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¿A dónde van las proteínas de membrana perdidas después de la exocitosis?

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Las vesículas exocitóticas eliminan las proteínas de la membrana y el glucocáliz de la superficie de la membrana plasmática de la célula. Cuando esas vesículas se liberan en el líquido intersticial y en cualquier otro lugar, ¿a dónde van?

¿Se adhieren a la vesícula en todas partes? ¿O se eliminan de la vesícula? Si la vesícula se fusiona con otra célula, ¿esas proteínas y carbohidratos se adhieren a la nueva célula?


En el proceso de exocitosis, los materiales que están a punto de ser liberados se transportan en pequeñas vesículas a la membrana plasmática. La membrana plasmática se fusiona con estas vesículas y esto libera las sustancias en el exterior de la célula. Vea la figura (desde aquí):

La otra posibilidad para las vesículas de transporte es que lleguen a su célula diana y se fusionen con la membrana y liberen la sustancia transportada a la célula o que sean captadas en otra vesícula que luego se dirija hacia el endosoma / lisosoma. Vea la figura (desde aquí):

No importa de qué manera se elija, la membrana de la vesícula se recicla ya sea por integración en otra membrana o pasando por el lisosoma.


Biología celular 04: La vía secretora

La vía secretora se refiere al retículo endoplásmico, el aparato de Golgi y las vesículas que viajan entre ellos, así como la membrana celular y los lisosomas. Se denomina & # 8216secretor & # 8217 por ser la vía por la cual la célula segrega proteínas en el entorno extracelular. Pero, como de costumbre, la etimología solo cuenta una fracción de la historia. Esta vía también procesa proteínas que estarán unidas a la membrana (ya sea en la membrana celular o en el ER o en las membranas de Golgi), así como enzimas lisosomales, y también cualquier proteína que vivirá su vida en la propia vía secretora. También hace otras cosas además de procesar proteínas.

El citosol y el & # 8216lumen & # 8217 (el líquido que llena la vía secretora) son entornos químicos diferentes y normalmente nunca se mezclan. El citosol es reductor (cuando estás en el citosol, sigues encontrando moléculas que quieren ofrecerte electrones), y el ER, el Golgi y el entorno extracelular son oxidativos (las moléculas siguen llegando a ti pidiendo electrones). Vea redox si todavía está confundido. Esto genera diferentes condiciones de plegamiento de proteínas: por ejemplo, los enlaces disulfuro generalmente solo se forman en condiciones oxidativas. Además, diferentes proteínas pueden vivir solo en la vía secretora o solo en el citosol. La vía secretora proporciona una ruta para que la célula maneje cosas que podrían no ser buenas en el citoplasma y / o son más útiles cuando se mantienen concentradas en un compartimento especializado con sus compañeros de interacción deseados. Los hepatocitos (en el hígado) secuestran medicamentos y toxinas en el RE liso y los descomponen para excretarlos del cuerpo allí. La vía secretora no es contigua, pero cada movimiento entre sus componentes está en pequeños microcosmos burbujeantes de su propio mundo químico, llamados vesículas.

Muchas proteínas que atraviesan la vía secretora nunca tocan el citosol, excepto las partes de las proteínas de membrana que sobresalen del lado citosólico. Muchos de ellos necesitan acompañantes para ayudar con el plegado y / o toda una serie de modificaciones postraduccionales para estar listos para su función nativa, y la vía secretora se especializa en proporcionarles todo eso.

La conferencia de hoy & # 8217 se centrará en cómo las proteínas se traducen al ER y cómo viajan (en vesículas) entre el ER, el Golgi y otros destinos. Esto está bellamente representado en el video de Life of the Cell:

los retículo endoplásmico es el primer paso en la vía secretora. Su membrana es continua con la membrana nuclear externa, aunque no está claro por qué eso importa, ya que no es como las proteínas que comienzan su vida en el núcleo. Más bien, los ARNm se desplazan por el citoplasma hasta que son recogidos por un ribosoma interesado en traducirlos. En la & # 8216 translocación postraduccional & # 8217, la nueva proteína se traslada al ER después de que & # 8217 se traduce. En el fenómeno más interesante llamado & # 8216 translocación cotranslacional & # 8217, el ribosoma comienza la traducción como cualquier otra proteína, pero en algún lugar de los primeros 16 a 30 aminoácidos golpea un péptido señal (también conocido como secuencia señal). Ese motivo de señal es a menudo 1 aminoácido cargado positivamente seguido de 6-12 aminoácidos hidrófobos. Este motivo es reconocido por la partícula de reconocimiento de señales (SRP, una & # 8216ribonucleoproteína & # 8217 o molécula híbrida de ARN / proteína) que se une a ella e impide que el ribosoma continúe la traducción. La traducción se detiene hasta que el complejo ribosoma / SRP encuentra un receptor SRP en la membrana del RE. Cuando se encuentran, SRP y su receptor se unen cada uno a una molécula de GTP en la membrana del ER, lo que aparentemente fortalece su interacción. Afortunadamente, todo esto sucede junto a un translocón Sec61 & # 8211, un complejo de proteínas que forma un canal que cruza la membrana del RE. El translocón es en realidad un complejo de tres proteínas diferentes (genes: SEC61A1 o SEC61A2, SEC61B, SEC61G), de las cuales la subunidad Sec61a tiene 10 hélices a que atraviesan la membrana y forman el canal. Una vez que el ribosoma está acoplado a la membrana, continúa la traducción, empujando el péptido señal y eventualmente toda la proteína a través del canal hacia la luz del RE. Cuando la traducción se detiene, SRP y el receptor SRP hidrolizan su GTP para liberarse entre sí y la carga de ribosoma (esto tiene que requerir la energía de GTP, ya que la unión original fue cuesta abajo), una peptidasa señal escinde el péptido señal de la proteína naciente. , y la proteína es libre de comenzar a plegarse en el RE.

Un par de otros jugadores están involucrados en algunas proteínas ER. La transferasa de oligosacárido, que agrega grupos glicosilo a las asparaginas en la proteína naciente, es parte del complejo translocón y en realidad realiza la glicosilación. tiempo la nueva proteína todavía se está traduciendo. Entonces, aunque llamamos a la glicosilación una & # 8216 modificación postraduccional & # 8217, en este caso se realiza durante la traducción. Además, para lograr su estructura adecuada, algunas proteínas deben traducirse completamente antes de que se les permita comenzar a plegarse & # 8211 si se permitiera que la porción N-terminal comenzara a plegarse tan pronto como entrara en el lumen, terminaría con el estructura general incorrecta. Para evitar esto, a veces BiP, la chaperona, se une a la proteína para mantenerla desplegada durante un tiempo. Imagínese a BiP como otro Pac-Man que muerde la proteína para mantenerla lineal, como Hsc70 en el proceso de focalización mitocondrial (ver la semana pasada).

Los primeros minutos muestran el escenario básico descrito anteriormente. Luego pasa a un escenario más complejo que presentaré en un minuto. Para su información, el video muestra dos cosas & # 8216 controvertidas & # 8217 no incluidas en la descripción anterior: (1) el péptido señal se degrada en la membrana y (2) una & # 8216 proteína de conexión & # 8217 que detiene el canal antes / después traducción. No todos los científicos están de acuerdo todavía en estas dos cosas.

Todas las proteínas que sabemos que pasan por la vía secretora fueron identificadas allí por personas que realizaron experimentos de localización para ver en qué parte de la célula se encuentra una proteína. Un hecho extraño sobre el ER es que puede poner la célula en una licuadora y luego el ER comenzará a reconectarse a sí mismo, formando pequeños & # 8216microsomas & # 8217 que no están adheridos al núcleo pero forman burbujas contiguas de ER. A continuación, puede comenzar a jugar juegos con proteasas & # 8211 que descomponen proteínas & # 8211 y detergentes & # 8211 que solubilizan la membrana ER. Suponiendo que su proteína de interés se traduzca, puede verificar si (1) sobrevive al tratamiento con proteasa pero (2) no & # 8217t sobrevive al tratamiento con proteasa + detergente, entonces es una proteína de la vía secretora. La lógica es que en el caso (1) estaba protegido dentro del ER, pero en el caso (2) disolviste el ER, por lo que se lo comió la proteasa. Todo esto supone que tiene un anticuerpo o alguna otra forma de detectar si la proteína de interés está ahí después de estos tratamientos.

