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2.0: el ADN está empaquetado en cromatina - Biología

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El ADN puede estar muy compactado

Si se estira en toda su longitud, la molécula de ADN del cromosoma humano más grande sería de 85 mm. Sin embargo, durante la mitosis y la meiosis, esta molécula de ADN se compacta en un cromosoma de aproximadamente 5 µm de largo. Aunque esta compactación facilita el transporte de ADN dentro de una célula en división, también hace que el ADN sea menos accesible para otras funciones celulares como la síntesis y transcripción del ADN. Por lo tanto, los cromosomas varían en la forma en que se empaqueta el ADN, según la etapa del ciclo celular y también según el nivel de actividad genética requerido en cualquier región particular del cromosoma.

Niveles de compactación

Hay varios niveles diferentes de organización estructural en los cromosomas eucariotas, y cada nivel sucesivo contribuye a una mayor compactación del ADN (Figura ( PageIndex {2} )). Para un ADN más compactado, solo se pueden aplicar los primeros niveles de organización. Cada nivel involucra un conjunto específico de proteínas que se asocian con el ADN para compactarlo. Primero, las proteínas llamadas centro histonas actuar como un carrete alrededor del cual el ADN se enrolla dos veces para formar una estructura llamada nucleosoma. Los nucleosomas se forman a intervalos regulares a lo largo de la cadena de ADN, lo que le da a la molécula la apariencia de “cuentas en una cuerda”. En el siguiente nivel de organización, histona H1 ayuda a compactar la cadena de ADN y sus nucleosomas en una Fibra de 30nm. Los niveles posteriores de organización implican la adición de proteínas de andamio que enrollan la fibra de 30 nm en bobinas, que a su vez se enrollan alrededor de otras proteínas de andamio.

El envasado de cromatina varía dentro del núcleo: eucromatina y heterocromatina

Los cromosomas se tiñen con algunos tipos de tintes, que es la razón por la que recibieron su nombre (cromosoma significa "cuerpo coloreado"). Ciertos tintes tiñen algunas regiones a lo largo de un cromosoma más intensamente que otras, dando a algunos cromosomas una apariencia de bandas. El material que forma los cromosomas, que ahora sabemos que son proteínas y ADN, se llama cromatina. Clásicamente, hay dos tipos principales de cromatina, pero estos son más los extremos de un espectro variado y continuo. Eucromatina está más suelto y tiende a contener genes que se están transcribiendo, en comparación con los más densamente compactados heterocromatina, que es rico en secuencias repetitivas y tiende a no ser transcrito. Las secuencias de heterocromatina incluyen secuencias cortas y altamente repetitivas llamadas ADN satélite, que adquirió su nombre porque su densidad flotante es claramente diferente de la banda principal de ADN después de la ultracentrifugación.

Características morfológicas de los cromosomas.

Los cromosomas también contienen otras características distintivas como centrómeros y telómeros. Ambos suelen ser heterocromatina. En la mayoría de los casos, cada cromosoma contiene un centrómero. Estas secuencias están unidas por proteínas centroméricas que unen el centrómero a los microtúbulos que transportan los cromosomas durante la división celular. Bajo el microscopio, los centrómeros de los cromosomas en metafase a veces pueden aparecer como constricciones en el cuerpo del cromosoma (Figura ( PageIndex {3} )) y se denominan constricciones primarias (1 °). Si un centrómero se encuentra cerca de la mitad de un cromosoma, se dice que es metacéntrico, mientras que un acrocéntrico centrómero está más cerca de un extremo de un cromosoma, y ​​un telocéntrico chromsome está en, o cerca, del final. En contraste, algunas especies tienen un holocéntrico centrómero, donde no se puede definir un centrómero único y todo el cromosoma actúa como centrómero. Telómeros son secuencias repetitivas cerca de los extremos de los cromosomas lineales y son importantes para mantener la longitud de los cromosomas durante la replicación y proteger los extremos de los cromosomas de alteraciones.

Es esencial describir la similitud entre los cromosomas utilizando la terminología adecuada (Fig. 2.4). Homólogo cromosomas son típicamente pares de cromosomas similares, pero no idénticos, en los que un miembro del par proviene del progenitor masculino y el otro proviene del progenitor femenino. Los homólogos contienen los mismos loci de genes pero no necesariamente los mismos alelos. No homólogo cromosomas contienen diferentes loci de genes y, por lo general, se pueden distinguir en función de características citológicas como la longitud, la posición del centrómero y los patrones de bandas.

Un cromosomas no replicados puede someterse a replicación, para producir un cromosoma replicado que tiene dos cromátidas hermanas, que están conectados físicamente entre sí en el centrómero y permanecen unidos hasta la división celular. Debido a que un par de cromátidas hermanas se produce mediante la replicación de una sola molécula de ADN, sus secuencias son esencialmente idénticas (los mismos alelos), y solo difieren debido a errores de replicación del ADN. Por otra parte, cromátidas no hermanas provienen de dos cromosomas separados pero homólogos y, por lo tanto, generalmente contienen los mismos loci de genes en el mismo orden, pero no necesariamente tienen secuencias de ADN idénticas (diferencias alélicas).

Los cromosomas descondensados ​​no están ordenados aleatoriamente dentro del núcleo en interfase. A menudo tienen ubicaciones específicas dentro del núcleo y en relación entre sí (Figura ( PageIndex {5} ))

Replicación de cromosomas y ADN

Cuando entra la celda Fase S en el ciclo celular (G1-S-G2-M) se replica todo el ADN cromosómico. Esto lo hacen unas enzimas llamadas Polimerasas de ADN. Todas las ADN polimerasas sintetizan nuevas cadenas añadiendo nucleótidos al grupo 3'OH presente en el nucleótido anterior. Por esta razón, se dice que funcionan en una dirección de 5 'a 3'. Las ADN polimerasas utilizan una sola hebra de ADN como plantilla sobre la que sintetizará la secuencia complementaria. Esto funciona bien para la mitad de los cromosomas: las ADN polimerasas dirigidas por ADN viajan a lo largo de las cadenas de ADN originales formando cadenas complementarias (Figura ( PageIndex {6} ) a).

La replicación del ADN tanto en procariotas como en eucariotas comienza en un Origen de la replicación (O yo). Los orígenes son secuencias específicas en posiciones específicas del cromosoma. En E. coli, los OriC el origen tiene un tamaño de ~ 245 pb. La replicación del cromosoma comienza con la unión de la proteína iniciadora de DnaA a un 9-mer rico en AT en OriC y derrite las dos hebras. Luego, la proteína cargadora DnaC ayuda a la proteína helicasa DnaB a extender las regiones monocatenarias de modo que la primasa DnaG pueda iniciar la síntesis de un cebador de ARN, a partir del cual las ADN polimerasas pueden comenzar la síntesis de ADN en las dos horquillas de replicación. Las bifurcaciones continúan en direcciones opuestas hasta que se encuentran con otra bifurcación o el final del cromosoma (Figura ( PageIndex {7} )).

