-0) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Cui JG, Li YY, Zhao Y, Bhattacharjee S, Lukiw WJ

. 2010 Regulación diferencial de la quinasa 1 asociada al receptor de interleucina-1 (IRAK-1) e IRAK-2 por microARN-146a y NF-κB en células astrogliales humanas estresadas y en la enfermedad de Alzheimer. J. Biol. Chem. 285, 38951-38 960. (doi: 10.1074 / jbc.M110.178848) Crossref, ISI, Google Scholar

. 2008 La identificación de cambios de miARN en el cerebro y el LCR de la enfermedad de Alzheimer produce biomarcadores putativos y conocimientos sobre las vías de la enfermedad. J. Alzheimer's Dis. 14, 27-41. (doi: 10.3233 / JAD-2008-14103) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2009 Abundancia y estabilidad de micro-ARN en el cerebro humano: alteraciones específicas en la neocorteza del lóbulo temporal de la enfermedad de Alzheimer. Neurosci. Letón. 459, 100-104. (doi: 10.1016 / j.neulet.2009.04.052) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Kiko T, Nakagawa K, Tsuduki T, Furukawa K, Arai H, Miyazawa T

. 2014 MicroARN en plasma y líquido cefalorraquídeo como posibles marcadores de la enfermedad de Alzheimer. J. Alzheimer's Dis. 39, 253-259. (doi: 10.3233 / JAD-130932) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Müller M, Kuiperij HB, Claassen JA, Küsters B, Verbeek MM

. 2014 MicroARN en la enfermedad de Alzheimer: expresión diferencial en hipocampo y líquido cefalorraquídeo libre de células. Neurobiol. Envejecimiento 35, 152-158. (doi: 10.1016 / j.neurobiolaging.2013.07.005) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. Los perfiles de microARN en suero de 2015 sirven como nuevos biomarcadores para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer. Dis. Marcadores 2015, 625659. (doi: 10.1155 / 2015/625659) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2014 Aislamiento rápido de vesículas extracelulares de cultivos celulares y fluidos biológicos utilizando un péptido sintético con afinidad específica por proteínas de choque térmico. Más uno 9, e110443. (doi: 10.1371 / journal.pone.0110443) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2019 Identificación de una firma de miARN circulante en vesículas extracelulares recolectadas de pacientes con esclerosis lateral amiotrófica. Brain Res. 1708, 100-108. (doi: 10.1016 / j.brainres.2018.12.016) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Hua YJ, Tang ZY, Tu K, Zhu L, Li YX, Xie L, Xiao HS

. 2009 Identificación y predicción de objetivos de miARN expresados ​​específicamente en tejido neural de rata. BMC Genomics 10, 214. (doi: 10.1186 / 1471-2164-10-214) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Liu G, Detloff MR, Miller KN, Santi L, Houlé JD

. 2012 El ejercicio modula los microARN que afectan la vía PTEN / mTOR en ratas después de una lesión de la médula espinal. Exp. Neurol. 233, 447-456. (doi: 10.1016 / j.expneurol.2011.11.018) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. La expresión de MiR-10b-5p de 2015 en el cerebro con enfermedad de Huntington se relaciona con la edad de aparición y el grado de afectación estriatal. BMC Med. Genómica 8, 1-14. (doi: 10.1186 / s12920-015-0083-3) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Varendi K, Kumar A, Härma MA, Andressoo JO

. 2014 MIR-1, miR-10b, miR-155 y miR-191 son reguladores novedosos de BDNF. Celda. Mol. Life Sci. 71, 4443-4456. (doi: 10.1007 / s00018-014-1628-x) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Li Y, Yui D, Luikart BW, McKay RM, Li Y, Rubenstein JL, Parada LF

. 2012 La ablación condicional de la señalización del factor neurotrófico derivado del cerebro-TrkB altera el desarrollo de las neuronas estriatales. Proc. Natl Acad. Sci. Estados Unidos 109, 15 491-15 496. (doi: 10.1073 / pnas.1212899109) Crossref, ISI, Google Scholar

Buchman AS, Yu L, Boyle PA, Schneider JA, De Jager PL, Bennett DA.