Las personas también usaron estas técnicas para descubrir que solo se pueden traducir 70 aminoácidos de una nueva proteína antes de que sea demasiado tarde para que esa proteína termine en el RE. Recuerde, el péptido señal está en los primeros 16-30 aminoácidos y la translocación al RE depende de la presencia de SRP. Los ribosomas se traducen a un ritmo predecible, por lo que las personas comenzaron a traducir algunos ARNm y luego esperaron cantidades determinadas de tiempo antes de agregar SRP, para ver cuánta traducción podía ocurrir antes de que SRP ya no pudiera hacer su trabajo.

El receptor SRP y las proteínas Sec61 son proteínas de la membrana del RE & # 8211 y también hay muchas otras proteínas de la membrana del RE, la membrana de Golgi y la membrana del lisosoma. De hecho, incluso las proteínas de la membrana (ver clase 02) de la membrana celular se procesan en la vía secretora. Muchos de estos tienen varios o decenas de dominios transmembrana (20-25 aminoácidos hidrofóbicos cada uno) que deben insertarse en el orden y la orientación correctos (por ejemplo, realmente desea que sus canales iónicos y transportadores apunten en la dirección correcta, en vs .fuera de la celda). En consecuencia, hay un montón de mecanismos biológicos sofisticados para que estas proteínas se inserten correctamente en la membrana. Esto es lo que muestra la segunda mitad del video anterior.

Así que aquí & # 8217s una tautología: algunas proteínas tienen una secuencia topogénica que determina su orientación en la membrana. Esta secuencia está compuesta por dos tipos de secuencias de señales:

  • a secuencia de parada-transferencia (abreviado STA por alguna razón) es una secuencia de aminoácidos hidrófobos de 22-25 en algún lugar en el medio de la proteína que forma una hélice alfa. Cuando se encuentra, se empuja hacia la membrana y luego la traducción del resto de la proteína continúa en el citosol. Así que este tipo de & # 8216 deshace & # 8217 la translocación al ER que fue iniciada por el péptido señal al principio (extremo N) de la proteína.
  • a secuencia de anclaje de señal (abreviado SA) es también una hélice alfa hidrofóbica 22-25aa, pero con una serie de

Con esas dos señales como bloques de construcción, puede imaginar una proteína con una serie de secuencias de transferencia de parada y anclaje de señal para crear una serie completa de dominios transmembrana de ida y vuelta cosidos en la membrana como si fuera una máquina de coser. Las personas han clasificado las proteínas de membrana en cinco categorías:

  1. El tipo I tiene solo un péptido señal y luego una transferencia de una parada en el medio. Por lo tanto, termina con su terminal N (hidrofílico) en la luz, su centro (hidrofóbico) en la membrana y su terminal C (hidrofílico) en el citosol.
  2. El tipo II no comienza con un péptido señal. Comienza como cualquier otra proteína, pero en el medio tiene una secuencia de anclaje de señal con los aminoácidos +++ primero y la serie hidrófoba después. Esto hace que la proteína se transloque a la mitad de la traducción, con la parte N-terminal ya traducida sobresaliendo en el citosol (ya que +++ debe permanecer citosólico) y la parte C-terminal que ahora comienza a traducirse. ser traducido directamente a la sala de emergencias. Entonces termina transmembrana con su terminal C en el ER y el terminal N en el citosol y # 8211 opuesto al Tipo I.
  3. El tipo III es como el tipo II y # 8211 sin péptido señal, solo un ancla de señal en el medio, pero en este caso, el +++ viene después de la secuencia hidrofóbica, que invierte la orientación. Entonces esto termina con su término N en el ER y su término C en el citosol. Opuesto al Tipo II y, al final, igual que el Tipo I, aunque llegó allí de una manera diferente & # 8211, no tiene un péptido señal que se escinde en el ER.
  4. Las proteínas de tipo IV o & # 8217multipass & # 8217 tienen una serie alterna de secuencias señal y secuencias de transferencia de parada. Estos son claramente más de un & # 8216type & # 8217, pero no son tan diversos como su imaginación combinatoria podría permitir. La orientación de la primera secuencia de señal determina si el extremo N terminará en el citosol o en el ER, y el número total de secuencias de transferencia de parada + anclaje de señal determina dónde terminará el extremo C: un número par = el mismo lado que el extremo N, número impar = lado opuesto al término N. Las secuencias STA y SA deben alternarse estrictamente, con la excepción de que puede comenzar con dos secuencias de anclaje de señal si la primera está orientada con el extremo N en el citosol. Solo para burlarse de este esquema de categorización, la gente ha definido algunos subtipos del Tipo IV definidos de manera incompleta, donde el Tipo IVa es N-terminal en el citosol (por lo tanto, comienza como una proteína de Tipo II) y el Tipo IVb es N-terminal en el lumen (comienza como una proteína de tipo III pero luego tiene otra secuencia SA que la devuelve al ER). GLUT1 de la Clase 02 es un Tipo IVa. Las proteínas ancladas, que son el quinto tipo pero no se denominan Tipo V, comienzan con un péptido señal y terminan con un extremo C hidrófobo que permanece incrustado en la membrana. Ese extremo hidrofóbico se escinde y se reemplaza con GPI, que también permanece incrustado en la membrana. PrP es uno de estos & # 8211 más sobre eso más adelante.

A estas alturas ya hemos hablado de cómo las proteínas pueden terminar en la luz del RE o atravesar la membrana del RE. La mayoría de las proteínas salen del RE en minutos, transportadas en vesículas con destino al Golgi y luego para su excreción, los lisosomas o la membrana celular. Esa dirección de avance hacia adelante se llama anterógrada y yendo hacia atrás desde Golgi a ER es transporte retrógrado.

Ambos tipos de transporte tienen lugar en vesículas unidas a la membrana. Estos brotan de la membrana de donde sea que provengan, y luego se fusionan a la membrana de donde sea que se dirijan y # 8211 bellamente representados en

2:25 en el video de Life of the Cell anterior. El cuerpo a partir del cual se forman las vesículas es el & # 8216compartimento del donante & # 8217, y el destino al que luego se fusionan es el & # 8216compartimento del receptor & # 8217.

El proceso de gemación requiere que las proteínas G en la membrana recluten proteínas de la capa. Específicamente, para el transporte anterógrado, la proteína G Sar1 (gen: SAR1A) recluta COPII (& # 8216cop two & # 8217) para el transporte retrógrado, una proteína ARF G recluta COPI (pronunciado & # 8216cop one & # 8217). Estas proteínas G se activan para hacer este trabajo cuando GEF las carga con GTP, intercambiando el PIB.

Entonces, los pasos en el transporte anterógrado, por ejemplo, son los siguientes:

  1. Sec12-GEF (Sec significa secretor) carga Sar1 con GTP. Cuando se une a GDP, Sar1 simplemente flota alrededor del compartimento donante, pero cuando se une a GTP, sufre un cambio conformacional que hace que su cola hidrofóbica N-terminal, que de otro modo estaría enterrada, sobresalga y se adhiera a la membrana, donde las proteínas COPII comienzan a aparecer. se acumulan porque les gusta mucho esa cola.
  2. Los COPII comienzan a polimerizar y, debido a su conformación, tienen una preferencia intrínseca por la curvatura, por lo que su acumulación comienza a hacer que ocurra la gemación. Al mismo tiempo, las proteínas unidas a la membrana que necesitan ser transportadas & # 8211 identificadas por una secuencia de aminoácidos DXE (es decir, aspartato-cualquier-glutamato) que forma un sitio de unión en su parte citosólica & # 8211 son reclutadas en la vesícula recién formada. . Las proteínas unidas a la membrana actúan como receptores, reclutando proteínas lumenales que están unidas al Golgi para que cuelguen en el espacio cóncavo donde terminan en la vesícula una vez que se forma.
  3. Una vez que ha llegado suficiente COPII, la vesícula se desprende, momento en el que Sar1 hidroliza su GTP, proporcionando la energía para que succione su cola hidrófoba hacia sí misma, cortando los COPII sueltos. La vesícula ahora está desconectada del compartimento donante.
  4. Ahora, por razones mal explicadas (¿o mal comprendidas?), La capa de COPII simplemente se desmonta, exponiendo los receptores debajo de la capa que dirigen la dirección de la vesícula. Una vez que la vesícula llega a su destino, Rab-GTP incrustado en la membrana de la vesícula interactúa con un efector Rab incrustado en la membrana del compartimento aceptor. Se intercambia una mirada de reojo, se despierta el interés. Pronto, la vesícula se fusionará con la membrana. las proteínas presentes tanto en el v esículo como en la membrana objetivo (V-SNARE y T-SNARE respectivamente) interactúan para acercar aún más las membranas. En este ejemplo, consideraremos VAMP (los genes VAMP_) como V-SNARE y Syntaxin (los genes STX__) y SNAP25 (gen SNAP25) como las T-SNARE. La sintaxina y SNAP25 son proteínas de membrana. La sintaxina tiene 1 hélice alfa y SNAP25 tiene 2, todas en el lado citosólico. Las hélices alfa impulsan la interacción con VAMP. Los lados opuestos y las hélices alfa # 8217 tienen una afinidad extremadamente fuerte entre sí, lo que hace que las membranas se acerquen lo suficiente como para fusionarse. Una vez que esto ha sucedido, separar las V-SNARE y T-SNARE nuevamente requiere dos proteínas: NSF (gen: NSF significa factor sensible a NEM) y alpha-SNAP (gen: NAPA), una proteína soluble de unión a NSF. NSF es una ATPasa y quema ATP para impulsar el desmontaje enérgicamente cuesta arriba del complejo.