Los extremos de los cromosomas lineales presentan un problema: en cada extremo, una hebra no se puede replicar por completo porque no hay cebador para extender. Aunque la pérdida de una secuencia tan pequeña no sería un problema, las rondas continuas de replicación darían como resultado la pérdida continua de la secuencia desde el extremo del cromosoma hasta un punto en el que comenzaría a perder secuencias de genes esenciales. Por tanto, este ADN debe replicarse. La mayoría de los eucariotas resuelven el problema de sintetizar este ADN no replicado con una ADN polimerasa especializada llamada telomerasa en combinación con una polimerasa regular. Las telomerasas son ADN polimerasas dirigidas por ARN. Son un riboproteína, ya que están compuestos tanto de proteínas como de ARN. Como muestra la Figura ( PageIndex {6} ) b, estas enzimas contienen una pequeña porción de ARN que sirve como una plantilla portátil y reutilizable a partir de la cual se sintetiza el ADN complementario. El ARN en las telomerasas humanas usa la secuencia 3-AAUCCC-5 'como plantilla y, por lo tanto, nuestro ADN telomérico tiene la secuencia complementaria 5'-TTAGGG-3' repetida una y más de miles de veces. Una vez que la telomerasa ha creado la primera hebra, una primasa sintetiza un cebador de ARN y una ADN polimerasa regular puede formar una hebra complementaria para que el ADN de los telómeros finalmente sea bicatenario hasta la longitud original (Figura ( PageIndex {8} ) ). Nota: el número de repeticiones y, por tanto, el tamaño del telómero, no se establece. Fluctúa después de cada ronda del ciclo celular. Debido a que hay muchas repeticiones al final, esta fluctuación mantiene un búfer de longitud, a veces es más largo, a veces más corto, pero la longitud promedio se mantendrá durante las generaciones de replicación celular.

En ausencia de telomerasa, como es el caso de las células somáticas humanas, la división celular repetida conduce a la "Límite de Hayflick”, Donde los telómeros se acortan a un límite crítico y luego las células entran en una fase de senescencia de no crecimiento. La activación de la expresión de la telomerasa permite que una célula y sus descendientes se vuelvan inmortales y eludan el límite de Hayflick. Esto sucede en las células cancerosas, que pueden formar tumores, así como en las células en cultivo, como Células HeLa, que se puede propagar esencialmente de forma indefinida. Las células HeLa se han mantenido en cultivo desde 1951.

Los cromosomas eucariotas tienen múltiples orígenes de replicación

En procariotas, con un cromosoma circular pequeño, simple, solo se necesita un origen de replicación para replicar todo el genoma. Por ejemplo, E. coli tiene un genoma (cromosoma) de ~ 4.5 Mb que se puede duplicar en ~ 40 minutos asumiendo un origen único, replicación bidireccional y una velocidad de ~ 1000 bases / segundo / bifurcación para la polimerasa.

Sin embargo, en mayores y ms complicados eucariotas, con múltiples cromosomas lineales, se requiere más de un origen de replicación por cromosoma para duplicar todo el conjunto de cromosomas en las 8 horas de la fase S del ciclo celular. Por ejemplo, el genoma diploide humano tiene 46 cromosomas (6 x 109 pares de bases). Los cromosomas más cortos tienen ~ 50 Mbp de largo y, por lo tanto, no podrían replicarse desde un solo origen. Además, la tasa de movimiento de la horquilla de replicación es más lenta, solo ~ 100 base / segundo. Por lo tanto, los eucariotas contienen múltiples orígenes de replicación distribuidos a lo largo de cada cromosoma para permitir la duplicación de cada cromosoma dentro del tiempo observado de la fase S (Fig. 2.9).


En las células eucariotas, el ADN se empaqueta en una estructura macromolecular compleja llamada cromatina. Wang et al. han desarrollado un método de imagen para mapear la posición de múltiples regiones en cromosomas individuales, y los resultados confirman que la cromatina está organizada en grandes dominios de contacto llamados TADS (dominios de asociación topológica). Inesperadamente, sin embargo, el plegado se desvía del modelo clásico de glóbulos fractales en escalas de gran longitud.

La organización espacial de la cromatina afecta críticamente la función del genoma. Estudios recientes de captura de conformación cromosómica han revelado dominios de asociación topológica (TAD) como una característica conservada de la organización de la cromatina, pero se desconoce cómo se organizan espacialmente los TAD en cromosomas individuales. Aquí, desarrollamos un método de imágenes para mapear las posiciones espaciales de numerosas regiones genómicas a lo largo de cromosomas individuales y rastreamos las posiciones de los TAD en autosomas de interfase humanos y cromosomas X. Observamos que el plegamiento de cromosomas se desvía del modelo ideal de fractal-glóbulo a grandes escalas de longitud y que los TAD están organizados en gran medida en dos compartimentos dispuestos espacialmente de manera polarizada en cromosomas individuales. Los cromosomas X activos e inactivos adoptan diferentes configuraciones de plegamiento y compartimentación. Estos resultados sugieren que la organización espacial de los dominios de la cromatina puede cambiar en respuesta a la regulación.

La organización espacial de la cromatina, como los dominios de la cromatina, los bucles de cromatina, las asociaciones de la cromatina con las estructuras nucleares y los territorios cromosómicos, desempeña un papel importante en las funciones esenciales del genoma (16). Sin embargo, quedan muchas lagunas en nuestra comprensión del plegamiento tridimensional (3D) de los cromosomas individuales en el núcleo. Recientemente, los métodos de captura de conformación cromosómica como Hi-C (4, 7) han revelado una gran cantidad de conocimientos estructurales para los cromosomas en interfase. Por ejemplo, la cromatina se organiza en dominios de asociación topológica (TAD) o dominios de contacto que tienen un tamaño de cientos de kilobases (kb) (811). Estos dominios tienden a segregarse espacialmente entre sí (9, 12, 13) y en Drosophila, corresponden a los patrones de bandas de los cromosomas politénicos (14, 15). En escalas de longitud de varios cientos de kilobases a varias megabases, la escala de la ley de potencias de la frecuencia de contacto Hi-C es consistente con un modelo de polímero fractal-glóbulo (7, 16), mientras que, dentro de los TAD, los mapas de contacto Hi-C se describen mejor mediante un modelo de extrusión de bucle (17, 18). Las imágenes de superresolución muestran que los dominios de cromatina en diferentes estados epigenéticos adoptan distintas configuraciones de plegado con diferentes propiedades de escala de ley de potencias (13). Si el modelo ideal de glóbulos fractales puede describir la cromatina en escalas de longitud más allá de varias megabases sigue siendo una pregunta abierta (19, 20). Los análisis de Hi-C también han revelado dos compartimentos multi-TAD, los compartimentos A y B, que están enriquecidos con cromatina activa e inactiva, respectivamente (7, 21). Sin embargo, debido a que los mapas de contacto utilizados para identificar estos compartimentos se obtuvieron del promedio de conjuntos de muchos cromosomas, no está claro si los compartimentos A y B son estructuras que existen en cromosomas individuales dentro de células individuales y, de ser así, cómo están espacialmente los dos compartimentos. arreglados uno con respecto al otro. Para responder preguntas sobre la organización espacial de los cromosomas individuales se requieren métodos que visualicen directamente la conformación de cromosomas individuales en células individuales.