2016 Una mayor expresión del gen BDNF en el cerebro se asocia con un deterioro cognitivo más lento en los adultos mayores. Neurología 86, 735-741. (doi: 10.1212 / WNL.0000000000002387) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Sadanand A, Janardhanan A, Vanisree AJ, Pavai T

. 2018 Expresión de neurotropinas en linfocitos: un poderoso indicador de degeneración en la enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica y ataxia. J. Mol. Neurosci. 64, 224-232. (doi: 10.1007 / s12031-017-1014-x) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2015 Las dos caras del miR-29. J. Cardiovasc. Medicina. 16, 480-490. (doi: 10.2459 / JCM.0000000000000246) Crossref, Google Académico

. 2014 Perfiles de microARN en suero en niños con autismo. Mol. Autismo 5, 40. (doi: 10.1186 / 2040-2392-5-40) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Moreau MP, Bruse SE, David-Rus R, Buyske S, Brzustowicz LM

. 2011 Perfiles de expresión de microARN alterados en muestras de cerebro post mortem de individuos con esquizofrenia y trastorno bipolar. Biol. Psiquiatría 69188-193. (doi: 10.1016 / j.biopsych.2010.09.039) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2013 Una firma de 12-miARN basada en sangre de pacientes con enfermedad de Alzheimer. Genome Biol. 14, R78. (doi: 10.1186 / gb-2013-14-7-r78) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

2018 firmas basadas en miARN en líquido cefalorraquídeo como posibles herramientas de diagnóstico para la enfermedad de Parkinson en etapa temprana. Oncotarget 9, 17 455-17 465. (doi: 10.18632 / oncotarget.24736) Crossref, Google Académico

Pallarès-Albanell J, Zomeño-Abellán MT, Escaramís G, Pantano L, Soriano A, Segura MF, Martí E

. 2019 Un cribado de alto rendimiento identifica inhibidores de microARN que influyen en el mantenimiento neuronal y / o la respuesta al estrés oxidativo. Mol. El r. Ácidos nucleicos 17, 374-387. (doi: 10.1016 / j.omtn.2019.06.007) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Kruman II, Pedersen WA, Springer JE, Mattson MP

. 1999 La mutación de Cu / Zn-SOD ligada a ALS aumenta la vulnerabilidad de las neuronas motoras a la excitotoxicidad mediante un mecanismo que implica un aumento del estrés oxidativo y una alteración de la homeostasis del calcio. Exp. Neurol. 160, 28-39. (doi: 10.1006 / exnr.1999.7190) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Bao N, Fang B, Lv H, Jiang Y, Chen F, Wang Z, Ma H

. 2018 La regulación al alza de miR-199a-5p protege la médula espinal contra la lesión inducida por isquemia / reperfusión mediante la regulación a la baja de ECE1 en ratas. Celda. Mol. Neurobiol. 38, 1293-1303. (doi: 10.1007 / s10571-018-0597-2) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico


COOPERATIVIDAD DE MICROARN EN CÁNCER: MECANISMOS, FUNCIONES Y TERAPIAS POTENCIALES

Aunque el uso de imitadores de miARN e inhibidores de miARN como terapéutica parece prometedor, hasta ahora solo un pequeño número de terapias de miARN ha progresado hacia el desarrollo clínico. Un desafío importante es la identificación de los mejores candidatos de miARN o objetivos de miARN para diferentes tipos de cánceres. Una estrategia intuitiva es combinar el análisis de expresión génica con algoritmos de predicción de objetivos de miARN, como TargetScan (30). Sin embargo, esta estrategia se ve comprometida por los efectos indirectos y la compleja regulación de genes que involucran diferentes especies moleculares y sus interacciones dinámicas. Por lo tanto, se han desarrollado técnicas bioquímicas basadas en la inmunoprecipitación de Argonaute y miARN (por ejemplo, HITS-CLIP y PAR-CLIP) para identificar experimentalmente interacciones de miARN y objetivo a una escala de todo el transcriptoma (31). Otro desafío para la terapéutica de miARN es evitar o minimizar la toxicidad y los efectos fuera del objetivo. Como un solo miARN a menudo reprime sus objetivos de manera bastante débil (21,32), generalmente se requieren altas dosis de imitadores de miARN efectivos para lograr el efecto esperado. Sin embargo, las dosis altas también provocan consecuencias no deseadas, incluida la focalización no intencionada de los miARN administrados. Por ejemplo, el ensayo clínico MRX34 tuvo que terminarse debido a eventos adversos relacionados con el sistema inmunológico que involucraron la muerte de pacientes. Tales fallas pueden evitarse reduciendo la dosis del imitador de miARN y, en consecuencia, reduciendo los efectos fuera del objetivo, pero los beneficios terapéuticos podrían disminuir igualmente. Para superar este problema, un enfoque razonable sería utilizar combinaciones de miARN de dosis más bajas que regulen sinérgicamente la expresión de un objetivo compartido. En este contexto, esperamos una reducción o evitación de eventos no deseados en pacientes cuando se coadministran múltiples miARN en niveles más bajos en comparación con un tratamiento individual de miARN de dosis alta.

La regulación cooperativa y sinérgica de miARN es un mecanismo intrigante pero poco explorado. Diferentes miARN pueden cooperar, por ejemplo, regulando múltiples objetivos complementarios en una vía (Figura & # x200B (Figura1). 1). Hay algunos ejemplos validados experimentalmente en los que los miARN ejercen efectos sinérgicos en el cáncer (Tabla & # x200B (Tabla1). 1). La cotransfección de miR-34a y miR-15a / 16 condujo a una mayor detención del ciclo celular en las células de cáncer de pulmón de células no pequeñas debido al hecho de que miR-15a y miR-16 regulan específicamente a la baja CCNE1 y CCND3. Tal regulación génica ejerce un efecto complementario a la regulación del ciclo celular por miR-34a (33). Pencheva et & # x000a0al. identificaron que miR-1908, miR-199a-5p y miR-199a-3p se dirigen conjuntamente a la señalización de ApoE en el melanoma. La inhibición de estos miARN mediada por LNA suprimió fuertemente la metástasis del melanoma (34). En comparación con el tratamiento con un solo miARN en células de leucemia linfoblástica aguda de niños, la coexpresión de miR-125b, miR-100 & # x000a0 y miR-99a dio como resultado una regulación a la baja de múltiples dianas que está causalmente relacionada con la resistencia al agente quimioterapéutico vincristina ( 35). A través de la investigación de nueve pares de miARN en células de glioma, Zhao et & # x000a0al. encontraron que se producía una gran sinergia entre los miARN regulados al alza. Demostraron que el mayor efecto sinérgico que aumenta la apoptosis de las células de glioma se logra mediante la inhibición simultánea de miR-20a y miR-21 (36).La desrepresión de genes supresores de tumores (PDCD4, BTG2 & # x000a0 y NEDD4L) mediante la inhibición de miR-21, miR-23a y miR-27a mostró efectos sinérgicos para reducir el crecimiento y la progresión del tumor pancreático (37). Además, considerando la orientación múltiple de miARN, los investigadores propusieron miARN como adyuvantes junto con las terapias contra el cáncer disponibles (38). Por ejemplo, la modulación de miARN se puede usar para aumentar la eficiencia de los inhibidores de moléculas pequeñas que se dirigen a los oncogenes (39) y para reducir las dosis efectivas de quimioterapias (40). Hemos demostrado cómo se puede lograr una ganancia terapéutica potencial utilizando miR-205 y miR-342 como coadyuvantes para sensibilizar las células tumorales a un fármaco anticanceroso genotóxico (41).