Ahora para el transporte retrógrado. ¿Por qué hay transporte retrógrado? Aquí hay una lista no exhaustiva de algunas razones:

  • Algunas proteínas de membrana comienzan su vida en el ER, necesitan ser modificadas en el Golgi, pero luego necesitan regresar al ER. Hacen esto con una secuencia de aminoácidos KKXX.
  • También hay una secuencia de aminoácidos KDEL en el extremo C de algunas proteínas lumenales que se supone que las mantiene en la sala de emergencias, pero no es perfecta, a veces terminan en el Golgi, en cuyo caso dirigido de nuevo al ER a través del transporte retrógrado que depende de esa secuencia KDEL para su reconocimiento. El mecanismo es bastante ordenado & # 8211 las proteínas que reconocen y se unen a KDEL lo hacen solo a pH bajo, y el pH del Golgi es más bajo que el ER, por lo que se unen a KDEL en el Golgi y luego lo liberan cuando & # 8217re de nuevo en el pH más neutro del ER.
  • Además, piénselo, todas las proteínas que participan en el transporte anterógrado & # 8211 las V-SNARES, Rab, etc. & # 8211 tienen que volver a Urgencias para que puedan hacerlo todo de nuevo, como lo ha hecho el autobús. para volver a la estación de autobuses al final del día.
  • Como veremos en breve, el Golgi se presenta en múltiples etapas que dependen de la adición de enzimas posteriores.

El proceso de transporte retrógrado no es tan diferente del anterógrado. Utiliza ARF en lugar de Sar1, COPI en lugar de COPII, pero funciona igual: ARF cargado con GTP permite que su cola hidrófoba se adhiera a la membrana, atrayendo la atención de los COPI. COPI tiene dos componentes, COPIalpha y COPIbeta, los cuales interactúan con esa secuencia KKXXX para reclutar proteínas unidas a la membrana destinadas al transporte retrógrado. Algunas proteínas también tienen una secuencia RR (en cualquier parte de la proteína) que puede marcarlas para el transporte retrógrado.

El aparato de Golgi no es contiguo. Es un conjunto apilado de subcompartimentos separados llamados sacos o cisternas. Los diferentes compartimentos tienen diferentes propiedades y las proteínas los visitan en un orden particular. En orden de ER a la membrana celular, los compartimentos de Golgi se denominan red cis, medial, trans y trans-Golgi. Cada compartimento tiene diferentes enzimas que modifican las proteínas, y las modificaciones tienen que suceder en un orden determinado, de ahí la necesidad de un conjunto de compartimentos apilados.

Pero a medida que las proteínas maduran en el Golgi, no es como si brotaran en vesículas de un compartimento y pasaran al siguiente. Más bien, el compartimento en el que están Ya estoy en eso se mueve hacia afuera y & # 8216maduros & # 8217 a medida que se le agregan nuevas enzimas (desde más abajo en la cadena de Golgi) a través del transporte retrógrado. Extraño, ¿verdad? Es como si en lugar de mudarte de una escuela primaria a una secundaria y luego a una secundaria te quedaras en un edificio escolar durante toda tu niñez y adolescencia, y ellos simplemente traen nuevos libros de texto y maestros cada año para mantenerlo. apropiado para el grado que usted y sus compañeros habían alcanzado ahora. Aquí & # 8217s cómo se ven los Golgi a medida que se mueven y evolucionan:

Así que hay & # 8217 (poco o) ningún transporte anterógrado dentro del Golgi, pero mucho transporte retrógrado para traer cada nueva ronda de enzimas. Cuando las proteínas finalmente han completado el plan de estudios completo de K-12 de la red de Golgi, se someten a transporte a pasar a su destino final. Brotan en una vesícula que irá a uno de tres lugares:

    & # 8211 fusión con la membrana celular. Por tanto, las proteínas de la luz se secretarán extracelularmente y las proteínas de la membrana se convertirán en proteínas de la membrana celular. & # 8211 estos simplemente se quedan como vesículas en la célula hasta que se necesiten & # 8211 donde & # 8216necesarios & # 8217 significa que eventualmente se someten a exocitosis. En las neuronas, aquí es donde se almacenan los neurotransmisores hasta que un potencial de acción exige su secreción en la sinapsis. En el estómago, las células que producen enzimas gástricas mantienen esas enzimas en vesículas secretoras hasta que la ingesta de alimentos desencadena su liberación en el estómago. - donde las proteínas mal plegadas van a degradarse.

El transporte desde la red trans-Golgi a estos destinos es diferente del otro transporte discutido anteriormente y a menudo involucra clatrina (genes CLT__). Las vesículas que brotan tienen una capa de dos capas, con un complejo de proteína (AP) como capa interna y clatrina como capa externa. Las proteínas adaptadoras tienen una señal diana con un motivo YXXh (h = Φ = cualquier aminoácido hidrófobo). La clatrina forma la denominada formación & # 8216clathrin-triskelion & # 8217 que se muestra aquí:


(Imagen gracias al usuario Phoebus87 de Wikimedia Commons)

La clatrina también es responsable de la endocitosis y la gemación de vesículas de material extracelular (y proteínas de la membrana celular) en el futuro. dentro la célula. Esto se llama endocitosis mediada por clatrina. Los receptores de la membrana celular sufren endocitosis con mucha frecuencia: toda la población de receptores de hormonas cambia cada hora, especialmente cuando se reciben hormonas. Llevar el receptor a una vesícula es una forma de que la célula corte la señal entrante hasta que pueda procesarse.
Las notas sobre la membrana plasmática discuten brevemente la fibrosis quística: CFTR es un transportador ABC responsable de bombear Cl - fuera de la célula (también deja entrar Na +). Los mutantes con pérdida de función no bombean Cl -, que elimina la fuerza impulsora de la ósmosis, espesando el moco y causando problemas respiratorios. Hay al menos 127 mutantes CFTR con pérdida de función diferentes (al menos, eso es & # 8217 para cuántas pruebas Natera) que (si ambos alelos están desactivados) causan fibrosis quística. La mutación más común es ΔF508, que es

3% de todos los alelos CFTR europeos y alrededor del 70% de los mutantes. La pérdida de esa fenilalanina cambia la conformación de CFTR & # 8217s de modo que el código de salida diácido (aminoácidos D565 y D567) que se dirige a CFTR para vesículas exocitóticas ya no se expone correctamente y la proteína nunca llega a la membrana celular [Wang 2004 ].

sección de discusión

En la sección leímos a Hu 2009, quien mostró que las proteínas de atlastina están involucradas en la creación de la red ER tubular. La evidencia provino casi en su totalidad de las interacciones proteína-proteína. Me sorprendió que este artículo fuera un gran problema, porque ha habido un millón de artículos que muestran interacciones proteína-proteína para la huntingtina, y nadie realmente cree en todas ellas y no necesariamente nos ha acercado más a saber qué hace la huntingtina o qué. va mal en la enfermedad de Huntington. Pero aparentemente Hu pudo presentar un caso bastante claro de que las atlastinas y las interacciones # 8217 con las retículas implican un papel en la formación de ER. Ayuda que Hu haya podido mostrar una & # 8216 interacción genética & # 8217 además de una interacción física (vinculante). Una & # 8216 interacción genética & # 8217 (tuve que buscarla) significa cuando & # 8220A veces, las mutaciones en dos genes producen un fenotipo que es sorprendente a la luz de los efectos individuales de cada mutación. Este fenómeno, que define la interacción genética, puede revelar relaciones funcionales entre genes y vías. & # 8221 [Mani 2007].