La hibridación fluorescente in situ (FISH) proporciona un medio poderoso para obtener imágenes directamente de la organización espacial de los cromosomas, especialmente cuando se usa para apuntar simultáneamente a dos o más loci genómicos (p. Ej., 19, 20, 2224). En un esfuerzo, se ha utilizado un enfoque de código de barras de tres colores para etiquetar simultáneamente múltiples loci de cromatina para rastrear la conformación de un brazo cromosómico en Drosophila embriones de blastodermo24). No obstante, el rastreo de rutina de la compleja ruta de plegamiento 3D de los cromosomas ha seguido siendo un desafío debido a las dificultades asociadas con la obtención de imágenes simultáneamente y la identificación inequívoca de muchas regiones genómicas en los cromosomas en interfase. Aquí, presentamos un método FISH multiplexado que permite la obtención de imágenes secuenciales de muchas regiones genómicas para el rastreo 3D de cromosomas individuales en el núcleo y el uso de este método para estudiar las disposiciones espaciales de TAD y compartimentos en los cromosomas 20, 21, 22 y X de células IMR90 diploides humanas (XX).

Para mapear las posiciones espaciales 3D de TAD, delineadas aquí como dominios genómicos basados ​​en mapas Hi-C de promedio de conjunto (8), a lo largo de un cromosoma completo, etiquetamos las regiones centrales de 100 kb de TADs usando una versión de oligonucleótidos dual de Oligopaints (25, 26), en el que cada TAD se apuntó con 1000 sondas oligonucleotídicas "primarias" distintas y una sonda "secundaria" acompañante (Fig. 1A y Fig. S1). Cada una de las 1000 sondas primarias consistía en una secuencia de dirección única complementaria a una secuencia dada dentro del TAD y una región no genómica, llamada Mainstreet, que contenía una secuencia de lectura compartida por las 1000 sondas pero única para cada TAD. La sonda secundaria contenía una secuencia complementaria a la secuencia de lectura en Mainstreet. Usamos las coordenadas genómicas de TADs derivadas de Hi-C (8) para diseñar las secuencias de direccionamiento de las sondas primarias y producir estas sondas con un método de amplificación enzimática de alto rendimiento (27). Explotamos un protocolo de hibridación e imágenes similar al que describimos anteriormente en la hibridación in situ de fluorescencia robusta a errores multiplexados (MERFISH) (27) pero con algunas modificaciones. Primero, hibridamos todas las sondas primarias con el cromosoma de interés (fig. S1, Hyb 0), obtuvimos imágenes de la muestra y ubicamos el cromosoma en el núcleo. Luego fotoblanqueamos la muestra y realizamos una serie de hibridaciones secundarias, separadas por fotoblanqueo, para etiquetar secuencialmente y obtener imágenes de TAD individuales (Fig. 1A y fig. S1, Hyb 1, Hyb 2, y así sucesivamente). Cada ronda de hibridación secundaria empleó dos sondas secundarias diferentes, marcadas respectivamente con dos tintes espectralmente distintos, lo que nos permite visualizar dos TAD simultáneamente utilizando imágenes de fluorescencia 3D de dos colores con z-paso. Las posiciones del centroide de las imágenes 3D de TAD individuales se utilizaron para aproximar sus posiciones en X, y, y z.

(A) Un esquema simplificado del enfoque de imágenes. Todas las sondas primarias se hibridan primero con el cromosoma diana, después de lo cual las sondas secundarias que se dirigen a cada TAD se hibridan secuencialmente con las secuencias de lectura en las sondas primarias, se obtienen imágenes y luego se blanquean. En cada ronda de hibridación secundaria, dos sondas secundarias diferentes marcadas con tintes de diferentes colores permitieron la visualización simultánea de dos TAD. Más detalles se muestran en la fig. S1. (B) Imagen de una célula IMR90 después de la hibridación primaria (Hyb 0) con sondas primarias dirigidas a todos los TAD en Chr21. Las dos manchas brillantes, una marcada con un cuadro amarillo, corresponden a las dos copias de Chr21 en esta célula diploide. (C) Imágenes de la región del recuadro amarillo en (B) después de cada ronda de hibridación secundaria (Hyb 1 a 17). (D) Las posiciones de los 34 TAD del cromosoma se representaron como puntos rojos superpuestos en la imagen Hyb 0. Barras de escala en (B) a (D), 2 μm. (mi) Posiciones de TAD trazadas en 3D. (F) Matriz de distancia espacial media para los 34 TAD, con cada elemento de la matriz correspondiente a la distancia espacial media entre un par de TAD. (GRAMO) Frecuencia de contacto de alta C inversa entre cada par de TAD frente a su distancia espacial media. El coeficiente de correlación (R) y la pendiente de una línea ajustada (k) son exhibidos. La frecuencia de contacto se calcula como los recuentos totales de Hi-C entre dos TAD normalizados a sus longitudes genómicas (8). (H) Distancia espacial media versus distancia genómica para todos los pares de TAD. Las líneas se ajustan a la función de ley de potencias con un exponente de escala predefinido (S = 1/3, verde) o con S como parámetro de ajuste (rojo). Se utilizaron datos de 120 cromosomas individuales para generar (F) a (H).

Primero usamos este método para obtener imágenes del cromosoma 21 (Chr21) en células IMR90 en interfase. La imagen de Hyb 0 mostró que, cuando se tomaron imágenes juntas, las señales fluorescentes de los 34 TAD de Chr21 se fusionaron en un parche continuo (Fig. 1B). Luego, las 17 rondas de hibridación secundaria nos permitieron obtener imágenes de cada uno de los 34 TAD por separado (Fig.1C), determinar la posición 3D de cada TAD y rastrear la ruta 3D de este cromosoma en el nivel de TAD (Fig.1, D y MI). Para caracterizar la organización de Chr21, rastreamos 120 copias de Chr21 en muchas células, calculamos la distancia espacial media entre cada par de TAD (promediada sobre los 120 cromosomas) y construimos una matriz de distancia espacial media por pares para los 34 TAD ( Figura 1F).

