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¿Cómo debo enviar plásmidos?

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Envié 10 µL de mi minipreparación vectorial a un colaborador en un eppendorf de 1,5 ml cerrado con parafina y lo metí en una cónica de 50 ml con un relleno de toallas de papel. Sin embargo, algo sucedió en el camino y no había nada (sin líquido) en el tubo cuando llegó. No hicieron ningún comentario sobre el tubo de la microcentrífuga que se abrió o se rompió el parafilm, por lo que no sucedió nada loco, pero sí sucedió algo.

¿Cuál es la forma más confiable de enviar plásmidos?


Resumen

  • los 10 uL de plásmido miniprep pueden haber salpicado en la tapa del tubo (AnnaF)
  • Es posible que el tubo Eppendorf se haya despresurizado durante el envío aéreo y haya permitido que los 10 uL se escapen y se evaporen.
  • solución: intente secar al aire o secar (Jonas) sus minipreparaciones antes del envío aéreo

Detalles

Como escribió AnnaF, los 10 uL de su plásmido podrían haber estado ocultos en la tapa o dispersos alrededor del tubo, haciendo que parezca vacío. Debe consultar con sus colaboradores para asegurarse de que lo centrifugaron.

Según un documento de fedex sobre el envío de productos perecederos (pdf) y un documento que mide la temperatura y la presión de los envíos aéreos (pdf), los envíos aéreos de fedex y ups pueden experimentar entornos de baja presión alrededor de 0,56 - 0,74 atmósferas (atm). A estas presiones relativamente bajas, quizás un tubo eppendorf sellado a 1 atm podría romperse. Los documentos también señalan que los envíos terrestres que pasan sobre las montañas rocosas (es decir, en Colorado) pueden experimentar ~ 0,64 atm.

Entonces, ¿quizás su tubo Eppendorf de 1,5 ml se despresurizó durante el envío?

Sería interesante hacer algunas pruebas sobre la resistencia a la presión de los tubos Eppendorf.

Con respecto a la pregunta original, en 2007 preparé y envié (fedex) una biblioteca de miles de minipreps a cientos de usuarios. Se dispensó 1 ul de miniprep en pocillos de placas de 384 pocillos y se secaron al aire, luego se sellaron con aluminio y luego se enviaron por correo. Los usuarios rehidratan un pozo con 10 uL de agua. Generalmente funciona.


Una forma bastante segura de enviar plásmidos es ponerlos en papel de filtro (ver protocolo y enviar una carta. Mucho más barato.


¿Intentaron centrifugar el tubo cuando llegó allí para empujar todo el líquido al fondo? Sé que especialmente cuando se trabaja con cantidades tan pequeñas que incluso agitándolo un poco se puede dispersar el contenido por todo el tubo. Hemos recibido plásmidos de otros laboratorios antes. En términos generales, los plásmidos se envían en tubos de microcentrífuga con tapón de rosca dentro de algún tipo de recipiente. Esto luego se empaqueta en un pequeño enfriador de espuma con hielo seco para mantener todo frío.


Dado que los tubos se pueden triturar en el correo, la forma más segura de enviar plásmidos es gotear unos uL en un papel de filtro y luego envolverlo para sellarlo con parafilm y completar un formulario detallado sobre su contenido.

Buena suerte.


Nos hemos metido en situaciones similares cuando otros laboratorios nos han enviado plásmidos (o cuando sacamos tubos antiguos de cajas de almacenamiento a -20), y desde entonces hemos adoptado el método del papel de filtro. Otro punto a tener en cuenta es que puede agregar, digamos, 10 μL de agua al tubo "vacío" (Mac) y usar 1 μL para una transformación. Siempre nos ha funcionado. ¡El ADN es aparentemente invisible!


También recomendaré encarecidamente secar un microgramo de su ADN plasmídico en un trozo de papel de filtro (el papel de filtro es importante para la extracción en el extremo receptor). Además, es muy útil si indica claramente la cantidad de ADN (aproximadamente) y encierra en un círculo el ADN borrado en un bolígrafo para que no haya ambigüedad al cortar el círculo de papel de filtro que contiene el ADN.

En el extremo receptor, siempre debe congelar el papel de inmediato o eluir el ADN del papel en tampón TE o agua y luego congelar. Si no lo hace, eventualmente conducirá a la degradación de la ADNasa del ADN plasmídico y luego tendrá que esperar otro envío.


Plásmidos

David P. Clark,. Michelle R. McGehee, en Biología Molecular (tercera edición), 2019

2 Propiedades generales de los plásmidos

Los plásmidos suelen ser moléculas circulares de ADN, aunque ocasionalmente existen plásmidos lineales o hechos de ARN. Pueden encontrarse como copias únicas o múltiples y pueden portar de media docena a varios cientos de genes. Los plásmidos solo pueden multiplicarse dentro de una célula huésped. La mayoría de los plásmidos habitan en bacterias y, de hecho, alrededor del 50% de las bacterias que se encuentran en la naturaleza contienen uno o más plásmidos. Los plásmidos también se encuentran en organismos superiores como levaduras y hongos. El círculo de levadura de 2 micrones (discutido más adelante) es un ejemplo bien conocido que ha sido modificado para su uso como vector de clonación.