Esto tiene una década de antigüedad, por lo que algunas cosas pueden estar desactualizadas, pero encontré la revisión de Harris 2003 (ft) & # 8217 sobre la biología celular de PrP extremadamente clara y útil. Kim & amp Hegde 2002 también fue útil. PrP es una proteína de la vía secretora. Sus primeros 22 aminoácidos (MANLGCWMLVLFVATWSDLGLC) son un péptido señal que causa la translocación cotraduccional al RE. Normalmente, PrP simplemente se une a GPI en su terminal C y se ancla al lado exoplasmático de la membrana. Pero los aminoácidos 111-134 (HMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAM) son una especie de secuencia de ancla de señal débil (Tipo II, con los aminoácidos +++ antes del ancla de señal) que a veces pero no siempre se convierte en un dominio transmembrana, invirtiendo el terminal C en el lumen. Aún más confuso, esa secuencia a veces puede terminar como un dominio transmembrana sin la inversión, de modo que el extremo N esté en el lumen. Por lo tanto, hay tres topologías de membrana de PrP: orientaciones anclado a GPI antiguo regular y dos transmembrana, como se muestra en Harris 2003 Fig 3:

Tenga en cuenta lo extraño que es Ctm PrP. Es transmembrana pero también anclado a GPI, y el péptido señal N-terminal nunca se escinde. Normalmente, las formas transmembrana son & lt 10% de la PrP total. En algunas condiciones de laboratorio, el porcentaje es más alto y dos de las mutaciones que causan GSS (A117V y P105L) también aumentan la fracción de Ctm PrP al 20-30% de toda la PrP. De estas tres formas, existe una buena cantidad de evidencia de que la Ctm PrP es tóxica y de que podría desempeñar un papel en la formación de priones, aunque la mayoría de las mutaciones genéticas de la enfermedad priónica (incluida la FFI D178N) no parecen afectar la topología de la membrana de PrP. o la fracción de Ctm PrP.

Una vez que la PrP atraviesa el Golgi, se dirige a la membrana celular. Pero de acuerdo con Harris, no se limita a sentarse allí con frecuencia a través de endocitosis mediada por clatrina y recorre la célula cada vez.

60 minutos, con algunas moléculas que se escinden en cada ciclo. El cobre estimula esta endocitosis de PrP. La mayoría de las mutaciones genéticas de la enfermedad priónica cambian la localización de PrP & # 8211 generalmente cuando hay una mutación presente, se encuentra menos PrP en la superficie celular y se acumula más en el RE.

Acerca de Eric Vallabh Minikel

Eric Vallabh Minikel está en una búsqueda de por vida para prevenir la enfermedad priónica. Es un científico que trabaja en el Broad Institute of MIT y Harvard.


Artículo de revisión

  • Laboratorio clave de biología de las algas, Instituto de hidrobiología, Academia de Ciencias de China, Wuhan, China

Los cilios y los flagelos son orgánulos muy conservados en las células eucariotas que impulsan el movimiento celular y actúan como antenas celulares que reciben y transmiten señales. Además de recibir y transducir señales externas que activan las cascadas de señales, los cilios también secretan ectosomas ciliares que envían señales a las células receptoras y, por lo tanto, median la comunicación celular. La función ciliar anormal conduce a diversas ciliopatías, y el transporte y la localización precisos de las proteínas de la membrana ciliar son esenciales para la función del cilio. Esta revisión resume el conocimiento actual sobre los procesos de transporte de proteínas de la membrana ciliar después de su síntesis en el retículo endoplásmico: modificación y clasificación en el aparato de Golgi, transporte a través de vesículas a la base ciliar, entrada a los cilios a través de la barrera de difusión y recambio por secreción de ectosomas. . También se discuten los mecanismos moleculares y la regulación involucrados en cada paso. El transporte de proteínas de la membrana ciliar es un proceso celular complejo y preciso coordinado entre múltiples orgánulos. Al analizar sistemáticamente la investigación existente, identificamos temas que deben ser investigados más a fondo para promover el progreso en este campo de investigación.


Resultados

Imágenes de microvesículas sinápticas simples

Aquí obtuvimos imágenes de microvesículas de tipo sináptico único en células vivas con microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) 5. Específicamente, utilizamos una sonda de fluorescencia sensible al pH dirigida a microvesículas (VAChT-pH) basada en el VAChT (Fig. 1a) 6. Las vesículas individuales que contienen esta sonda se iluminan cuando el poro de fusión de la vesícula se abre después de la exocitosis y el lumen ácido de la vesícula es neutralizado por el tampón extracelular 6. La Figura 1b muestra dos células que expresan VAChT-pH. La fluorescencia se esparció por la superficie inferior de la celda, donde se limitó a pequeños puntos. Para probar si estos puntos estaban en el exterior de la célula, superfundimos las células con una solución de pH bajo (pH 5,5, Fig. S1 complementaria). Se midió un oscurecimiento espectacular de las células durante este tratamiento (Fig. Suplementaria S1a-c). Los puntos únicos de VAChT-pH se oscurecieron y luego se volvieron a iluminar, lo que indica que muchos de los puntos estaban en la cara extracelular de la membrana plasmática. Algunos puntos no se atenuaron, lo que indica que estaban en compartimentos intracelulares. Para probar si el VAChT-pH estaba contenido en compartimentos ácidos, superfundimos las células con cloruro de amonio (Fig. Suplementaria S1d-f). Este químico descompone los gradientes de pH intracelular. Las células y algunos puntos fluorescentes expuestos a esta solución se iluminaron, lo que indica que algo de VAChT-pH se encuentra en compartimentos ácidos intracelulares (Fig. Complementaria S1d-f). Combinados, estos resultados indican que VAChT-pH estaba presente tanto en grupos en la membrana plasmática como en compartimentos ácidos dentro de la célula.

(a) Dibujo de la sonda de microvesículas VAChT-pH. (B) Imagen de dos células PC12 que expresan VAChT-pH obtenidas con TIRF. La barra de escala equivale a 5 μm. (C) Fotogramas de una película donde una única vesícula que contiene VAChT-pH sufre exocitosis desencadenada por despolarización, y (D) la fluorescencia correspondiente del círculo central de 750 nm de radio de esa región. La barra de escala es igual a 2 μm. (mi) La fluorescencia media de VAChT-pH de vesículas exocíticas desencadenadas (83 eventos, 13 células). (F) Dibujo de la sonda de pH radiométrica VAChT-pH-mCherry. (gramo) La fluorescencia media de VAChT-pH-mCherry de vesículas exocíticas activadas en los canales pHluorin y mCherry (36 eventos, 3 células). La relación de estas dos intensidades se muestra en h. Las barras de error son s.e.m. Norma. fluor., fluorescencia normalizada.

Para evocar la exocitosis, despolarizamos células con alto contenido de potasio. Esta solución indujo numerosos y rápidos eventos exocíticos. Se podían ver destellos brillantes en la superficie inferior de la celda. Estos eventos fueron raros en células no estimuladas. La Figura 1c muestra un evento de ejemplo (Película complementaria 1). Diez segundos antes de la exocitosis, la vesícula no es visible, pero cuando se abre el poro de fusión, ocurre un destello brillante dentro de un marco (500 ms) y crea una floración de fluorescencia que irradia hacia afuera en todas las direcciones y se atenúa (Fig. 1c). Después de la exocitosis, parte de esta fluorescencia se capturó en grupos de VAChT-pH preformados cerca del sitio exocítico (Fig. 1c). La fluorescencia del área de la membrana local (círculo de 750 radios) que rodea esta vesícula se representa en la Fig. 1d. Esta traza muestra que el VAChT-pH aumenta en la exocitosis, decae en unos pocos segundos y luego se estabiliza a una intensidad cercana a la mitad del valor pico. The corresponding fluorescence from many events (83 events, 13 cells) is plotted in Fig. 1e. On average, VAChT-pH brightens rapidly and then decays. There is, however, a substantial amount of fluorescence (61±0.03%) that remains near the site of fusion (Fig. 1e).