Para comparar nuestras mediciones con datos anteriores de Hi-C (8), correlacionamos la matriz de distancia espacial media con la matriz de frecuencia de contacto Hi-C correspondiente de Chr21 (fig. S2). En particular, la distancia espacial media mostró una alta correlación con la frecuencia de contacto inversa entre los TAD, con un coeficiente de correlación de Pearson de 0,91 en casi tres órdenes de magnitud en la frecuencia de contacto (Fig. 1G). Una correlación tan fuerte entre los resultados de dos métodos diferentes proporcionó una validación cruzada para ambos métodos en las escalas de longitud de TAD a cromosoma probadas en este trabajo. La relación entre la distancia espacial y la frecuencia de contacto también proporciona una medida valiosa para explorar la organización de los cromosomas. Una aproximación de campo medio predice que la frecuencia de contacto debería ser inversamente proporcional a la tercera potencia de la distancia espacial media, mientras que se espera que la potencia de la cromatina real sea mayor que 3 (19). Nuestros datos mostraron que la frecuencia de contacto Hi-C era inversamente proporcional a la cuarta potencia de la distancia espacial media [Fig. 1G, exponente de escala k = 4,1 ± 0,1, intervalo de confianza (IC) del 95%, norte = 120 cromosomas]. También analizamos las distribuciones de las distancias espaciales entre pares de TAD (fig. S3) y encontramos que la frecuencia de contacto Hi-C escala linealmente con la probabilidad de que dos TAD se acerquen espacialmente (fig. S4). Estos resultados sugieren una función de calibración para convertir las frecuencias de contacto de Hi-C en distancias espaciales medias en escalas de longitud de TAD a cromosomas, aunque queda por determinar si esta calibración se extiende a escalas sub-TAD donde la correlación entre el contacto de Hi-C la frecuencia y la proximidad espacial pueden ser más débiles (28).

Además, nuestros datos mostraron que la distancia espacial media entre los TAD escalados con su distancia genómica a aproximadamente un quinto de potencia (Fig. 1H, exponente de escala S = 0,21 ± 0,01, IC del 95%, norte = 120 cromosomas). Este valor se desvió de la potencia de un tercio esperada del modelo ideal de polímero fractal-glóbulo (19). La desviación fue más pronunciada para grandes distancias genómicas, mientras que los puntos de datos con distancias genómicas inferiores a 7 Mb mostraron un exponente de escala cercano a un tercio (fig. S5), consistente con los resultados anteriores (7, 19). Curiosamente, una simulación previa de polímeros confinados, sin nudos y de tamaño finito mostró una desviación del exponente de escala de un tercio en escalas de gran longitud (29), sugiriendo un posible modelo físico para explicar nuestra observación experimental.

A continuación, determinamos si las posiciones espaciales de los TAD se dividen en compartimentos distintos mediante la implementación de un análisis de normalización similar al realizado para los datos de Hi-C (7). Primero, normalizamos la matriz de distancia espacial media a la distancia espacial esperada en cada distancia genómica según lo predicho por la escala de la ley de potencias que se muestra en la Fig. 1H. La matriz de distancia espacial normalizada mostró un patrón con regiones alternas de valores grandes y pequeños (Fig. 2A), lo que sugiere la existencia de dos subgrupos de TAD. A continuación, calculamos el coeficiente de correlación de Pearson entre cada par de columnas en la matriz de distancia normalizada, definimos este coeficiente como la correlación entre los dos TAD correspondientes y construimos una matriz de correlación de Pearson para todos los pares de TAD (Fig. 2B). Esta matriz de correlación de Pearson mostró un patrón de cuadros, consistente con la existencia de dos compartimentos con TAD del mismo compartimento que se correlacionaron positivamente. A modo de comparación, utilizamos un enfoque similar (7) para analizar los datos de Hi-C (8) y obtuvo una matriz de correlación de Pearson casi idéntica (Fig.2C), lo que sugiere que los dos compartimentos observados en nuestros datos de imágenes corresponden a los compartimentos A y B identificados por el análisis de Hi-C (7, 21). Para asignar cada TAD a un compartimento, realizamos un análisis de componentes principales en la matriz de correlación de Pearson derivada de las distancias espaciales normalizadas y los TAD asignados con valores positivos y negativos a lo largo del primer componente principal a los compartimentos A y B, respectivamente (Fig. 2D) . Se obtuvo una asignación casi idéntica aplicando el análisis de componentes principales directamente a la matriz de distancia espacial normalizada (fig. S6). Además, observamos que las modificaciones de histonas para la cromatina activa (30, 31) y cromatina inactiva (32) se enriquecieron en los compartimentos A y B, respectivamente (fig. S7), de acuerdo con el análisis previo de Hi-C (7). Luego, analizamos la relación de escala entre la frecuencia de contacto de alta C inversa y la distancia espacial media para pares de TAD que están dentro del mismo compartimento o compartimento cruzado y encontramos que los pares de TAD de compartimento cruzado dieron un exponente de escala moderadamente más alto (fig. S8 ).

(A) Matriz de distancia espacial normalizada para los 34 TAD, normalizada sobre las distancias espaciales esperadas determinadas por la función de ley de potencias ajustada en la Fig. 1H (línea roja). (B) Matriz de correlación de Pearson de los 34 TAD, determinada a partir de la matriz de distancia espacial normalizada en (A). (C) Matriz de correlación de Pearson de los 34 TAD calculados a partir de datos Hi-C anteriores (8). (D) Asignación de TAD al compartimento A (barras rojas) o al compartimento B (barras azules) según un análisis de componentes principales de la matriz de correlación de Pearson que se muestra en (B). (mi) (Paneles izquierdos) Mapas de posición espacial de los TAD del compartimento A (rojo) y los TAD del compartimento B (azul) en dos cromosomas individuales. Para una mejor visualización, los cromosomas se rotaron de modo que el eje de polarización que conecta los centroides de los compartimentos A y B esté alineado a lo largo del z eje. (Paneles derechos) Gráficos de casco convexo 3D correspondientes. (F) Valores del índice de polarización medidos para cromosomas individuales (observados) en comparación con los derivados de un control de aleatorización en el que las asignaciones de compartimentos se aleatorizaron manteniendo el número total de TAD en cada compartimento. Los valores de control distintos de cero surgieron de fluctuaciones asociadas con el número finito de TAD por cromosoma, lo que proporciona una línea de base para la comparación. Cada punto corresponde al índice de polarización de un solo cromosoma, las líneas rojas representan los valores medios y los cuadros azules representan los cuantiles del 25% al ​​75%. **PAG & lt 0,001 (prueba de Wilcoxon). Se utilizaron datos de 120 cromosomas individuales para generar (A), (B), (D) y (F).