La mayoría de los plásmidos son circulares, hechos de ADN y mucho más pequeños que los cromosomas.

los número de copia es el número de copias del plásmido en cada célula bacteriana. Para la mayoría de los plásmidos, es 1 o 2 copias por cromosoma, pero puede llegar a 50 o más para ciertos plásmidos pequeños como los plásmidos ColE. El número de copias influye en la fuerza de las características transmitidas por plásmidos, especialmente la resistencia a los antibióticos. Cuantas más copias del plásmido por célula, más copias habrá de los genes de resistencia a los antibióticos y, por lo tanto, mayor será el nivel resultante de resistencia a los antibióticos.

El tamaño de los plásmidos varía enormemente. El plásmido F de Escherichia coli es bastante promedio a este respecto y es aproximadamente el 1% del tamaño de la E. coli cromosoma. La mayoría de los plásmidos multicopia son mucho más pequeños (los plásmidos ColE tienen aproximadamente un 10% del tamaño del plásmido F). A veces se encuentran plásmidos muy grandes, hasta el 10% del tamaño de un cromosoma, pero es difícil trabajar con ellos y pocos se han caracterizado adecuadamente (ver Cuadro 23.02).

Cuando el genoma de la bacteria Gram-negativa Vibrio cholerae, el agente causante del cólera, fue secuenciado, se encontró que consistía en dos cromosomas circulares de 2.961.146 y 1.072.314 pb. En conjunto, esto totaliza aproximadamente 4 millones de pares de bases y codifica alrededor de 3900 proteínas, aproximadamente la misma cantidad de información genética que E. coli. Muchos genes que parecen tener orígenes fuera de las bacterias entéricas, como se deduce de su diferente composición de bases, se encontraron en el cromosoma más pequeño. Muchos de estos genes carecen de homología con los genes caracterizados y tienen una función desconocida. El cromosoma más pequeño también lleva un sistema de captura de genes integrones (consulte el Capítulo 25: ADN móvil) y alberga genes de “adicción” que se encuentran típicamente en los plásmidos (que se comentan más adelante). Además, el cromosoma más pequeño se replica mediante un mecanismo diferente al del cromosoma grande. De hecho, el cromosoma más pequeño comparte un sistema de replicación con una familia de plásmidos ampliamente distribuidos. Parece probable que el cromosoma más pequeño se originó como un plásmido que ha crecido hasta su tamaño actual al acumular genes de diversas fuentes externas. Quizás sea mejor considerar el cromosoma más pequeño como un "megaplasmido.”Los datos de la secuencia del genoma sugieren que alrededor del 10% de las bacterias portan estos megaplasmidos, aunque el tamaño varía considerablemente. En la mayoría de estos casos, el cromosoma más grande contiene casi todos los genes necesarios para las funciones vitales de las células, como la síntesis de proteínas, ARN y ADN. En unos pocos casos, estos megaplasmidos pueden transferirse a bacterias relacionadas mediante conjugación.

Algunos plásmidos están presentes en una o dos copias por célula, mientras que otros ocurren en múltiples copias.

Los plásmidos portan genes para manejar sus propios ciclos de vida y algunos plásmidos portan genes que afectan las propiedades de la célula huésped. Estas propiedades varían mucho de un plásmido a otro, siendo la más conocida la resistencia a varios antibióticos. Plásmidos crípticos son aquellos que no confieren un fenotipo identificable a la célula huésped. Es de suponer que los plásmidos crípticos portan genes cuyas características aún se desconocen. Los plásmidos que se modifican para diferentes propósitos se utilizan en la investigación de biología molecular y, a menudo, se utilizan para transportar genes durante la ingeniería genética.

La gama de plásmidos de hospedadores varía ampliamente. Algunos plásmidos están restringidos a unas pocas bacterias estrechamente relacionadas, por ejemplo, el plásmido F solo habita E. coli y bacterias entéricas relacionadas como Shigella y Salmonela. Otros tienen una amplia gama de huéspedes, por ejemplo, los plásmidos de la familia P pueden vivir en cientos de especies diferentes de bacterias. Aunque ahora se suele considerar que "P" significa "promiscuo", debido a su rango de hospedadores inusualmente amplio, estos plásmidos originalmente recibieron el nombre de Pseudomonas, la bacteria en la que fueron descubiertos. A menudo son responsables de la resistencia a múltiples antibióticos, incluidas las penicilinas.