To determine if the VAChT-pH decay was due to loss of the protein into the plasma membrane (full-fusion) or was due to the direct recapture and re-acidification of the vesicle (kiss-and-run), we tagged VAChT-pH with mCherry. VAChT-pH-mCherry, positions the pH-sensitive pHluorin inside the vesicle lumen and the pH-insensitive mCherry into the cytoplasm (Fig. 1f). This sensor acts as a ratio-metric probe for pH changes in vesicles. The green fluorescence from VAChT-pH-mCherry rapidly brightens and then decays to 58±0.07% (Fig. 1g). Similarly, the mCherry fluorescence increases and then decays at the same rate, and to the same extent as pHluorin (62±0.07% Fig. 1g). The ratio of the red-to-green is shown in Fig. 1h, and shows that after exocytosis there is no change. Thus, the decay in VAChT-pH after exocytosis is not due to direct recapture and acidification (kiss-and-run), but instead is due to the loss of the probe into the membrane. These results support a full-fusion mechanism of exocytosis for VAChT.

To analyse the spread of VAChT-pH, we measured four radial line scans centred over vesicles (Fig. 2a). These scans generated an average one-dimensional kymograph of the two-dimensional membrane surrounding exocytic events. Figure 2a shows results of averaging the kymographs of many VAChT-pH fusion events together. Upon exocytosis, fluorescence brightens and spreads rapidly. Fluorescence, however, progressed only a short distance. As seen in the example in Fig. 1c, some of the diffusing fluorescence remains near the site of fusion (Fig. 2a). The fluorescence from these kymographs is plotted in Fig. 2b. Analysis of these data is shown in Fig. 2c, where two-dimensional Gaussian functions were fit to vesicles. This plot shows that VAChT initially spreads rapidly, but remains relatively constant in size 10 s following exocytosis. We conclude that microvesicles release VAChT into the plasma membrane. Most of this material, however, does not spread more than a few hundred nanometres (σ-values at 30 s, 1.1±0.1 μm) from the site of exocytosis. These results are consistent with several models of release for VAChT, which we consider below.

(a) Mean normalized radial linescans of microvesicles during exocytosis (46 events, 13 cells). Scale bar equals 1.5 μm. (B) Intensity plot of the same radial linescans. (C) Mean σ-value of a Gaussian function fit to each of the events used for a y B. Error bars are s.e.m.

Vesicle material is trapped in clathrin-coated structures

The cytosolic tail of VAChT binds to the adaptor protein AP2 (refs 7, 8). To determine if endocytic proteins were responsible for clustering vesicle material on the cell surface, and are involved in the retention of VAChT near sites of exocytosis, we imaged VAChT-pH together with two endocytic markers. Figure 3a shows an image of VAChT-pH and a marker for clathrin-coated structures (clathrin light chain tagged with dsRED, mLC-dsRED) 9 . These images show that the bottom surface of PC12 cells have a large number of clathrin-coated structures (0.95 clathrin spots per μm 2 ±0.02 spots per μm 2 , norte=11 cells, 79 regions (72 μm 2 area)). A similar density for clathrin was found with antibody staining (Supplementary Fig. S2). To test if MLC-dsRED labelled all the clathrin structures, we immunostained cells expressing MLC-dsRED with antibodies against the heavy chain of clathrin. Almost all the antibody-stained clathrin spots were labelled with MLC-dsRED (Supplementary Fig. S3). Furthermore, the number of antibody-stained clathrin structures was not increased compared with untransfected controls (X22 density of MLC-dsRED-transfected cells: 1.05±0.02 clathrin spots per μm 2 , X22 density of control cells: 1.06 clathrin spots per μm 2 ±0.03 Supplementary Figs S2 and S3). These results show that the density of clathrin was not changed by the expression of clathrin light chain (Supplementary Figs S2 and S3).

(a) TIRF image of a cell co-expressing VAChT-pH and MLC-dsRED along with the overlay image. Scale bar equals 5 μm. (B) Mean extracted and normalized square regions centred on VAChT-pH spots and the corresponding regions from the MLC-dsRED channel (norte=11 cells, 1,374 regions). Scale bar equals 2 μm. (C) The two-dimensional correlation values between the images used in B. (D) TIRF image of a cell co-expressing VAChT-pH and AP2-mCherry along with the overlay image. Scale bar equals 5 μm. (mi) Mean extracted and normalized square regions centred on VAChT-pH spots and the corresponding region from the AP2-mCherry channel (norte=6 cells, 964 regions). Scale bar equals 2 μm. (F) The two-dimensional correlation values between the images used in mi. Avg, average.

When green images (Fig. 3a) were compared with red, a large fraction of VAChT-pH and clathrin colocalized (Fig. 3a). To analyse colocalization, we extracted 1,374 small (8.5 × 8.5 μm) images from 11 cells. In these regions, the centre of VAChT-pH structures were aligned to the middle pixel of the image. The corresponding regions from the MLC-dsRED image were also extracted. The fluorescence from these regions were normalized and averaged. This analysis showed a small distinct spot in the VAChT-pH image that co-localized with clathrin (Fig. 3b). The correlation between these regions is plotted in Fig. 3c and shows a strong and positive correlation. Visual inspection of 215 randomly chosen regions indicated that 85% of the central VAChT-pH spots had a corresponding signal in the MLC-dsRED channel. Similar analysis was done with VAChT-pH and AP2-mCherry (Fig. 3d-f). These images and their analysis show that, similar to clathrin VAChT-pH and AP2-mCherry strongly colocalize. Average VAChT-pH and AP2-mCherry image pairs have similar correlation values, sizes and distributions (Fig. 3d-f). Again, visual inspection of 215 randomly chosen regions showed that 82% of all the central VAChT-pH spots colocalized with AP2-mCherry. To test for the association of clathrin and AP2, we measured the colocalization of MLC-dsRED and AP2-green fluorescent protein (GFP Supplementary Fig. S4). Visual inspection indicated that 98% of the MLC-dsRED had a corresponding signal in the AP2-GFP channel. Thus, almost all of the MLC-dsRED structures contained AP2-GFP. We conclude that there is a resting pool of VAChT-pH on the surface of the cell that is clustered on endocytic structures composed of clathrin and AP2.

After exocytosis, vesicle material is trapped over clathrin

We next asked if the corralling of VAChT-pH observed after exocytosis is related to clathrin. To answer this question, we triggered exocytosis in cells expressing VAChT-pH and MLC-dsRED. We then imaged the release of VAChT-pH from single exocytic vesicles and compared these images with clathrin. Figure 4a shows a single exocytic vesicle arriving at the surface and rapidly brightening. VAChT-pH left the site of exocytosis and diffused radially into the plasma membrane where a fraction of the fluorescence was rapidly (<1 s) captured on a preformed clathrin structure (Fig. 4a Supplementary Fig. S5 and Supplementary Movie 2). This trapped VAChT-pH remained associated with clathrin for over 20 s.

(a) Sequential two-colour TIRF images of a single vesicle fusing with the plasma membrane. The location of fusion is indicated by the blue arrow. After fusion, VAChT-pH is captured on a preformed clathrin-coated pit (yellow arrow) located close to the site of exocytosis. Scale bar equals 2 μm. (B) Mean radial linescans through images centred on clathrin structures located within 1 μm of an exocytic event (norte=7 cells, 35 regions). Fusion occurs at zero seconds. Scale bar equals 2 μm. (C) The measured fluorescence from VAChT-pH and MLC-dsRED from a circle with a radius of 375 nm centred on the clathrin structures shown in B. (D) Mean radial linescans through images centred on clathrin-free areas located within 1 μm of an exocytic event (norte=7 cells, 43 regions). (mi) The measured fluorescence from VAChT-pH and MLC-dsRED from a circle with a radius of 375 nm centred on the centre of the clathrin-free areas shown in D. Spatial analysis comparing sites of exocytosis (F, yellow cross) to clathrin (F, red circles). Scale bar equals 2 μm. The blue circle indicates an area 1 μm from the centre of exocytosis. (gramo) Plot of the number of clathrin structures located within 1 μm of fusion events (norte=11 cells, 79 regions, 4,383 clathrin structures). (h) Histogram showing nearest-neighbour distances between fusion sites and clathrin spots. (I) Histogram showing the nearest-neighbour distances between random sites and clathrin spots. Error bars are s.e.m. Promedio fluor., average fluorescence Norm. fluor., normalized fluorescence.

To analyse the capture of VAChT-pH on clathrin, we measured fluorescence around clathrin structures located within1 μm of fusion events. The average kymographs centred over clathrin is shown in Fig. 4b. From this analysis, it is evident that clathrin is stable at the membrane before exocytosis. At the moment of fusion, VAChT-pH brightens in the membrane area surrounding clathrin, steadily increases and is then focused onto the central clathrin-containing spot (Fig. 4b). We observe that the width of the VAChT-pH spot decrease after exocytosis and aligns with the central spot of clathrin in the kymograph (Fig. 4b). A plot of the fluorescence intensity during exocytosis measured in a small membrane area (375 nm radius circle) over clathrin is shown in Fig. 4c. In these clathrin-containing regions, VAChT-pH fluorescence steadily increases after exocytosis and then plateaus (Fig. 4c). The small and slow decline of fluorescence over clathrin during the plateau phase could be due to several experimental issues, including photobleaching, vesicle movement, re-acidification and endocytosis. These data demonstrate that the trapping of VAChT-pH occurs over resident clathrin structures located within a micron of exocytosis.