Los análisis de población promediados anteriores no pueden revelar si la mayor correlación observada entre los TAD en el mismo compartimento representa una proximidad transitoria entre estos TAD o si los dos compartimentos son estructuras físicas que existen en los cromosomas individuales, ni pueden revelar cómo los compartimentos están dispuestos espacialmente, p. Ej. , si un compartimento se envuelve alrededor del otro para formar una organización radial dentro de un solo cromosoma o si los dos compartimentos están dispuestos uno al lado del otro, polarizado. Para abordar estas preguntas, examinamos las posiciones espaciales de las regiones centrales de TAD en cromosomas individuales. En particular, la mayoría de los cromosomas individuales en células individuales mostraron una disposición espacialmente polarizada de los TAD del compartimento A y del compartimento B (Fig. 2E). Para cuantificar la separación polarizada de los compartimentos en los cromosomas individuales, definimos un índice de polarización como, donde VA y VB son los volúmenes convexos del casco de los dos compartimentos y VS es su volumen compartido. Si los dos compartimentos se superponen perfectamente entre sí, o si un compartimento se envuelve alrededor del otro, el índice de polarización debe ser igual a cero, por otro lado, si los dos compartimentos están completamente separados en el espacio de manera polarizada, el índice de polarización debe ser igual a 1 (figura S9). Los valores del índice de polarización medidos de Chr21 fueron de hecho cercanos a 1, con un valor medio de 0,86, sustancialmente mayor que los valores derivados de un control de aleatorización (Fig. 2F).

Para investigar si los hallazgos anteriores eran específicos de cromosomas, rastreamos las posiciones de las regiones centrales de 100 kb de los TAD en Chr22 y Chr20 mediante la obtención de imágenes de los 27 TAD en Chr22 y 30 de los 60 TAD (todos los demás) en Chr20 y encontramos conclusiones similares a las descritas para Chr21. Primero, la frecuencia de contacto Hi-C era inversamente proporcional a la cuarta potencia de la distancia espacial media entre los TAD (figs. S10A y S11A). En segundo lugar, la distancia espacial media entre los TAD escalados con la distancia genómica a una potencia similar, aunque ligeramente más pequeña, que en Chr21 (Fig.3, A y B), desviándose sustancialmente de la potencia de un tercio predicha por el modelo ideal de fractal-glóbulo. . En tercer lugar, el análisis basado en distancias espaciales mostró que los TAD en Chr22 y Chr20 se dividieron en dos compartimentos espaciales (Fig.3, C y D, y figs. S10, B a E, y S11, B a E), con asignaciones casi idénticas a los obtenidos de nuestro análisis de datos Hi-C. Estos dos compartimentos estaban nuevamente organizados espacialmente de manera polarizada, uno al lado del otro, en cromosomas individuales (Fig. 3, E a H), aunque el grado de separación polarizada es moderadamente menor en Chr20. Queda por determinar si estos hallazgos se extienden a todos los demás autosomas.

(A y B) Distancia espacial media versus distancia genómica para Chr22 (A) y Chr20 (B). Los ajustes de la función de ley de potencias se muestran como líneas rojas y los exponentes de escala (S) son exhibidos. (C y D) Asignaciones de compartimentos de TAD basadas en análisis de componentes principales de la matriz de correlación de Pearson para Chr22 (fig. S10D) y Chr20 (fig. S11D). Barras azules, compartimento B. Barras rojas, compartimento A. (mi y F) Mapas de posición espacial de los TAD del compartimento A (rojo) y los TAD del compartimento B (azul) en cromosomas individuales para Chr22 (E) y Chr20 (F), representados sin (izquierda) o con (derecha) cascos convexos 3D. (GRAMO y H) Valores del índice de polarización medidos para cromosomas individuales para Chr22 (G) y Chr20 (H) (observados) en comparación con los del control de aleatorización (control). Los puntos, las líneas rojas y los recuadros azules se definen como en la Fig. 2F. **PAG & lt 0,001 (prueba de Wilcoxon). Datos de

Se utilizaron 150 cromosomas individuales para generar (A), (C) y (G), y datos de

Se utilizaron 110 cromosomas individuales para generar (B), (D) y (H).

Finalmente, rastreamos las posiciones de las regiones centrales de 100 kb de TAD en el cromosoma X (ChrX). Obtuvimos imágenes de 40 TAD (de un total de 86) que abarcan todo el cromosoma a intervalos relativamente uniformes. Se sabe que una de las dos copias de ChrX en células de mamíferos femeninos se somete a inactivación de X (33, 34). Usamos coordenadas TAD obtenidas de los datos combinados de Hi-C (8) de copias activas e inactivas de ChrX (Xa y Xi) para determinar los sitios de marcado, pero tenga en cuenta que las estructuras TAD están atenuadas o ausentes en Xi (9, 35). Distinguimos Xa y Xi por inmunotinción de macroH2A.1 (fig. S12), una variante de histona enriquecida en Xi (35). Las matrices de distancia espacial media de Xi y Xa fueron sorprendentemente diferentes, siendo los elementos de la matriz Xi sustancialmente más homogéneos y en su mayoría con valores más pequeños que los elementos de la matriz Xa (fig. S13, A y B). De hecho, ajustar una función de ley de potencias a la gráfica de distancia espacial versus genómica produjo un exponente de escala muy pequeño de S = 0,074 ± 0,003 (IC del 95%, norte = 95 cromosomas) para Xi (Fig. 4A), mientras que el exponente de escala para Xa (S = 0,22 ± 0,01, IC del 95%, norte = 95 cromosomas) permanecieron similares a los de Chr20, Chr21 y Chr22 (Fig. 4B). Estas observaciones sugieren que Xi no solo era más compacto (36) pero también adoptó una disposición de cromatina espacialmente más entremezclada con distancias interloci más homogéneas, que recuerda la organización de la cromatina observada para los dominios reprimidos por Polycomb usando imágenes de superresolución (13). Dado el enriquecimiento de proteínas del grupo Polycomb en Xi (33, 34), estas observaciones sugieren un mecanismo potencialmente general para inducir una configuración de plegado de cromatina tan compacta y altamente entremezclada.