Ciertos plásmidos pueden moverse de una célula bacteriana a otra, una propiedad conocida como transferibilidad . Muchos plásmidos de tamaño mediano, como los plásmidos tipo F y tipo P, pueden hacer esto y se denominan Tra + (transferencia positiva). Dado que la transferencia de plásmidos requiere más de 30 genes, solo los plásmidos medianos o grandes poseen esta capacidad. Los plásmidos muy pequeños, como los plásmidos ColE, simplemente no tienen suficiente ADN para acomodar los genes necesarios. No obstante, muchos plásmidos pequeños, incluidos los plásmidos ColE, tienen movilizabilidad , lo que significa que pueden ser movilizados por plásmidos autotransferibles [es decir, son Mob + (movilización positiva)]. Sin embargo, no todos los plásmidos de transferencia negativa pueden movilizarse. Algunos plásmidos transferibles (por ejemplo, el plásmido F) también pueden movilizar genes cromosómicos. Fue esta observación la que permitió el desarrollo original de la genética bacteriana utilizando E. coli. Por tanto, el mecanismo de transferencia de plásmidos y las condiciones necesarias para la transferencia de genes cromosómicos se analizan en el capítulo 28, Genética bacteriana.

Algunos plásmidos pueden transferirse entre células bacterianas y algunos también pueden transferir genes cromosómicos.

2.1 Familias de plásmidos e incompatibilidad

Dos plásmidos diferentes que pertenecen a la misma familia no pueden coexistir en la misma célula. Esto se conoce como incompatibilidad . Los plásmidos se clasificaron originalmente por incompatibilidad, por lo que las familias de plásmidos a menudo se conocen como grupos de incompatibilidad y se designan con letras del alfabeto (F, P, I, X, etc.). Los plásmidos del mismo grupo de incompatibilidad tienen secuencias de ADN muy similares en sus genes de replicación y partición, aunque los otros genes que portan pueden ser muy diferentes. Es muy posible tener dos o más plásmidos en la misma célula siempre que pertenezcan a familias diferentes. Por tanto, un plásmido de tipo P compartirá felizmente la misma célula con un plásmido de la familia F (figura 23.03).

Figura 23.03. Incompatibilidad de plásmidos

Los plásmidos con diferentes orígenes de replicación y diferentes genes de replicación pueden habitar la misma célula bacteriana y se consideran compatibles (izquierda). Durante la división celular, ambos tipos de plásmidos se replican, por lo tanto, cada célula hija heredará ambos plásmidos, al igual que la célula madre. Por otro lado, si dos plásmidos tienen orígenes y genes de replicación idénticos, son incompatibles y no se replicarán durante la división celular (derecha). En cambio, los dos plásmidos se dividen en diferentes células hijas.

Los plásmidos se clasifican en familias cuyos miembros comparten genes de replicación muy similares.

2.2 Los plásmidos ocasionales son lineales o están hechos de ARN

Aunque la mayoría de los plásmidos son moléculas circulares de ADN, existen excepciones ocasionales. Se han encontrado plásmidos lineales de ADN de doble hebra en una variedad de bacterias, hongos y plantas superiores. Los plásmidos lineales mejor caracterizados se encuentran en esas pocas bacterias como Borrelia y Streptomyces que también contienen cromosomas lineales. Los replicones lineales de ADN en bacterias no están protegidos por telómeros como los cromosomas lineales de eucariotas. En cambio, una variedad de adaptaciones individuales protegen los extremos de las endonucleasas.

Los plásmidos lineales tienen estructuras especiales para proteger los extremos del ADN.

En Borrelia, en realidad no hay extremos libres de ADN. En cambio, las secuencias en horquilla de ADN monocatenario forman bucles en los extremos tanto de los plásmidos lineales como de los cromosomas (fig. 23.04A). Algunos virus animales, como el iridovirus que causa la peste porcina africana, tienen estructuras similares. Diferentes especies de Borrelia Causar la enfermedad de Lyme y fiebre recurrente. Sus plásmidos lineales parecen codificar tanto las hemolisinas que dañan las células sanguíneas como las proteínas de la superficie que protegen a las bacterias del sistema inmunológico del huésped. Así, como ocurre con muchas otras bacterias infecciosas, los factores de virulencia de Borrelia también son en gran parte transmitidas por plásmidos.

Figura 23.04. Estructuras finales de plásmidos lineales

(A) Plásmidos lineales de Borrelia Forme bucles de horquilla en los extremos. (B) Plásmidos lineales de Streptomyces están recubiertos de proteínas que protegen los extremos del ADN. Si los plásmidos lineales hubieran expuesto extremos bicatenarios, esto desencadenaría sistemas de recombinación, reparación o degradación.

Los plásmidos lineales de Streptomyces son de hecho moléculas de ADN lineales genuinas con extremos libres. Tienen repeticiones invertidas en los extremos del ADN que se mantienen unidas por proteínas. Además, se unen covalentemente proteínas protectoras especiales a los extremos 5 'del ADN. El resultado neto es una estructura de raqueta de tenis (figura 23.04B). El ADN de los adenovirus, la mayoría de los plásmidos eucariotas lineales y algunos virus bacterianos muestran estructuras similares.