To show that VAChT-pH is specifically trapped over clathrin after exocytosis, we measured VAChT-pH in regions that did not contain clathrin and were located within 1 μm of fusion events. The average kymograph centred over clathrin-free areas is shown in Fig. 4d. In these regions, VAChT-pH brightens at exocytosis and is then rapidly lost. Specifically, VAChT-pH diffuses from the central, clathrin-free area, and is then captured on the surrounding clathrin. Unlike Fig. 4c, the fluorescence from clathrin-free areas (375 nm radius circle) increases at exocytosis, does not continue to increase and then rapidly decays (Fig. 4e). These data demonstrate that after exocytosis, VAChT-pH freely diffuses in membranes that do not contain clathrin, and is caught on membranes that do contain clathrin.

To test for a spatial coupling between sites of exocytosis and endocytosis, we mapped the location of 79 exocytic vesicles in relation to all clathrin spots. Figure 4f shows an example image of a field of clathrin where an exocytic event occurs in the centre (Fig. 4f, yellow cross). For this analysis, we determined the location of all the clathrin structures in each image surrounding exocytic sites (11 cells, 79 regions, 4,383 spots). The same analysis was done for control images from the same cells (7 cells, 67 images, 3,941 spots). This analysis shows that there is a dense network of clathrin across the cell surface. Interestingly, there was no increase in the number of clathrin structures near sites of exocytosis (2.9 spots±0.2 spots) compared with the control images (2.7 spots±0.2 spots Fig. 4g). A histogram showing the distance between exocytic sites and the closest clathrin structure is plotted in Fig. 4h. The closest clathrin structure to each fusion site was 482±27 nm. Figure 4i shows that the nearest-neighbour spacing of clathrin structures is 706±11 nm (4,373 structures, 79 regions, 11 cells). For controls, the clathrin structure nearest to the centre of the image was 435±23 nm and the nearest-neighbour spacing of clathrin was 711±11 nm. Thus, material exiting a vesicle needs to go no further than a few hundred nanometres before it encounters a preformed clathrin structure. This distribution of clathrin, however, is not linked to sites of exocytosis. Instead, it is randomly generated by the spacing and high density of resident clathrin structures.

To support the hypothesis that classical clathrin-mediated endocytosis was linked to the surface distribution of VAChT, we treated cells with the dynamin inhibitor dynasore 10 . Like MLC-dsRED and AP2-mCherry, Dynamin1-mCherry (Dyn1-mCherry) co-localized with VAChT-pH (Supplementary Fig. S6). Visual inspection indicated that 64% of VAChT-pH spots co-localized with Dyn1-mCherry spots (Supplementary Fig. S6). When cells were exposed to 80 μM dynasore for 30 min, a dramatic increase in surface fluorescence over time was observed (Supplementary Fig. S6). This increase in fluorescence occurred in both the stable fluorescent puncta and plasma membrane regions not associated with puncta. Thus, the surface distribution and recycling of VAChT-pH is dependent on the action of components of clathrin-coated pits, namely dynamin.

Architecture of clathrin determined by iPALM

From the above data, we conclude that a large fraction of vesicle material is rapidly and locally captured over pre-formed clathrin structures after triggered exocytosis. Standard optical microscopy (for example, TIRF) is restricted by the diffraction limit of light. This fact limits the resolution of cellular structures to

200 nm with TIRF. Thus, we used a super-resolution optical technique known as interferometric photo-activation localization microscopy (iPALM) to image the three-dimensional sub-diffraction size and distribution of clathrin in PC12 cells 11 . To accomplish this, we tagged clathrin light chains with the photo-switchable fluorescent protein mEOS2 (mLC-mEOS2 Fig. 5a) 12 . iPALM was used to reconstruct the size, shape and distribution of clathrin at the bottom surface of the plasma membrane. iPALM also allows one to analyse the distribution of clathrin molecules in the plane perpendicular to the coverslip 11 . Figure 5b shows a single cell imaged with iPALM. The images to the left shows the cell imaged with a conventional TIRF, and to the right shows the same cell imaged with iPALM. Clearly, individual spots of clathrin are difficult to distinguish with conventional imaging. However, distinct clathrin structures are clearly visible with iPALM.

(a) Cartoon of a single clathrin triskeleon with a light chain labelled with a fluorescent protein. The triskeleons assemble together to form clathrin-coated structures. (B) Conventional TIRF optical image and (C) iPALM measurement of MLC-mEOS2 in a PC12 cell. Scale bar equals 5 μm. En B, the blue arrows point to gold particles used for alignment. In both cases, a magnified view of the white box is shown below. Scale bar equals 1 μm. (D) Histogram of clathrin spacing in PC12 cells measured with iPALM. (mi) Histogram showing the width of the same structures. (F) Plot of width versus depth of the clathrin objects measured with iPALM. Error bars are s.e.m.

From images of entire cells, we were able to calculate the sub-diffraction distribution of clathrin. The total density of resolvable spots was 2.00±0.09 spots per μm 2 (3 cells). Nearest-neighbour analysis showed that the average spacing was 560±1 nm (norte=3 cells, 305 spots Fig. 5d). This was 200 nm closer than we observed with conventional TIRF. To systematically analyse the shape of all the structures on the surface, we measured the width and depth of each structure from three cells in the x, y and z dimensions relative to the glass coverslip. Figure 5e shows that the size of clathrin-coated structures ranged from 50 to 450 nm in diameter (mean: 224±5 nm, norte=3 cells, 401 structures). These structures varied in shape with 42% less than 75 nm in depth (Fig. 5f). From these measurements, there was no strong correlation between the width and depth of individual pits. These data support the finding that the density of clathrin structures in these cells is very high. Furthermore, individual structures were either flat or domed. The functional importance of these two types of structures is yet to be determined. Finally, the two-fold increase in density observed with iPALM can be explained by the inability of traditional optical imaging (TIRF) to delineate between two closely spaced structures and one large structure.

Architecture of clathrin determined by electron microscopy

To further map the architecture of clathrin, we performed electron microscopy. We first prepared platinum-shadowed membrane sheets from PC12 cells 13 . We then used whole-cell transmission electron microscopy to visualize the entire inner surface of the plasma membrane (Supplementary Fig. S7). We observed two types of clathrin structures: (1) distinctive flat patches and (2) domes, or pit-like structures (Supplementary Movie 3). Figure 6a shows four regions where both flat patches and pits of clathrin can be seen. To determine the shape of these structures, we measured the minimum and maximum dimension (1,045 clathrin structures, 96 regions, 3 cells). The structures were further classified by eye as flat or domed. Figure 6b shows a scatter plot of these measurements. The structures have a maximum diameter of 129±1 nm (1,045 clathrin structures, 96 regions, 3 cells). Figure 6c show this nearest-neighbour analysis. Clathrin structures were distributed at a nearest-neighbour density of 463±8 nm (3 cells). The total density was 1.6 clathrin structures per μm 2 ±0.11 (96 regions, 3 cells). To further confirm these densities, we performed super-resolution imaging (Supplementary Fig. S8). The density observed with ground-state depletion (GSD) imaging showed 2.3 structures per μm 2 ±0.08 (92 regions, 6 cells). Again, these data support the finding that the density of clathrin on the surface is very high, between 2 and 11 times greater than previously reported from other cell types 14,15,16,17,18,19,20 . Furthermore, these data demonstrate that the density of clathrin structures measured in iPALM was not a consequence of overexpression. The differences between our EM, iPALM and GSD-measured clathrin densities likely resulted from the systematic measurement errors of each method. For example, some clathrin structures are hidden by other cellular structures in our EM images. Furthermore, background fluorescence could result in a slight overcounting of clathrin structures in iPALM and GSD imaging. These measurements support the model in which fusion occurs randomly among sites of endocytosis, and diffusing material can be rapidly captured on preformed clathrin-coated structures waiting on the cell surface to trap material destined for endocytosis.