Las estructuras TAD están atenuadas o ausentes en Xi (9, 35) y por lo tanto, para Xi, el término "TAD" simplemente representa loci genómicos en imágenes. (A y B) Distancia espacial media versus distancia genómica para Xi (A) y Xa (B). Los ajustes de la función de ley de potencias se muestran como líneas rojas y los exponentes de escala (S) son exhibidos. (C y D) Asignaciones de compartimentos para Xi (C) y Xa (D), basadas en análisis de componentes principales de la matriz de correlación de Pearson para Xi (fig. S13C) y Xa (fig. S13D). Se indican las posiciones del macrosatélite DXZ4 en Xi y los brazos pyq en Xa. (mi y F) Mapas de posición espacial de TAD en cromosomas únicos Xi (E) y Xa (F), sin cascos convexos 3D (izquierda) o con (derecha). (GRAMO y H) Índice de polarización medido para Xi (G) y Xa (H) (observado) en comparación con los del control de aleatorización (control). Los puntos, las líneas rojas y los recuadros azules se definen como en la Fig. 2F. **PAG & lt 0,001 (prueba de Wilcoxon). Se utilizaron datos de 95 cromosomas individuales para generar (A) a (D), (G) y (H).

En particular, ChrX también formó dos compartimentos, pero los esquemas de compartimentación fueron diferentes para Xi y Xa. Consistent with previous allele-specific Hi-C analyses (21, 35, 37), Xi was largely partitioned into two contiguous compartments (also called superdomains or megadomains) separated on the genomic map by the DXZ4 macrosatellite (Fig. 4C and fig. S13, C, E, and G). Such a scheme might result from the ability of the DXZ4 element to recruit the chromatin insulator CTCF to Xi but not to Xa (38). The Xa TADs were also partitioned into two spatial compartments, but the two compartments corresponded instead to the p and q arms of the chromosome (Fig. 4D and fig. S13, D, F, and H). Interestingly, the two compartments in both Xa and Xi were again spatially organized in a polarized, side-by-side manner in individual chromosomes (Fig. 4, E to H). However, the degree of polarized segregation was notably smaller for Xi (Fig. 4G), consistent with our observation of more intermixed chromatin in Xi. It is worth noting that within the individual arms of Xa, TADs were further partitioned into two subcompartments (fig. S14, A to C), one of which appeared to be relatively enriched with histone modifications for active chromatin (fig. S14D), implying that these subcompartments potentially correspond to the A and B compartments.


What is chromatin?

The DNA of prokaryotic cells posses a minimal amount of information, so it is simply distributed in a circular form over the cytoplasm. However, the DNA of eukaryotes contains millions of pieces of hereditary information. Therefore, it&rsquos important to organize them properly in order to fit into the nucleus. Chromatin is a way to organize the genetic information to form the blueprint of life. It helps to pack the DNA into a small volume, so that it resides within the nucleus, with all the genetic information contained safely. It prevents the DNA from becoming tangled and plays a major role in reinforcing the DNA during cell division by regulating gene expression, facilitating DNA replication and preventing damage.

Chromatin strand (Photo Credit : Juan Gaertner/ Shutterstock)


Tsukiyama Lab

Chromatin regulation for cell cycle and cell division control
We investigate how chromatin structure is regulated en vivo. In eukaryotic cells, DNA is packaged into chromatin. This allows compact storage of the genome, but limits the access of DNA binding proteins to their targets. Therefore, chromatin structure strongly influences all processes that rely on protein-DNA interactions, including transcription, DNA replication, repair and recombination, and mis-regulation of chromatin structure can lead to diseases such as cancer. One of the major challenges in studying chromatin regulation is to elucidate how chromatin regulation affects such a wide variety of processes in biological contexts, such as cell cycle control and cell differentiation. We are particularly interested in understanding mechanisms of chromatin regulation within these important biological contexts. We use a diverse set of approaches, including genomics, molecular genetics, cell biology and biochemistry. Graduate students in the lab learn how to perform a wide variety of techniques, including deep sequencing and bioinformatic analyses.


Packaging and unpacking of the genome

DNA represents a dynamic form of information, balancing efficient storage and access requirements. Packaging approximately 1.8m of DNA into something as small as a cell nucleus is no mean feat, but unpacking it again to access the required sections and genes? That requires organisation.

In a nutshell, this is achieved through DNA condensed and packaged as chromatin, a complex of DNA and proteins called histones, which is constantly modified as the DNA is accessed. The histone proteins need constant replacement to maintain the correct chromatin structure required for all DNA related processes in the cell.

To understand more about the importance of histone replacement, researchers at the Babraham Institute and MRC Clinical Sciences Centre used developing mouse egg cells, oocytes. Developing oocytes provide a system where the mechanics of how DNA is packaged into cells can be explored in the absence of DNA replication, as egg cells do not divide. However, their genomes are highly active as the development of the egg involves widespread turning on and off of genes and DNA modification before the mature egg cell is ready for fertilisation. The work, published in the latest issue of Molecular Cell, relied on the Institute's expertise in single cell analysis, allowing accurate mapping of the epigenetic landscape in precious cells.

The researchers deleted a histone chaperone protein -- one of a group of proteins that are responsible for replacing histones in the chromatin structure -- and analysed the effects on egg cell development, DNA integrity and accumulation of DNA methylation.

"Oocytes lacking the Hira histone chaperone showed severe developmental defects which often led to cell death." said Dr Gavin Kelsey, research group leader in the Institute's Epigenetics programme and author on the paper. "The whole system is disrupted, eggs accumulate DNA damage and the altered chromatin means that genes cannot be efficiently silenced or activated. But we also uncovered an intricate relationship between the different epigenetic systems operating in the oocyte, where failure to ensure normal histone levels severely compromised deposition of methylation on the underlying DNA."

The research addresses the importance of histone turnover in maintaining genomic fidelity and adds to our understanding about the mechanisms in place to protect the integrity of the genome as it is remodelled and reshaped. Studying this in the context of the developing oocytes provides new insights into our dynamic genome, unclouded by the complications of DNA replication, and also reveals how important maintaining chromatin dynamics is to the integrity of our gametes.


Department of Cancer Biology

RESEARCH INTERESTS:

In eukaryotes, DNA is packaged into chromatin, the basic unit of which is the nucleosome. Chromatin structure plays a critical role in the regulation of gene expression by imposing topological constraints and by creating a barrier for transcriptional regulators. SWI/SNF enzymes are multiprotein complexes that alter chromatin structure in an ATP dependent manner and are involved in the regulation of gene expression. Components of the SWI/SNF complex are essential for mouse development and play important roles in several human cancers.

Cellular differentiation is characterized by the activation of previously silent genes embedded in repressive chromatin structure that is inaccessible to the transcriptional machinery. SWI/SNF enzymes interact with master regulators of differentiation to disrupt chromatin structure and activate lineage specific gene expression. We have previously determined that SWI/SNF enzymes interact with the master regulator of melanocyte differentiation, Microphthalmia Transcription Factor (MITF). MITF regulates the expression of genes that encode the enzymes needed for melanin synthesis, melanosome structure, and melanocyte survival. The main focus of my research is to study the functional role of SWI/SNF enzymes in the regulation of gene expression during melanocyte differentiation and to determine how SWI/SNF function is de-regulated in melanoma.