Los plásmidos lineales también se encuentran entre los eucariotas. El hongo Velutipes de flammulina, comúnmente conocido como hongo enoki, tiene dos plásmidos lineales muy pequeños dentro de sus mitocondrias. También se conocen varias plantas superiores que tienen plásmidos lineales en sus mitocondrias. La levadura láctea, Kluyveromyces lactis, tiene un plásmido lineal que normalmente se replica en el citoplasma. Sin embargo, en ocasiones, el plásmido se traslada al núcleo donde se replica como un círculo. La circularización se debe a la recombinación específica del sitio que involucra las repeticiones invertidas en los extremos de la forma lineal del plásmido. El papel fisiológico de estos plásmidos es oscuro.

Los plásmidos de ARN son raros y la mayoría están mal caracterizados. Se conocen ejemplos de plantas, hongos e incluso animales. Algunas cepas de la levadura Saccharomyces cerevisiae contienen plásmidos de ARN lineales. Se encuentran plásmidos de ARN similares en las mitocondrias de algunas variedades de plantas de maíz. Los plásmidos de ARN se encuentran tanto en formas monocatenarias como bicatenarias y se replican de manera similar a ciertos virus ARN. El plásmido de ARN codifica la ARN polimerasa dependiente de ARN que dirige su propia síntesis. A diferencia de los virus de ARN, los plásmidos de ARN no contienen genes para las proteínas de la cubierta. Las comparaciones de secuencias sugieren que la mayoría de los plásmidos de ARN son simplemente versiones defectuosas de los virus de ARN que han tomado residencia permanente después de perder la capacidad de moverse de una célula a otra como partículas de virus.


¿Cómo detectar plásmido en papel para su envío? - (09 / Feb / 2006)

Necesito enviar un plásmido (a uno de los colaboradores de nuestro laboratorio) secando en papel de filtro. ¿Alguien puede decirme el procedimiento exacto para hacerlo: cuál es la cantidad de ADN que se debe detectar, qué papel usar, cuánto tiempo dejarlo reposar, etc. Gracias.

Puede ubicar su plásmido en un trozo de papel de filtro. Antes de detectar, puede dibujar un círculo en el papel con un lápiz para que el receptor sepa dónde está. No existe un límite real en la cantidad de plásmido que puede detectar, todo depende de la concentración de su ADN.

Entonces, ¿empapas el trozo de papel de filtro en celdas de compensación y lo transformas o qué?

He oído hablar de esta técnica antes, pero no la he probado.

Entonces, ¿empapas el trozo de papel de filtro en celdas de compensación y lo transformas o qué?

He oído hablar de esta técnica antes, pero no la he probado.

empapa el trozo de papel de filtro en TE (tomo una punta estéril y aprieto un poco) luego toma, digamos, 5-10ul y transforma.

Oye, Matt, si estás buscando algunas referencias técnicas, esto está disponible comercialmente como un producto llamado Clonesaver.


Procedimiento experimental

Digerir y purificar el vector:

Mientras espera que lleguen sus oligos, realice una digestión de restricción de 1 μg de vector con EcoRI y SalI

Ejecute un gel de agarosa y corte la banda que contiene su vector de ADN

Purifique en gel su ADN lejos de la agarosa usando un kit o protocolo estándar disponible comercialmente.

Oligos de recocido:

Los oligos deben resuspenderse en tampón de hibridación (Tris 10 mM, pH 7,5-8,0, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM) y mezclarse en concentraciones equimolares. Recomendamos mezclar 2 μg cada uno en un volumen total de 50 μL; agregue tampón de recocido adicional si es necesario para llegar a 50 μL. El recocido eficiente se puede lograr mediante uno de dos métodos:

Coloque los oligos mezclados en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.

Coloque el tubo en un bloque caliente a 90-95 ° C y déjelo durante 3-5 minutos.

Retire el bloque caliente de la fuente de calor (apague o mueva el bloque a la parte superior de la mesa) permitiendo un enfriamiento lento a temperatura ambiente (

Coloque los oligos mezclados en un tubo de PCR.

Coloque el tubo en un termociclador programado para comenzar a 95 ° C durante 2 minutos.

Luego, enfríe gradualmente a 25 ° C durante 45 minutos.

Ligadura:

Diluir 5 μl de oligos recocidos con 45 μl de agua libre de nucleasas y cuantificar la concentración (debe ser de aproximadamente 8 ng / μl).

Mezcle los oligos recocidos con el vector cortado en proporciones molares (vector: inserto) entre 4: 3 y 1: 6 en una reacción de ligación estándar (por ejemplo, para ligar un inserto de oligo recocido de 50 pb de longitud en un vector de 5 kb, mezcle 100 ng del vector con 0,75-6 ng de oligos recocidos).

Transforme 2-3μL en su placa y bacterias competentes favoritas.

Asegúrese de elegir varias colonias para la preparación mínima y verifique el inserto mediante la secuenciación.


Tipos de plásmidos de control

Parte de la planificación de su experimento incluye determinar qué factores deben controlarse para eliminar cualquier interpretación alternativa de los resultados. Normalmente, los experimentos basados ​​en plásmidos emplean controles de transfección, negativos, positivos y replicados.