(a) Four representative transmission electron microscopic images of the inner surface of the plasma membrane of PC12 cells. A representative flat (yellow arrow) and domed (pink arrow) structure are indicated. Scale bar equals 200 nm. (B) Plot of minimum and maximum caliper measurement for all visible clathrin structures over the entire cell (n=3 cells, 64 regions, 1,045 clathrin structures). Pink circles are structures classified as domed and purple circles are structures classified as flat. (C) Nearest-neighbour analysis of all the clathrin structures shown in B.

Modelling

To test the hypothesis that a dense field of traps can limit the spread of VAChT, we developed a simple physical model (Fig. 7a). First, particles in the centre of a small field were allowed to undergo random two-dimensional Brownian diffusion. These simulations were observed to lose all the particles rapidly (Fig. 7b and Supplementary Movie 4). When we introduced a population of traps into the simulation (1, 2 and 5 traps per μm 2 ), we observe a rapid capture of particles near sites of release (Fig. 7b and Supplementary Movie 5). The amount of capture was directly related to the density of traps. This is observed in Fig. 7b and Supplementary Movie 5. A plot measuring the fluorescence from simulations shows that without traps fluorescence is rapidly lost from the centre (750 nm radius region) into the surrounding membrane (Fig. 7c). The plot, however, of average simulations that included traps shows a rapid loss and then a plateau of fluorescence (Fig. 7c). The size of the plateau is proportional to the number of traps. These simulations support the hypothesis that a dense network of traps can account for the limited spread and rapid capture of VAChT. Furthermore, the density of traps can modulate the amount of material lost or remaining near any individual site of release.

(a) Cartoon of the model for the release and capture of VAChT. (B) Radial kymograph of fluorescence from the mean of five diffusion simulations. The simulations contained 0, 1, 2 and 5 traps per μm 2 . The material rapidly exits the centre, but a large amount of the particles are caught and remain in the centre in simulations that contain traps. Scale bar equals 2 μm. (C) Plot of the mean intensity contained in circular regions with a radius of 750 nm from the above simulations. Error bars are s.e.m.


Some of the integral membrane proteins that a cell displays at its surface are receptors for particular components of the ECF. For example, iron is transported in the blood complexed to a protein called transferrina. Cells have receptors for transferrin on their surface. When these receptors encounter a molecule of transferrin, they bind tightly to it. The complex of transferrin and its receptor is then engulfed by endocytosis. Ultimately, the iron is released into the cytosol. The strong afinidad of the transferrin receptor for transferrin (its ligando) ensures that the cell will get all the iron it needs even if transferrin represents only a small fraction of the protein molecules present in the ECF. Receptor-mediated endocytosis is many thousand times more efficient than simple pinocytosis in enabling the cell to acquire the macromolecules it needs.

Another Example: the Low-Density Lipoprotein (LDL) Receptor

Cells take up cholesterol by receptor-mediated endocytosis. Cholesterol is an essential component of all cell membranes. Most cells can, as needed, either synthesize cholesterol or acquire it from the ECF. Human cells get much of their cholesterol from the liver and, if your diet is not strictly "100% cholesterol-free", by absorption from the intestine.

Cholesterol is a hydrophobic molecule and quite insoluble in water. Thus it cannot pass from the liver and/or the intestine to the cells simply dissolved in blood and ECF. Instead it is carried in tiny droplets of lipoprotein. The most abundant cholesterol carriers in humans are the low-density lipoproteins o LDLs.

LDL particles are spheres covered with a single layer of phospholipid molecules with their hydrophilic heads exposed to the watery fluid (e.g., blood) and their hydrophobic tails directed into the interior. Some 1,500 molecules of cholesterol (each bound to a fatty acid) occupy the hydrophobic interior of LDL particles. One molecule of a protein called apolipoprotein B (apoB) is exposed at the surface of each LDL particle.

The first step in acquiring LDL particles is for them to bind to LDL receptors exposed at the cell surface. These transmembrane proteins have a site that recognizes and binds to the apolipoprotein B on the surface of the LDL. The portion of the plasma membrane with bound LDL is internalized by endocytosis. A drop in the pH (from

5) causes the LDL to separate from its receptor. The vesicle then pinches apart into two smaller vesicles: one containing free LDLs the other containing now-empty receptors. The vesicle with the LDLs fuses with a lysosome to form a secondary lysosome. The enzymes of the lysosome then release free cholesterol into the cytosol. The vesicle with unoccupied receptors returns to and fuses with the plasma membrane, turning inside out as it does so (exocytosis). In this way the LDL receptors are returned to the cell surface for reuse.

People who inherit two defective (mutant) genes for the LDL receptor have receptors that function poorly or not at all. This creates excessively high levels of LDL in their blood and predisposes them to atherosclerosis and heart attacks. The ailment is called familial (because it is inherited) hipercolesterolemia.

Mutations in APOB, the apoB gene, cause another form of inherited hypercholesterolemia.

  • the retinoid vitamin A (retinol) bound to the retinol-binding protein
  • the steroids
      bound to the vitamin D binding protein bound to the corticosteroid binding globulin and estrogens bound to the sex hormone binding globulin
  • and there is growing evidence that, like cholesterol, they are taken into the cell by receptor-mediated endocytosis.


    Exocitosis

    Exocytosis is the process by which cells release particles from within the cell into the extracellular space.

    Objetivos de aprendizaje

    Describe exocytosis and the processes used to release materials from the cell.

    Conclusiones clave

    Puntos clave

    • Exocytosis is the opposite of endocytosis as it involves releasing materials from the cell.
    • Exocytosis has five stages, each leading up to the vesicle binding with the cell membrane.
    • Many bodily functions include the use of exocytosis, such as the release of neurotransmitters into the synaptic cleft and the release of enzymes into the blood.

    Términos clave

    • secreción: The act of secreting (producing and discharging) a substance, especially from a gland.
    • vesícula: A membrane-bound compartment found in a cell.

    Exocitosis

    Exocytosis’ main purpose is to expel material from the cell into the extracellular fluid this is the opposite of what occurs in endocytosis. In exocytosis, waste material is enveloped in a membrane and fuses with the interior of the plasma membrane. This fusion opens the membranous envelope on the exterior of the cell and the waste material is expelled into the extracellular space. Exocytosis is used continuously by plant and animal cells to excrete waste from the cells.

    Exocitosis: In exocytosis, vesicles containing substances fuse with the plasma membrane. The contents are then released to the exterior of the cell.

    Exocytosis is composed of five main stages. The first stage is called vesicle trafficking. This involves the steps required to move, over a significant distance, the vesicle containing the material that is to be disposed. The next stage that occurs is vesicle tethering, which links the vesicle to the cell membrane by biological material at half the diameter of a vesicle. Next, the vesicle’s membrane and the cell membrane connect and are held together in the vesicle docking step. This stage of exocytosis is then followed by vesicle priming, which includes all of the molecular rearrangements and protein and lipid modifications that take place after initial docking. In some cells, there is no priming. The final stage, vesicle fusion, involves the merging of the vesicle membrane with the target membrane. This results in the release of the unwanted materials into the space outside the cell.

    Some examples of cells releasing molecules via exocytosis include the secretion of proteins of the extracellular matrix and secretion of neurotransmitters into the synaptic cleft by synaptic vesicles. Some examples of cells using exocytosis include: the secretion of proteins like enzymes, peptide hormones and antibodies from different cells, the flipping of the plasma membrane, the placement of integral membrane proteins(IMPs) or proteins that are attached biologically to the cell, and the recycling of plasma membrane bound receptors(molecules on the cell membrane that intercept signals).


    The Back Story

    by Eleonora Aquilini

    What work led to this paper?

    Apicomplexan parasites are single-celled, obligate intracellular parasites defined by the presence of an “apical complex” - a group of cytoskeletal structures and organelles located at the anterior end of the cell. The apical complex is a critical compartment for parasites, because it regulates the events leading to host cell invasion. Out of all the remarkable structures of the apical complex, rhoptries are pear-shaped organelles that inject proteins into the host-cell (crossing not only the plasma membrane of the parasite but also that of the host), to support invasion and subversion of host immune function. But, how!?

    The molecular mechanism by which they are discharged and their effectors delivered into the host cytoplasm was unclear, and no orthologues of secretion genes from bacteria, yeasts, animals or plants were found associated to rhoptry secretion in Apicomplexa (with only one exception). Rhoptry secretion could thus represent an unconventional, parasite specific, secretory mechanism…

    Luckily, pioneering ultrastructural work done at the turn of the '80s pointed out some resemblance between secretory organelles in apicomplexan parasites and ciliates - their free-living relatives. Moreover, a rosette of 8 intramembranous particles, essential for fusion and secretion in free-living ciliates, was found to be present also in several apicomplexan parasites at the site of exocytosis, where the fusion takes place.