Implementación de la cooperatividad de miARN mediante el direccionamiento de una vía compartida o de un gen codificador de proteínas compartido. El direccionamiento de varios genes codificadores de proteínas interconectados por múltiples miARN conduce a la regulación de una vía y, por lo tanto, a la modulación del resultado fenotípico (vía A). El direccionamiento concertado de un gen que codifica una proteína por dos miARN puede inducir una regulación eficiente de un proceso biológico que está controlado por el gen (vía B). Los objetivos de miARN están resaltados en rojo.


1. Identificación de objetivos y validación de amplificador

Identificación de objetivos y caracterización de amplificadores

La identificación y caracterización de la diana comienza con la identificación de la función de una posible diana terapéutica (gen / proteína) y su papel en la enfermedad. La identificación de la diana va seguida de la caracterización de los mecanismos moleculares abordados por la diana. Un buen objetivo debe ser eficaz, seguro, cumplir con los requisitos clínicos y comerciales y ser & quotdrogable & quot.

Enfoques:

  • Minería de datos mediante bioinformática
    - identificar, seleccionar y priorizar posibles objetivos de enfermedades
  • Asociación genética
    - polimorfismo genético y conexión con la enfermedad
  • Perfil de expresión
    - cambios en los niveles de ARNm / proteínas
  • Análisis de vías y fenotípicos
    - In vitro
    estudios mecanicistas basados ​​en células
  • Cribado funcional
    - derribo, nocaut o uso de herramientas específicas de destino

Validación de destino

La validación de la diana muestra que una diana molecular está directamente involucrada en un proceso de enfermedad y que es probable que la modulación de la diana tenga un efecto terapéutico. El criterio más importante para la validación de objetivos es adoptar un enfoque de validación múltiple.

Enfoques:

  • Manipulación genética de genes diana (in vitro)
    - derribar el gen (shRNA, siRNA, miRNA), anular el gen (CRISPR, ZFN), golpear el gen
    (transfección viral de genes mutantes)
  • Anticuerpos
    - interactuar con el objetivo con alta afinidad y bloquear interacciones posteriores
  • Genómica química
    - enfoques químicos contra la proteína que codifica el genoma

¿Su laboratorio tiene dificultades para descubrir nuevos objetivos? Nuestra amplia cartera de ensayos, reactivos y bibliotecas puede ayudarlo a encontrar el candado correcto para que pueda comenzar a trabajar para desbloquearlo. Desde el Biblioteca CRISPR de genoma completo de Sanger para Duolink ® PLA para medir las interacciones proteína-proteína, y moléculas pequeñas bioactivas, le proporcionamos las herramientas adecuadas para permitir la identificación, validación y caracterización de los nuevos objetivos que está buscando.


MiRBase

La numeración de genes de miARN es simplemente secuencial. Por ejemplo, en el momento de escribir este artículo, el último miARN publicado era el ratón mir-352. El siguiente miARN novedoso que se publique obtendrá el número 353. Sin embargo, si envía un miARN de Xenopus que sea idéntico al mir-121 humano, por ejemplo, le sugeriremos que también nombre su secuencia mir-121.

Los nombres / identificadores en la base de datos tienen el formato hsa-mir-121. Las primeras tres letras significan el organismo. El miARN maduro se denomina miR-121 en la base de datos y en gran parte de la literatura, mientras que mir-121 se refiere al gen de miARN y también a la porción de bucle de tallo predicha de la transcripción primaria. Las secuencias precursoras distintas y los loci genómicos que expresan secuencias maduras idénticas reciben nombres de la forma hsa-mir-121-1 y hsa-mir-121-2. Los sufijos con letras denotan secuencias maduras estrechamente relacionadas; por ejemplo, hsa-miR-121a y hsa-miR-121b se expresarían a partir de los precursores hsa-mir-121a y hsa-mir-121b, respectivamente.

Los estudios de clonación de miARN a veces identifican dos

22nt secuencias de miARN que se originan a partir del mismo precursor predicho. Cuando las abundancias relativas indican claramente cuál es el miARN predominantemente expresado, a las secuencias maduras se les asignan nombres de la forma miR-56 (el producto predominante) y miR-56 * (del brazo opuesto del precursor). Cuando los datos no son suficientes para determinar qué secuencia es la predominante, nombres como miR-142-5p (del brazo 5 ') y miR-142-3p (del brazo 3'). Una convención más antigua a veces usaba miR-142-sy miR-142-as.