Controles de transfección: vector vacío y control interno

Un control de transfección mide la eficiencia de la transfección y permite la observación de cualquier efecto que la transfección en sí misma (es decir, el vector usado en la transfección, reactivo de transfección o proceso de transfección) pueda tener en las células diana. Un control de transfección es un control de vector vacío específicamente, el plásmido sin la variable independiente. Volviendo al experimento asociado con la Figura 1, la variable independiente es el ARNhc. Por lo tanto, el vector de control vacío sería el plásmido A sin shRNA, o el esqueleto Y solo. El control de vector vacío le permite examinar si los reactivos de transfección o el proceso de transfección en sí tienen efectos citotóxicos en las células diana.

Otro tipo de control de la transfección es un vector de control interno, que mide la eficiencia de la transfección. Un control interno puede ser un plásmido que expresa constitutivamente una proteína informadora (p. Ej., GFP o luciferasa) que se cotransfecta con el plásmido de prueba o se transfecta en un pocillo separado de sus células. Independientemente, la cantidad de actividad de la proteína informadora se correlaciona tanto con la cantidad de ADN transfectado en las células como con la capacidad de las células para expresar la proteína.

En el análisis del resultado de la Figura 1, un control interno, como el Plásmido B que expresa GFP, podría demostrar si las células se transfectaron con éxito y expresaron la proteína. Por ejemplo, las imágenes de microscopía de fluorescencia resultantes de nuestro experimento que incluye el control interno mencionado anteriormente y es consistente con el resultado de la Figura 1 podrían verse así:

Figura 2: Expresión del plásmido B (como control interno)

Este resultado indica que la transfección no tuvo éxito debido a la ausencia de fluorescencia de GFP de las células vivas viables. Este resultado presenta una oportunidad para la resolución de problemas y la optimización de los reactivos y el proceso de transfección. Es importante señalar que las condiciones experimentales óptimas, incluida la cantidad de ADN plasmídico a utilizar para cualquier individuo o cotransfección, deben determinarse empíricamente.

Controles negativos: células no tratadas, control de vector vacío y control no dirigido

Las condiciones de control negativas y los plásmidos deberían producir un efecto nulo (es decir, no se observa ningún fenómeno). En cualquier experimento basado en plásmidos, las células no tratadas deben incluirse ya que proporcionan la línea de base / estándar con la que se pueden comparar otras muestras.

El control de vectores vacíos (mencionado anteriormente) también podría servir como un control negativo importante. En este contexto, el control de vector vacío muestra cualquier efecto del vector / columna vertebral en sí mismo sobre la expresión génica en las células objetivo.

En experimentos que emplean tecnologías de selección de genes o de edición del genoma, como RNAi o CRISPR, los controles no dirigidos pueden ser apropiados, ya que le permiten evaluar la especificidad del resultado observado. Los controles no dirigidos son controles negativos que producen un producto similar, pero no se dirigen a un gen endógeno en sus células experimentales. Por ejemplo, en el experimento anterior, el plásmido A contiene un ARNhc que se dirige al gen X humano y se están transfectando células humanas. Un control de no focalización adecuado en este experimento podría ser un ARNhc, en la misma columna vertebral que el Plásmido A, que no se dirige a ningún gen de mamífero. Este control de no focalización es fundamental para la interpretación correcta de los resultados porque proporciona un punto de referencia importante al analizar la especificidad del ARNhc que se dirige al Gen X humano. El control de no focalización también evalúa cualquier efecto de la introducción general de ARNhc en su células objetivo.

Controles positivos

Los plásmidos de control positivo deberían producir el fenómeno esperado. Un ejemplo de control positivo, el vector de control interno, se describió anteriormente. Una vez que esté seguro de que sus condiciones son propicias para la entrega exitosa de ADN plasmídico en las células, el vector de control interno sirve como control positivo para la transfección porque produce el efecto esperado, que son las células fluorescentes verdes (Figura 3).

Figura 3: Expresión del plásmido B (como control positivo)

Otros controles positivos son específicos del experimento y deben diseñarse en consecuencia. Si está intentando activar un gen, debe diseñar un control que muestre la activación máxima. Del mismo modo, si está tratando de reprimir un gen, su control podría ser un sistema en el que la expresión de ese gen se anule por completo. Estos controles pueden o no estar basados ​​en plásmidos dependiendo de las necesidades experimentales. Usando nuestro experimento como ejemplo, el resultado esperado del ARNhc que se dirige al gen X humano en el plásmido A es la disminución de la expresión del gen X. Ergo, los controles positivos deberían disminuir la expresión del gen X.

Dado que la característica clave de un plásmido de control es minimizar los efectos de las variables no independientes dentro de un experimento, tanto el diseño como la selección de los plásmidos de control positivo deben ser muy específicos para el experimento y la interrogación de la variable independiente.


¿Cómo se inicia y se detiene la replicación?

Además de los genes, los plásmidos a menudo incluyen promotores y terminadores de la transcripción derivados de E. coli fagos. Los promotores de los fagos SP6 y T7 se utilizan a menudo para in vitro Amplificación de ARN. Requieren polimerasas de fagos y, por lo tanto, están inactivas. en vivo.