Member of the mentoring faculty for the Biomedical Sciences Graduate Program (Cancer Biology Track).

EDUCATION:

Doctor. 1998 University of California, Davis, Davis, CA
B.S. 1984 Cornell University, Ithaca, NY

RECENT ACADEMIC APPOINTMENTS:

2012-pres Associate Professor, Cancer Biology, University of Toledo Health Scicence Campus
2005-2012 Assistant Professor, Biochemistry & Cancer Biology, University of Toledo Health Science Campus
2004-2005 Research Assistant Professor, Department of Cell Biology, University of Massachusetts Medical School
1998-2004 Postdoctoral Fellow, Department of Cell Biology, University of Massachusetts Medical School,
1990-1997 Research & Teaching Assistant, Department of Plant Pathology, Univesity of California, Davis
1988-1990 Research & Teaching Assistant, Department of Biological Sciences, California State University, Fullerton


First 3-D atomic view of key genetic processes

In a landmark study to be published in the journal Naturaleza, scientists have been able to create the first picture of genetic processes that happen inside every cell of our bodies. Using a 3-D visualization method called X-ray crystallography, Song Tan, an associate professor of biochemistry and molecular biology at Penn State University, has built the first-ever image of a protein interacting with the nucleosome -- DNA packed tightly into space-saving bundles organized around a protein core. The research is expected to aid future investigations into diseases such as cancer.

As the genetic blueprint of life, DNA must be deciphered or "read," even when densely packed into nucleosomes. The nucleosome is therefore a key target of genetic processes in a cell and a focus of scientific investigations into how normal and diseased cells work. Previous studies at Penn State and other research institutions led to the discovery of chromatin enzymes -- proteins that act to turn specific genes on or off by binding to the nucleosome. Since the three-dimensional structure of the nucleosome was determined 13 years ago, scientists have wondered how chromatin enzymes recognize and act on the nucleosome to regulate gene expression and other processes in a cell. "We needed to visualize how these enzymes are able to read such a complicated structure as the nucleosome," Tan said.

To tackle this problem, Ravindra D. Makde, a postdoctoral member of the research team led by Tan, grew molecular crystals of the protein RCC1 (regulator of chromosome condensation, a protein critical for proper separation of chromosomes during cell division) bound to the nucleosome, and used X-ray crystallography to determine the atomic structure of the complex. "Our results showed that the RCC1 protein binds to opposite sides of the nucleosome -- similar to pedals positioned on a tricycle wheel." The structure provides atomic details of how an enzyme can recognize both DNA and components of the protein core of the nucleosome. Unexpectedly, the structure also showed how DNA can stretch as it wraps into a nucleosome. "These findings provide the basis for understanding how RCC1 and other chromatin enzymes interact with DNA as it is packaged into chromatin in our cells," Tan said.

The investigations were performed at the Penn State Center for Eukaryotic Gene Regulation, a multidisciplinary center focused on understanding the molecular basis for how genes are turned off and on in our bodies. "For years, the research community has been at an impasse," said Frank Pugh, Director of the center and the Willaman Professor in Molecular Biology at Penn State. "We were limited to only speculating how cellular proteins might bind the nucleosome. Now, with this structure, we are one step closer to understanding how cells read chromatin to regulate gene expression."

After nearly a decade of working to this goal, Tan and his team are excited to see the intricate interactions between a chromatin protein and the nucleosome. They are, however, even more enthusiastic about future prospects. "Our goal now is to determine the structures of other biologically and medically important chromatin enzymes bound to the nucleosome," said Tan. "We anticipate such studies will explain fundamental genetic processes and provide the basis for new therapeutics against human diseases such as cancer."

In addition to Tan and Makde, other researchers who contributed to this project include Joseph R. England, a Penn State undergraduate when he started this research and currently an MD/Ph.D. student at Temple University, and Hemant P. Yennawar, a senior research associate in the Department of Biochemistry and Molecular Biology at Penn State. This research was funded, in part, by the National Institutes of Health.

Fuente de la historia:

Materiales proporcionados por Penn State. Nota: El contenido puede editarse por estilo y longitud.


How to study epigenetics

​Epigenetic regulation occurs on many interacting levels, and it is essential to examine all of these levels in parallel to understand epigenetics contributions to biological processes. Tackling epigenetic studies from multiple angles with redundancy is key to ensuring accurate results.

Here we focus on five essential aspects of epigenetic regulation.

2. Histone modifications
Histones are proteins responsible for packaging DNA. A variety of mechanisms and modify histones, including acetylation, methylation, and phosphorylation, to control their interactions with DNA and therefore DNA structure and gene activation. Examining histone modifications, and the activity of enzymes that control these modifications can reveal mechanisms of epigenetic regulation and dysregulation at specific gene sites or across the genome at large​

3. ChIP guide
​Many different types of proteins bind to DNA to either directly or indirectly to regulate chromatin conformation and gene transcription. Identifying the presence or absence of such proteins in specific regions or across the genome can provide help build a complete picture of epigenetic regulation and dysregulation, as well as point to particular players and pathways involved. We can study these aspects of epigenetic regulation with chromatin immunoprecipitation (ChIP).​

4. Chromatin profiling using CUT&RUN and CUT&Tag
The Henikoff lab has recently developed two new chromatin profiling methods: Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease (CUT&RUN) and Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) which provide an exciting advance because they overcome many of the drawbacks of conventional and widely used chromatin immunoprecipitation (ChIP) methods.

5. DNA modifications
​​Throughout the DNA sequence, many chemical modifications exist. The most well-studied of these is 5-methylcytosine (5mC), a modification most commonly recognized as a stable, repressive regulator of gene expression. There is a large body of research that shows 5mC and other chemical modifications within DNA to have epigenetic roles in gene regulation. Identifying these marks and their function in biology is a fascinating area of epigenetics right now.

​​ 6. RNA modifications
Scientists are continually discovering new RNA modifications and new functions for existing modifications. Many RNA modifications thought only to exist in bacteria are being found in eukaryotic cells while others presumed only to exist on certain RNA, species such as tRNAs, are now being found to have crucial roles in mammalian mRNA translation. RNA modifications are very hot right now, and there is still a lot to explore in this field of research. ​​


Contenido

H2AX becomes phosphorylated on serine 139, then called γH2AX, as a reaction on DNA double-strand breaks (DSB). The kinases of the PI3-family (Ataxia telangiectasia mutated, ATR and DNA-PKcs) are responsible for this phosphorylation, especially ATM. The modification can happen accidentally during replication fork collapse or in the response to ionizing radiation but also during controlled physiological processes such as V(D)J recombination. γH2AX is a sensitive target for looking at DSBs in cells. The presence of γH2AX by itself, however, is not the evidence of the DSBs. [5] The role of the phosphorylated form of the histone in DNA repair is under discussion but it is known that because of the modification the DNA becomes less condensed, potentially allowing space for the recruitment of proteins necessary during repair of DSBs. Mutagenesis experiments have shown that the modification is necessary for the proper formation of ionizing radiation induced foci in response to double strand breaks, but is not required for the recruitment of proteins to the site of DSBs.