En algunos casos, los miARN que no se ajustan a estas ideas han sido renombrados en la base de datos. Sin embargo, hay algunas excepciones publicadas a estas reglas que se acomodan. Por ejemplo, diferentes organismos tienen convenciones de nomenclatura ligeramente diferentes; en las plantas, los nombres publicados tienen la forma MIR121. Los miARN virales también adoptan un esquema de denominación ligeramente diferente. Por esta razón, no es prudente confiar en las mayúsculas para conferir información, como la convención de precursores / maduros de mir / miR. let-7 y lin-4 son excepciones obvias al esquema de numeración, y estos nombres se conservan por razones históricas. Las nuevas presentaciones de homólogos de let-7 o lin-4 también adquirirán estos nombres.

Tenga en cuenta que los nombres de miARN solo pueden transmitir información limitada y son totalmente inadecuados para codificar información sobre relaciones de secuencias complejas. Por lo tanto, no debe confiar en el nombre para decirle todo lo que necesita saber sobre la secuencia. En cambio, los enfoques de bases de datos sensibles deberían utilizar campos dedicados y anotaciones para describir tales relaciones, como los datos de "familia" que se proporcionan aquí.

Los criterios y convenciones para la identificación y denominación de miARN se describen en el siguiente artículo breve:

Victor Ambros, Bonnie Bartel, David P. Bartel, Christopher B. Burge, James C. Carrington, Xuemei Chen, Gideon Dreyfuss, Sean R. Eddy, Sam Griffiths-Jones, Mhairi Marshall, Marjori Matzke, Gary Ruvkun y Thomas Tuschl. Un sistema uniforme para la anotación de microARN. ARN 2003 9(3):277-279.

Además de un nombre o ID, cada entrada de secuencia de miRBase tiene un número de acceso único. El número de acceso es el único identificador verdaderamente estable para una entrada; los nombres de miARN pueden cambiar de los publicados a medida que las relaciones entre las secuencias se vuelven claras. La ventaja del sistema de acceso es que dichos cambios se pueden rastrear en la base de datos, lo que permite que los nombres evolucionen para mantenerse consistentes, al tiempo que brinda al usuario acceso completo a los datos y al historial. Sin embargo, las accesiones transmiten poco significado biológico y se espera que los miARN se mencionen por su nombre en las publicaciones.


MiRBase: la base de datos de microARN

miRBase proporciona los siguientes servicios:

  • La base de datos miRBase es una base de datos de búsqueda de secuencias y anotaciones de miARN publicadas. Cada entrada en la base de datos de secuencias de miRBase representa una porción de horquilla predicha de una transcripción de miARN (denominada mir en la base de datos), con información sobre la ubicación y secuencia de la secuencia de miARN madura (denominada miR). Tanto las secuencias de horquilla como las maduras están disponibles para buscar y navegar, y las entradas también se pueden recuperar por nombre, palabra clave, referencias y anotaciones. Todos los datos de secuencia y anotación también están disponibles para descargar.
  • El registro miRBase proporciona a los cazadores de genes de miARN nombres únicos para genes de miARN nuevos antes de la publicación de los resultados. Visite las páginas de ayuda para obtener más información sobre el servicio de nombres.

Para recibir notificaciones por correo electrónico de actualizaciones de datos y cambios de funciones, suscríbase a la lista de correo de anuncios de miRBase. Cualquier consulta sobre el sitio web o el servicio de nombres debe dirigirse a [email protected]

miRBase es administrado por el laboratorio Griffiths-Jones de la Facultad de Biología, Medicina y Salud de la Universidad de Manchester con fondos del BBSRC. miRBase fue alojado y apoyado anteriormente por el Wellcome Trust Sanger Institute.


Cambia la historia

Simons, M. & amp Raposo, G. Exosomas: portadores vesiculares para la comunicación intercelular. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 575–581 (2009).