A continuación se muestra un mapa de pTLNX, un vector de expresión de ovocitos de Xenopus (Figura 2). Además del conocido origen pBR322 y genes de resistencia a antibióticos AmpR y CmR (resistencia al cloranfenicol), también están presentes los promotores SP6 y lacUV. Aguas abajo del promotor SP6, el terminador rrnBT2 permite la terminación eficiente de genes clonados en el sitio 2 de clonación múltiple (Figura 2).

El vector pTLNX también tiene un gen para la selección de plásmidos (ccdB), junto con la señal de localización nuclear del virus SV40 y Xenopus globina 3 ’UTR, que permite altos niveles de expresión de genes clonados.


Muchas bacterias contienen elementos extracromosómicos de ADN llamados plásmidos. Suelen ser moléculas pequeñas (unos pocos 1000 pb), circulares, de doble hebra que se replican independientemente del cromosoma y pueden estar presentes en un elevado número de copias dentro de una célula. En la naturaleza, los plásmidos se pueden transferir entre individuos durante el apareamiento bacteriano y, a veces, incluso se transfieren entre diferentes especies. Los plásmidos son particularmente importantes en medicina porque a menudo portan genes de patogenicidad y resistencia a los medicamentos. En el laboratorio, los plásmidos se pueden insertar en bacterias en un proceso llamado transformación.

Para insertar un fragmento de ADN en un plásmido, tanto el fragmento como el plásmido circular se cortan usando una enzima de restricción que produce extremos compatibles (Figura ( PageIndex <1> )). Dada la gran cantidad de enzimas de restricción que están disponibles actualmente, generalmente no es demasiado difícil encontrar una enzima para la que estén presentes las secuencias de reconocimiento correspondientes tanto en el plásmido como en el fragmento de ADN, particularmente porque la mayoría de los vectores de plásmido utilizados en biología molecular han sido diseñados para contener sitios de reconocimiento para un gran número de endonucleasas de restricción.

Figura ( PageIndex <1> ): Clonación de un fragmento de ADN (rojo) en un vector plasmídico. El vector ya contiene un gen marcador seleccionable (azul) como un gen de resistencia a antibióticos. (Original-Deyholos-CC: AN)

Después de la digestión por restricción, los fragmentos deseados pueden purificarse o seleccionarse adicionalmente antes de mezclarse con ligasa para unirlos. Después de una breve incubación, los plásmidos recién ligados, que contienen el gen de interés, son transformado dentro E. coli. La transformación se logra mezclando el ADN ligado con E. coli células que han sido especialmente preparadas (es decir, hechas competente) para captar ADN. Se pueden producir células competentes mediante la exposición a compuestos como CaCl.2 oa campos eléctricos (electroporación). Debido a que solo una pequeña fracción de las células que se mezclan con el ADN se transformará realmente, una marcador seleccionable, como un gen de resistencia a los antibióticos, también suele estar presente en el plásmido. Después de la transformación (combinando ADN con células competentes), las bacterias se esparcen en una placa de agar bacteriano que contiene un antibiótico apropiado para que solo aquellas células que realmente hayan incorporado el plásmido puedan crecer y formar colonias. A continuación, puede seleccionarse y utilizarse para estudios posteriores.

Los biólogos moleculares utilizan plásmidos como vectores para contener, amplificar, transferir y, a veces, expresar genes de interés que están presentes en el ADN clonado. A menudo, el primer paso en un experimento de biología molecular es clon (es decir, copiar) un gen en un plásmido, luego transformar este plásmido recombinante nuevamente en bacterias para que se puedan hacer copias esencialmente ilimitadas del gen (y el plásmido que lo lleva) a medida que las bacterias se reproducen. Esta es una necesidad práctica para manipulaciones adicionales del ADN, ya que la mayoría de las técnicas de biología molecular no son lo suficientemente sensibles como para trabajar con una sola molécula a la vez. Muchos experimentos de clonación y recombinación molecular son, por tanto, procesos iterativos en los que:

  1. un fragmento de ADN (generalmente aislado por PCR y / o digestión de restricción) se clona en un plásmido cortado con una enzima de restricción compatible
  2. el plásmido recombinante se transforma en bacteria
  3. Se permite que las bacterias se multipliquen, generalmente en cultivo líquido.
  4. una gran cantidad de ADN plasmídico recombinante se aísla del cultivo bacteriano
  5. Se llevan a cabo manipulaciones adicionales (como mutagénesis dirigida al sitio o la introducción de otro fragmento de ADN) en el plásmido recombinante.
  6. el plásmido modificado se transforma nuevamente en bacterias, antes de manipulaciones adicionales, o para expresión

Una aplicación de la clonación molecular: producción de insulina recombinante

La proteína de insulina purificada es fundamental para el tratamiento de la diabetes. Antes de

En 1980, se aisló insulina para uso clínico de cadáveres humanos o de animales sacrificados como cerdos. La insulina de origen humano generalmente tiene mejores propiedades farmacológicas, pero su suministro es limitado y conlleva riesgos de transmisión de enfermedades. Al clonar el gen de la insulina humana y expresarlo en E. coli, se podrían producir grandes cantidades de insulina idéntica a la hormona humana en fermentadores, de manera segura y eficiente. La producción de insulina recombinante también permite la producción de variantes especializadas de la proteína: por ejemplo, cambiando algunos aminoácidos, se pueden producir formas de la hormona de acción más prolongada. La hormona insulina activa contiene dos fragmentos peptídicos de 21 y 30 aminoácidos, respectivamente. Hoy en día, esencialmente toda la insulina se produce a partir de fuentes recombinantes (Figura ( PageIndex <2> )), es decir, genes humanos y sus derivados expresados ​​en bacterias o levaduras.