    A) Free-living Paramecio , Dubremetz et al. 1976 b) Eimeria parasite, Dubremetz et al. 1977 c) Plasmodium parasite merozoite, Dubremetz et al. 1979 d) Roof of Casa Batlo, by A. Gaudí in Barcelona – we were so obsessed with the rosette that we could spot it literally everywhere , Lebrun 2017 e) free-living Paramecio, Froissard et al. 2002 f) Plasmodium parasite sporozoite, Dubremetz et al. 1979 g) Toxoplasma parasite tachizoite, Aquilini et al. 2021

    These resemblances were all we needed to start.

    What did we do?

    Back and forth between free-living Ciliata and apicomplexan parasites.

    Building on the ultrastructural work done previously, we explored the similarities between organelle secretion system in ciliates (Tetrahymena thermophila y Paramecium tetraurelia) and apicomplexan parasites (Toxoplasma gondii y Plasmodium falciparum). We used cutting edge imaging techniques to study the structural elements and their architecture, and state-of-the-art molecular biology methods to explore the mechanism and molecular composition of these secretion systems.

    We cultivated tons of parasites and free-living ciliates, performed uncountables experiments, established the most amazing collaborations (Turkewitz Lab, specialists in secretory organelle biogenesis of Ciliata and for hobby in monarca butterfly metamorphosis and release and Chang Lab, masters of Cryo-electron tomography of the parasite apex in unfixed condition), I lived in Chicago for a while, we shared and discussed results in conferences (won one of the prizes at the Molecular Parasitology Meeting with preliminary results in 2018!), passed hours and hours and MORE hours looking at parasites under different types of microscopes . Dare I say we looked at them for hundreds of hours? Si.

    What did we find?

    That rhoptry exocytosis depends on a fusion rosette of intramembrane particles visible on the plasma membrane at the site of secretion. Rosette formation requires the “non discharge” complex (Nd6, Nd9, NdP1, NdP2). This critical structure (the fusion rosette) and the genetic elements necessary for its assembly are akin to the exocytic machinery of ciliates, their free-living relatives. Our data suggests a common ancestry for this fusion machinery that adapted, in two groups of protists that diverged hundreds of millions of years ago, to radically different environments . This same machinery is involved in self- defence in the free-living ciliates and supports host-cell invasion in intracellular parasites.

    We also noticed something that caught our attention: one cardinal protein responsible for exocytosis was present on an enigmatic apical vesicle visible in at the very tip of several apicomplexan parasites, but a bsent in free-living ciliates. Our results indicate that this parasite-exclusive vesicle is sandwiched between the tip of the rhoptry and the rosette, and may reflect the additional complexity required for parasitism and cell invasion, in which exocytosis must be coupled with injection of rhoptry content through the host cell membrane – in contrast with free-living organisms, where secretory organelles are more simply discharged into the environment to thwart predators. In support of this hypothesis, a similar vesicle is present at the apex of Perkinsus marinus, an oyster’s parasite phylogenetically considered an ancestor both of free-living ciliates and apicomplexan parasites, and a key taxon for understanding unique adaptations to parasitism.

    CRYO-ET view of the fusion rosette of intramembranous particles visible on the plasma mambrane and sagittal view and 3D reconstruction of the interactions between the tip of the rhoptry (orange), the apical vesicle (pink) and the fusion rosette (purple).

    Next challenge? Understand precisely the role and constitution of the apical vesicle, and further clarify how the molecular elements interact with each other to promote membrane fusion and rhoptry exocytosis.

    ZOOM-party paper accepted! From left to right, top line: Maryse Lebrun, Eleonora Aquilini, Marta Cova in the middle: Yi-Wei Chang, Nicolas Dos Santos Pacheco, Aaron Turkewitz bottom line: Laurence Berry and Daniela Sparvoli

    Summary and Future Perspectives

    We have summarized the above-mentioned mechanisms regarding exocytosis, endocytosis and possible coupling factors in Figure 2. From a macroscopic view, exocytosis may be matched with endocytosis: full fusion with clathrin-mediated endocytosis, KR and KS with clathrin-independent endocytosis, and sequential fusion and multivesicular exocytosis with bulk endocytosis. In this sense, the fate of the components of the fusing vesicle may be pre-determined at the moment of its choice of fusion modes. Therefore, understanding the early fusion intermediates of a vesicle, such as the hemifusion state, pore opening, dilation, and shape retention, will be instrumental for the understanding of the whole coupled process.

    Figure 2. Different types of exocytosis, endocytosis and coupling factors in secretory cells. Coupling factors and their roles in different steps are also listed on the scheme.

    The listed classification of different exocytosis and endocytosis subtypes is not based on molecular mechanism but rather hinges on studies that involve different experiments conducted on different cell types. The terminologies defined by different methods may not be mutually inclusive or exclusive. For example, bulk endocytosis is usually regarded as a subcategory of clathrin-independent endocytosis. However, the bulk membrane invaginations observed in secretory cells under EM, which are often taken as evidence supporting bulk endocytosis, may support the internalization of small or large chunks of membrane in a clathrin-dependent manner in live cell studies. KR and KS may be one uniform process at different stages but could also be two distinct processes with non-overlapping mechanisms. To differentiate these controversies, it is important to sort out molecules that are exclusively used for some specific processes, in addition to actin for clathrin-independent endocytosis (He et al., 2008 Delvendahl et al., 2016). Alternatively, we shall examine the same process in the same cells using multiple techniques. For example, combining cell-attached membrane capacitance measurements with imaging vesicular lipids in endocrine cells will help clarify whether lipid exchange occurs between the vesicle and the plasma membrane during the flickering of a small fusion pore. Simultaneous imaging of vesicular components and extracellularly applied fluorescent dextran of different sizes will help monitor the dilation of a fusion pore from ߡ nm to a much larger in diameter (Takahashi et al., 2002). This will differentiate KR and KS and ultimately determine the size of fusion pores accompanying KS exocytosis. Monitoring the shape of the membrane may reveal clues of hemifusion in live cells (Zhao et al., 2016) and will also confirm or disapprove the compound fusion/multivesicular exocytosis theories and their physiological significance. Finally, operating at a nanometer scale with lifetimes of milliseconds, most of the fusion intermediate structures described here can hardly be directly discerned even with state-of-the-art super-resolution microscopy methodologies (Huang et al., 2009 Schermelleh et al., 2010). Despite differences in exocytosis kinetics and the organization of fusion sites between synapses and endocrine cells, we believe that the core exo-endocytosis coupling mechanism is conserved. Therefore, if we can improve the temporal and spatial resolution and duration of current super-resolution imaging technologies, direct visualization of fusion pore intermediates in endocrine cells may invoke new insights that would render much of the discussed theories here obsolete.


    Understand Cell Secretion in 4 Q&As

    In secretory cells, such as the secretory cells of endocrine glands, organelles related to the production, processing and “export” of substances are widely present and well-developed. These organelles are the rough endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus.

    The nuclear membrane of secretory cells generally has more pores to allow the intense traffic of molecules related to protein synthesis between the cytoplasm and the nucleus.

    Secretory Organelles

    3. What is the role of the rough endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus in the production and release of proteins?

    In its outer membrane, the rough endoplasmic reticulum contains numerous ribosomes, structures where the translation of messenger RNA and protein synthesis occur. These proteins are stored in the rough endoplasmic reticulum and are later moved to the Golgi apparatus. Within the Golgi apparatus, proteins are chemically transformed and, when ready, they are put inside vesicles that detach from the organelle. These vesicles fuse with the plasma membrane (exocytosis) in the right place and its content is released outside the cell.

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    Protein Degradation

    When a protein has outlived its usefulness or become damaged, it is degraded by the cell. In eukaryotes, a protein that is to be degraded has a number of copies of the small protein ubiquitin attached to it by a series of ubiquitin-adding enzymes. Ubiquitin serves as a tag that marks the protein for degradation. A tagged protein is then sucked into a large cellular machine called the proteasome, which itself is made up of a number of protein components and looks something like a trash can. Inside the proteasome, the tagged protein is digested into small peptide fragments that are released into the cytoplasm where they can be further digested into free amino acids by other proteases. The life of a protein begins in one cellular machine called the ribosome and ends in another called the proteasome.


    Ver el vídeo: EXOCITOSIS. Constitutiva y regulada FÁCIL Y RÁPIDO! (Febrero 2023).