Valadi, H. y col. La transferencia de ARNm y microARN mediada por exosomas es un mecanismo novedoso de intercambio genético entre células. Nat. Cell Biol. 9, 654–659 (2007).

Hunter, M. P. y col. Detección de la expresión de microARN en microvesículas de sangre periférica humana. Más uno 3, e3694 (2008).

Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A. & amp Ratajczak, M. Z. Microvesículas derivadas de la membrana: mediadores importantes y subestimados de la comunicación de célula a célula. Leucemia 20, 1487–1495 (2006).

Selbach, M. y col. Cambios generalizados en la síntesis de proteínas inducidos por microARN. Naturaleza 455, 58–63 (2008).

Baek, D. y col. El impacto de los microARN en la producción de proteínas. Naturaleza 455, 64–71 (2008).

Bartel, D. P. MicroARN: genómica, biogénesis, mecanismo y función. Celda 116, 281–297 (2004).

Mitchell, P. S. et al. MicroARN circulantes como marcadores sanguíneos estables para la detección del cáncer. Proc. Natl Acad. Sci. Estados Unidos 105, 10513–10518 (2008).

Janas, T., Janas, T. & amp Yarus, M. Unión específica de ARN a bicapas de fosfolípidos ordenadas. Ácidos nucleicos Res. 34, 2128–2136 (2006).

Manavbasi, Y. & amp Suleymanoglu, E. Reconocimiento de ácido nucleico-fosfolípido: caracterización espectrométrica infrarroja por transformada de Fourier del complejo ternario fosfolípido-catión inorgánico-ADN y su relevancia para el diseño químico-farmacéutico de formulaciones nanométricas de administración de genes basadas en liposomas. Arco. Pharm. Res. 30, 1027–1040 (2007).

Suleymanoglu, E. Reconocimiento de fosfolípidos y ácidos nucleicos: desarrollo de una cromatografía de liposomas inmovilizados para la separación y análisis de ADN. PDA J. Pharm. Sci. Technol. 60, 232–239 (2006).

Gromelski, S. & amp Brezesinski, G. Condensación de ADN e interacción con fosfolípidos de ion híbrido mediada por cationes divalentes. Langmuir 22, 6293–6301 (2006).

Kim, S. I. y col. Entrega sistémica y específica de pequeños ARN interferentes al hígado mediada por la apolipoproteína A-I. Mol. El r. 15, 1145–1152 (2007).

McManus, J. J., Radler, J. O. & amp Dawson, K. A. ¿El calcio se vuelve catiónico en un lípido bipolar? J. Phys. Chem. B 107, 9869–9875 (2003).

Mengistu, D. H., Bohinc, K. & amp May, S. Unión de ADN a capas de lípidos bipolares mediada por cationes divalentes. J. Phys. Chem. B 113, 12277–12282 (2009).

Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G. y Clayton, A. Curr. Protocolos. Cell Biol. Capítulo 3, 22 (John Wiley & amp Sons, 2006) Unidad 3.

Lima, E. S. & amp Maranhao, R. C. Método rápido y simple de dispersión de luz láser para el tamaño de partículas de HDL en plasma completo. Clin. Chem. 50, 1086–1088 (2004).

Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L. & amp Mathivanan, S. Exosomas: conocimientos proteómicos y potencial de diagnóstico. Experto Rev. Proteomics 6, 267–283 (2009).

Mathivanan, S. & amp Simpson, R. J. ExoCarta: un compendio de proteínas exosomales y ARN. Proteómica 9, 4997–5000 (2009).

Conde-Vancells, J. et al. Caracterización y perfil completo de proteomas de exosomas secretados por hepatocitos. J. Proteome Res. 7, 5157–5166 (2008).

Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B. y Bartel, D.P. Genes de microARN de vertebrados. Ciencias 299, 1540 (2003).

Chen, C. Z., Li, L., Lodish, H. F. y Bartel, D. P. Los microARN modulan la diferenciación del linaje hematopoyético. Ciencias 303, 83–86 (2004).