Figura ( PageIndex <2> ): Un vial de insulina. Tenga en cuenta que la etiqueta indica el origen como & ldquorDNA & rdquo, que significa ADN recombinante (Flickr-DeathByBokeh-CC: AN).


Un plásmido es una molécula circular de ADN de doble hebra que generalmente se encuentra en bacterias y que es capaz de replicarse independientemente del ADN cromosómico de la célula. Por lo general, los plásmidos permiten que las bacterias desarrollen alguna ventaja, como la resistencia a los antibióticos. Una célula bacteriana puede tener más de un plásmido, expresará los genes en esos plásmidos y replicará cada plásmido cuando se divida. De esta forma, cada célula hija obtendrá una copia del plásmido. Los plásmidos se utilizan a menudo con fines de clonación, ya que los genes de interés (fragmentos de ADN) pueden insertarse en plásmidos e introducirse en las bacterias por bacterias. transformación. En la transformación bacteriana, las bacterias competentes en las que la pared celular se ha hecho permeable al material genético pueden absorber un plásmido extraño. Las bacterias que han absorbido el plásmido pueden seleccionarse generalmente cultivando las bacterias en un determinado antibiótico al que el ADN del plásmido permite resistencia. De esta manera, a medida que las bacterias dividen el plásmido y, por lo tanto, los genes que contienen, se amplificarán.

Se trata de enzimas que cortan el ADN en sitios de reconocimiento específicos que suelen tener de 4 a 8 pares de bases de longitud. Los sitios también suelen ser palindrómicos, lo que significa que se leen lo mismo hacia adelante y hacia atrás. Las enzimas de restricción también producirán extremos "pegajosos" o "romos". Estos extremos se pueden usar para insertar el gen de interés en un plásmido mediante ligación.

Ex. Extremo adhesivo donde las bases se dejan sin emparejar después de un corte

Ex. Extremo romo donde todas las bases se emparejan después de un corte


NUEVOS TAMAÑOS

los Base de datos CGSC de E. coli la información genética incluye genotipos e información de referencia para el son en la colección CGSC, los nombres, sinónimos, propiedades y posición del mapa para genes, producto genético información e información sobre mutaciones y referencias a la literatura primaria. La versión pública de la base de datos incluye esta información y se puede consultar directamente a través de este servidor web CGSC DB. Para obtener ayuda, utilice los enlaces de ayuda que se encuentran arriba y en cada formulario de consulta, o contáctenos directamente.


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Si. Yale recibe tarifas internacionales competitivas de FedEx, UPS, DHL y USPS, por lo que es recomendable utilizar eShipGlobal para envíos internacionales de FedEx, UPS, DHL y USPS por esta razón, así como por los otros beneficios enumerados anteriormente.

No. Actualmente, eShipGlobal solo está configurado para usarse con instrucciones de carga de la Universidad, no con tarjetas de crédito personales, que serían necesarias para procesar una transacción personal.

Si comete un error o necesita actualizar una etiqueta, debe cancelar el envío y crear una nueva etiqueta. Tenga en cuenta que no puede editar ni reutilizar una etiqueta. Por diseño, cada paquete debe tener una etiqueta de envío única porque cada código de barras es un punto de control para el transportista.

La buena noticia es que eShipGlobal también le brinda la posibilidad de cancelar un envío usted mismo y crear una nueva etiqueta en lugar de llamar al transportista para cancelar el envío, lo que normalmente resulta en una tarifa de corrección de $ 10.

Es demasiado tarde para cancelar la entrega de un paquete una vez que se ha colocado en un buzón o el transportista lo ha recogido.

Aunque no se le facturarán los envíos que no hayan sido recibidos por el transportista, se recomienda que cancele las etiquetas que no se utilizan. Para cancelaciones el mismo día, haga clic en Mis Envíos desde la ventana de navegación principal de eShipGlobal, luego seleccione Historial de envíos, ingrese el Número de seguimiento o Número de pedido en el cuadro provisto, haga clic en Generar, seleccione el paquete que le gustaría cancelar y luego haga clic en Cancelar.

Si creó anteriormente una etiqueta de envío que es de otra fecha (no hoy), envíe un correo electrónico a & # 115 & # 117 & # 112 & # 112 & # 111 & # 114 & # 116 & # 64 & # 101 & # 115 & # 104 & # 105 & # 112 & # 103 & # 108 & # 111 & # 98 & # 97 & # 108 & # 46 & # 99 & # 111 & # 109. El correo electrónico debe incluir el número de seguimiento del envío que desea cancelar y eShipGlobal cancelará el envío en su nombre.