DNA damage response Edit

The histone variant H2AX constitutes about 2-25% of the H2A histones in mammalian chromatin. [6] When a double-strand break occurs in DNA, a sequence of events occurs in which H2AX is altered.

Very early after a double-strand break, a specific protein that interacts with and affects the architecture of chromatin is phosphorylated and then released from the chromatin. This protein, heterochromatin protein 1 (HP1)-beta (CBX1), is bound to histone H3 methylated on lysine 9 (H3K9me). Half-maximum release of HP1-beta from damaged DNA occurs within one second. [7] A dynamic alteration in chromatin structure is triggered by HP1-beta release. This alteration in chromatin structure promotes H2AX phosphorylation by ATM, ATR and DNA-PK, [8] allowing formation of γH2AX (H2AX phosphorylated on serine 139). γH2AX can be detected as soon as 20 seconds after irradiation of cells (with DNA double-strand break formation), and half maximum accumulation of γH2AX occurs in one minute. [6] Chromatin with phosphorylated γH2AX extends to about a million base pairs on each side of a DNA double-strand break. [6]

MDC1 (mediator of DNA damage checkpoint protein 1) then binds to γH2AX and the γH2AX/MDC1 complex then orchestrates further interactions in double-strand break repair. [9] The ubiquitin ligases RNF8 and RNF168 bind to the γH2AX/MDC1 complex, ubiquitylating other chromatin components. This allows the recruitment of BRCA1 and 53BP1 to the long, modified γH2AX/MDC1 chromatin. [9] Other proteins that stably assemble on the extensive γH2AX-modified chromatin are the MRN complex (a protein complex consisting of Mre11, Rad50 and Nbs1), RAD51 and the ATM kinase. [10] [11] Further DNA repair components, such as RAD52 and RAD54, rapidly and reversibly interact with the core components stably associated with γH2AX-modified chromatin. [11] The constitutive level of γH2AX expression in live cells, untreated by exogenous agents, likely represents DNA damage by endogenous oxidants generated during cellular respiration. [12]

In chromatin remodeling Edit

The packaging of eukaryotic DNA into chromatin presents a barrier to all DNA-based processes that require recruitment of enzymes to their sites of action. To allow DNA repair, the chromatin must be remodeled.

γH2AX, the phosphorylated form of H2AX, is involved in the steps leading to chromatin decondensation after DNA double-strand breaks. γH2AX does not, itself, cause chromatin decondensation, but within 30 seconds of ionizing radiation, RNF8 protein can be detected in association with γH2AX. [13] RNF8 mediates extensive chromatin decondensation, through its subsequent interaction with CHD4, [14] a component of the nucleosome remodeling and deacetylase complex NuRD.

An assay for γH2AX generally reflects the presence of double-strand breaks in DNA, though the assay may indicate other minor phenomena as well. [15] On the one hand, overwhelming evidence supports a strong, quantitative correlation between γH2AX foci formation and DNA double-strand break induction following ionizing radiation exposure, based on absolute yields and distributions induced per unit dose. [15] On the other hand, not only the formation of distinct γH2AX foci but also the induction of pan-nuclear γH2AX signals have been reported as a cellular reaction to various stressors other than ionizing radiation. [16] The γH2AX signal is always stronger at DNA double-strand breaks than in undamaged chromatin. [16] γH2AX in undamaged chromatin is thought to possibly be generated via direct phosphorylation of H2AX by activated kinases, most likely diffusing from DNA damage sites.


A vision of 3D chromatin organization

DNA is wrapped around nucleosomes to form chromatin chains that can undergo further compaction to fit into the small space of a nucleus. The way chromatin is packaged in the 3D nucleus is crucial to its function however, owing to the technical challenge of visualizing chromatin in intact cells, what compact chromatin looks like en vivo has been the subject of debate for decades. O'Shea and colleagues have now developed a new imaging technique — ChromEMT (chromatin electron microscopy tomography) — that enables the visualization of both the local polymer structure and the global 3D organization of chromatin in the nucleus of intact interphase and mitotic human cells, challenging textbook models of chromatin organization.

Chromatin structure has been difficult to visualize in the nucleus with existing electron microscopy (EM) techniques owing to the lack of a high contrast and selective electron-dense stain that enables it to be distinguished from other components. The authors developed a DNA-labelling system (ChromEM), which uses a fluorescent DNA-binding dye (DRAQ5) that, upon excitation, catalyses the deposition of diaminobenzidine polymers on the surface of DNA, thus making it visible by EM. ChromEM in combination with multi-tilt EM tomography, in which large 3D cell volumes are imaged and reconstructed at multiple angles, enabled the direct visualization and reconstruction of chromatin structure and interactions inside the nucleus.

“chromatin in interphase nuclei was found to be organized into flexible and disordered chains”

The chromatin in interphase nuclei was found to be organized into flexible and disordered chains that range from 5 nm to 24 nm in diameter. Interestingly, this organization was seen throughout the nucleus, encompassing euchromatic and heterochromatic regions alike. Moreover, chromatin in mitotic chromosomes had a similar disordered structure and diameter range. This finding challenges the long-standing model of chromatin compaction whereby DNA-wrapped nucleosomes progressively fold into discrete higher-order chromatin fibres and ultimately into mitotic chromosomes. This hierarchical model predicts the formation of 30 nm (although there has been some controversy around this) and 120 nm fibres in interphase nuclei and of more compact 300 nm and 700 nm fibres in mitotic chromosomes.

Instead, O'Shea and colleagues propose that the overall primary structure of chromatin does not change. Different levels of compaction — that generate 3D nuclear domains in which DNA is more or less concentrated and thereby accessible — are achieved by bending flexible fibres at various lengths and creating contacts between and within chains. In mitotic chromosomes, the 3D concentration density of chromatin and such interactions is higher. This model is more plausible when considering the rapid dynamics of chromatin condensation that occur during mitosis.

In addition to prompting the revision of textbooks, ChromEMT opens up the possibility of studying how chromatin structure is linked to its function.


Ver el vídeo: Organización de la cromatina y empaquetamiento del ADN: nucleosoma y solenoide - PARTE 2 (Noviembre 2022).