Rader, D. J., Cohen, J. & amp Hobbs, H. H. Hipercolesterolemia monogénica: nuevos conocimientos sobre patogénesis y tratamiento. J. Clin. Invertir. 111, 1795–1803 (2003).

Lund-Katz, S. & amp Phillips, M. C. Estructura-función de lipoproteínas de alta densidad y papel en el transporte inverso del colesterol. Subcélula. Biochem. 51, 183–227 (2010).

Kosaka, N. et al. Mecanismos secretores y transferencia intercelular de microARN en células vivas. J. Biol. Chem. 285, 17442–17452 (2010).

Sun, G., Li, H. & amp Rossi, J. J. El contexto de la secuencia fuera de la región objetivo influye en la eficacia de los sitios objetivo del miR-223 en el RhoB 3 ′ UTR. Ácidos nucleicos Res. 38, 239–252 (2010).

Cui, X. D. y col. Ligando EFNA1 y su receptor EphA2: biomarcadores potenciales para el carcinoma hepatocelular. En t. J. Cáncer 126, 940–949 (2010).

Feinberg, E. H. & amp Hunter, C. P. Transporte de dsRNA a las células por la proteína transmembrana SID-1. Ciencias 301, 1545–1547 (2003).

Wolfrum, C. y col. Mecanismos y optimización de en vivo suministro de ARNip lipofílicos. Nat. Biotechnol. 25, 1149–1157 (2007).

Lewis, B. P., Burge, C. B. & amp Bartel, D. P. El emparejamiento de semillas conservado, a menudo flanqueado por adenosinas, indica que miles de genes humanos son objetivos de microARN. Celda 120, 15–20 (2005).

Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B. y Bartel, D. P. La mayoría de los ARNm de mamíferos son dianas conservadas de microARN. Genome Res. 19, 92–105 (2009).

Podrez, E. A. Propiedades antioxidantes de las lipoproteínas de alta densidad y la aterosclerosis. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 37, 719–725 (2010).

Heinecke, J. W. El proteoma de HDL: un marcador, y quizás mediador, de la enfermedad de las arterias coronarias. J. Lipid Res. 50 (Suppl), S167–171 (2009).

Rothblat, G. H. & amp Phillips, M. C. Heterogeneidad de lipoproteínas de alta densidad y función en el transporte inverso de colesterol. Curr. Opin. Lipidol. 21, 229–238 (2010).

Lu, D. & amp Rhodes, D. G. Unión de oligonucleótidos de fosforotioato a liposomas bipolares. Biochim. Biophys. Acta 1563, 45–52 (2002).

Qiu, X. y col. La estructura cristalina de la proteína de transferencia de éster de colesterol revela un túnel largo y cuatro moléculas de lípidos unidas. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 106–113 (2007).

Trajkovic, K. et al. La ceramida desencadena la gemación de vesículas exosómicas en endosomas multivesiculares. Ciencias 319, 1244–1247 (2008).

Ferracin, M., Veronese, A. & amp Negrini, M. Micromarkers: miARN en el diagnóstico y pronóstico del cáncer. Experto Rev. Mol. Diagn. 10, 297–308 (2010).

Wang, G. K. y col. MicroARN circulante: un nuevo biomarcador potencial para el diagnóstico precoz del infarto agudo de miocardio en humanos. EUR. Corazón J. 31, 659–666 (2010).

Wang, J. F. y col. Suero miR-146a y miR-223 como posibles nuevos biomarcadores para la sepsis. Biochem. Biophys. Res. Comun. 394, 184–188 (2010).

Heneghan, H. M., Miller, N., Lowery, A. J., Sweeney, K. J. y Kerin, M. J. MicroARN como nuevos biomarcadores para el cáncer de mama. J. Oncol. 2009, 950201 (2009).

Gilad, S. et al. Los microARN séricos son nuevos biomarcadores prometedores. Más uno 3, e3148 (2008).

MacArthur, J. M. et al. Los proteoglicanos de heparán sulfato de hígado median la eliminación de lipoproteínas ricas en triglicéridos independientemente de los miembros de la familia del receptor de LDL. J. Clin. Invertir. 117, 153–164 (2007).