Sí, si no está utilizando un buzón que pertenece al transportista o tiene un horario de recogida establecido con el transportista, igualmente deberá notificar al servicio de entrega para que recoja su paquete para la entrega.

eShipGlobal tiene una función útil llamada Drop Locator. Simplemente seleccione el transportista de envío y luego escriba su dirección y buscará para encontrar el buzón más cercano a usted.

Después de acceder a eShipGlobal, haga clic en "Suministros" en la parte superior de la página para obtener instrucciones sobre cómo solicitar suministros a FedEx, UPS, DHL y USPS.

Los materiales de investigación se definen generalmente como materiales que se utilizan en entornos de laboratorio tales como animales, biológicos (cultivos o reservas de patógenos humanos o animales, agentes selectos o toxinas, materiales humanos o animales, microorganismos genéticamente modificados, vectores, plásmidos, etc.) , químico o radiactivo y hielo seco.

Algunos materiales de investigación pueden no ser necesariamente peligrosos, pero se convierten en materiales regulados una vez que se transportan.

Si. Para mejorar el cumplimiento, eShipGlobal está integrado con el sistema TMS de Yale. Cuando inicia sesión con su Yale NetId y contraseña, el sistema proporciona verificación automática de entrenamiento.

Los cursos de formación sobre sustancias biológicas y paquetes de hielo seco están disponibles en línea. En la mayoría de los casos, si necesita capacitación, podrá completar el requisito de capacitación y enviar su paquete el mismo día.

Aunque la información de la empresa y de contacto no se puede modificar porque está vinculada al sistema TMS para la verificación de la formación, puede cambiar su dirección de envío. Desde el formulario de envío de Materiales de investigación en el sistema eShipGlobal, haga clic en el Editar botón debajo de su información de envío. Luego actualice la información de la dirección y haga clic en Guardar cambios.

FedEx y DHL son transportistas autorizados para enviar materiales de investigación. Cuando se proporciona una dirección completa (incluido el código postal), FedEx aparecerá con frecuencia para los envíos nacionales e internacionales. DHL aparecerá para entregas internacionales.

EHS revisará todas las solicitudes de envío internacional antes de otorgar autorización para continuar con el envío.

Haga clic en Mis Envíos desde la ventana de navegación principal de eShipGlobal, luego seleccione Historial de envío de materiales de investigación. Para filtrar su historial, puede ingresar un número de seguimiento del operador, un número de pedido de eShipGlobal o un rango de fechas. Luego haga clic en Generar.

Se debe completar un formulario en línea de “Solicitud de envío de materiales de investigación” antes de enviar cualquier material de investigación entre campus. Consulte el sitio web de Salud y Seguridad Ambiental para acceder al formulario o llame al 203.785.3550 para obtener más información.

El almacén de la Facultad de Medicina (Sterling Hall of Medicine, 333 Cedar Street, SHM I-E7) y la torre de biología Kline (219 Prospect Street, KBT C-11) tienen cajas disponibles para la mayoría de los envíos que contienen materiales biológicos del almacén. Los suministros también están disponibles en Workday a través de SciQuest.

* Los suministros de envío de categoría A no se pueden reutilizar.

Comuníquese con el Centro de soporte financiero al 203.432.5394 para obtener ayuda con el envío de paquetes nacionales e internacionales estándar.

Comuníquese con Salud y Seguridad Ambiental al 203.785.3550 si tiene alguna pregunta sobre la categorización de materiales de investigación o el envío de paquetes que contienen hielo seco.

Una vez que haya ingresado la información necesaria para su guía aérea, imprimirá la etiqueta (guía aérea) en papel de oficina blanco normal dentro de la solución eShipGlobal. Simplemente doble el papel por la mitad y coloque solo ese pedazo de papel en la bolsa de plástico con la información de envío a la vista y ¡listo! No se requieren formularios y no se necesitan copias para las entregas nacionales al día siguiente. You can also email the package label to another sender.

There are two types of Return Shipments:

    If you create a shipment and want to include a prepaid airway bill for the receiver to send a package back to you.

After you create a shipment, from the shipment summary page, you have the option to create a return shipment

  • For Domestic shipments, you can do this for all Carriers and all package types
  • For International shipments, you can only do this for a FedEx Carrier Letter.

For Research Materials, you can use the Receive Research Materials From module to create the return shipment label. You can then email the shipper the airway bill from the shipment summary page.

When you create a shipment, select a Ship From (non-Yale address) and a Ship To (Yale address). You can then email the shipper the airway bill from the shipment summary page.

  • This can be done for Domestic and International shipments for all carriers and all package types.
    *Please note that some international shipments may require additional documentation that cannot be emailed to the shipper.

For Research Materials, you can use the Receive Research Materials From module to create the return shipment label. You can then email the shipper the airway bill from the shipment summary page.


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