Ramakrishnan, S. N., Lau, P., Burke, L. J. & amp Muscat, G. E. Rev-erbbeta regula la expresión de genes involucrados en la absorción de lípidos en las células del músculo esquelético: evidencia de interferencia entre receptores nucleares huérfanos y mioquinas. J. Biol. Chem. 280, 8651–8659 (2005).

Yao, Y. et al. Las lipoproteínas de alta densidad afectan la señalización de BMP endotelial modulando la expresión del receptor de quinasa similar a activina 1 y 2. Arterioscler. Trombo. Vasc. Biol. 28, 2266–2274 (2008).

Moreno, P. R., Purushothaman, K. R., Sirol, M., Levy, A. P. & amp Fuster, V. Neovascularización en la aterosclerosis humana. Circulación 113, 2245–2252 (2006).

Lee, H. y col. Entrega de ARNip hepático usando apolipoproteína A-I humana recombinante en ratones. Biochem. Biophys. Res. Comun. 378, 192–196 (2009).

Fukao, T. et al. Un mecanismo conservado evolutivamente para la expresión de microARN-223 revelado por el perfil de genes de microARN. Celda 129, 617–631 (2007).

Gentner, B. et al. Derribo estable de microARN en vivo por vectores lentivirales. Nat. Métodos 6, 63–66 (2009).

Eyholzer, M. et al. Complejidad de la regulación de miR-223 por CEBPA en AML humana. Leuk. Res. 34, 672–676 (2010).

Fazi, F. y col. Un minicircuito compuesto por microARN-223 y factores de transcripción NFI-A y C / EBPα regula la granulopoyesis humana. Celda 123, 819–831 (2005).

Pulikkan, J. A. et al. El regulador del ciclo celular E2F1 y el microARN-223 comprenden un circuito de retroalimentación negativa autorreguladora en la leucemia mieloide aguda. Sangre 115, 1768–1778 (2010).

Lu, H., Buchan, R. J. & amp Cook, S. A. El microARN-223 regula la expresión de Glut4 y el metabolismo de la glucosa de los cardiomiocitos. Cardiovasc. Res. 86, 410–420 (2010).

Yu, C. H., Xu, C. F. & amp Li, Y. M. Asociación de expresión de MicroRNA-223 con lesión por reperfusión / isquemia hepática en ratones. Cavar. Dis. Sci. 54, 2362–2366 (2009).

Sugatani, T. & amp Hruska, K. A. El microARN-223 es un factor clave en la diferenciación de los osteoclastos. J. Cell Biochem. 101, 996–999 (2007).

Iida, H. y col. La expresión de efrina-A1 contribuye a las características malignas de <α>-carcinoma hepatocelular productor de fetoproteína. Intestino 54, 843–851 (2005).

Huang, L. y col. Separación por inmunoafinidad de proteínas plasmáticas mediante microperlas de IgY: satisfaciendo las necesidades de preparación y análisis de muestras proteómicas. Proteómica 5, 3314–3328 (2005).

Nieuwland, R. et al. Origen celular y propiedades procoagulantes de las micropartículas en la sepsis meningocócica. Sangre 95, 930–935 (2000).

Matz, C. E. & amp Jonas, A. Complejos micelares de apolipoproteína A-I humana con fosfatidilcolinas y colesterol preparados a partir de dispersiones de lípido-colato. J. Biol. Chem. 257, 4535–4540 (1982).

Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S. & amp Enright, A. J. miRBase: herramientas para la genómica de microARN. Ácidos nucleicos Res. 36, D154-158 (2008).

Cline, M. S. et al. Integración de redes biológicas y datos de expresión génica utilizando Cytoscape. Nat. Protocolos. 2, 2366–2382 (2007).

Li, C. & amp Wong, W. H. Análisis basado en modelos de matrices de oligonucleótidos: cálculo del índice de expresión y detección de valores atípicos. Proc. Natl Acad. Sci. Estados Unidos 98, 31–36 (2001).


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