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¿Existen otros mecanismos de mutación además de la replicación imperfecta del ADN?

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Estaba leyendo http://www.askamathematician.com/2012/05/q-is-quantum-randomness-ever-large-enough-to-be-noticed/ y vi:

[…] La evolución de especies enteras puede cambiarse por un solo error en la replicación de una hebra de ADN (este es un mecanismo de mutación).

… Lo que implica que existen otros mecanismos de mutación. ¿Ellos?


Absolutamente. Las radiaciones ionizantes (rayos X, neutrones, electrones, iones pesados) y no ionizantes (UV), los productos químicos, etc. pueden inducir daños en el ADN, que luego se reparan imperfectamente. Por lo tanto, no se trata de una replicación imperfecta, sino también de una reparación de daños imperfectos.


La metilación del ADN sobre los dobletes de CpG puede causar mutación, ya que 5mC puede sufrir desaminación espontánea y convertirse en timina.


El concepto de sesgo de mutación aparece en varios contextos científicos, más comúnmente en estudios moleculares de la evolución, donde los sesgos de mutación pueden invocarse para explicar fenómenos como las diferencias sistemáticas en el uso de codones o la composición del genoma entre especies. [2] Los loci de repetición corta en tándem (STR) utilizados en la identificación forense pueden mostrar patrones sesgados de ganancia y pérdida de repeticiones. [3] En la investigación del cáncer, algunos tipos de tumores tienen firmas mutacionales distintivas que reflejan diferencias en las contribuciones de las vías mutacionales. Las firmas mutacionales han resultado útiles tanto en la detección como en el tratamiento.

Estudios recientes sobre la aparición de resistencias a fármacos antimicrobianos y anticancerígenos muestran que los sesgos de mutación son un determinante importante de la prevalencia de diferentes tipos de cepas resistentes o tumores. [4] [5] Por lo tanto, el conocimiento del sesgo de mutación se puede utilizar para diseñar terapias más resistentes a la evolución. [4]

Cuando se invoca el sesgo de mutación como posible causa de algún patrón de asimetría en la evolución, las hipótesis alternativas pueden incluir selección, conversión de genes sesgada y factores demográficos.

En el pasado, debido a la dificultad técnica de detectar mutaciones raras, la mayoría de los intentos de caracterizar el espectro de mutaciones se basaban en sistemas de genes informadores o en patrones de cambios presuntamente neutrales en pseudogenes. Más recientemente, ha habido un esfuerzo por utilizar el método MA (acumulación de mutaciones) y la secuenciación de alto rendimiento (por ejemplo, [6]).

Sesgo de transición-conversión Editar

Los nucleótidos de ADN canónicos incluyen 2 purinas (A y G) y 2 pirimidinas (T y C). En la literatura sobre evolución molecular, el término transición se utiliza para cambios de nucleótidos dentro de una clase química, y transversión para cambios de una clase química a otra. Cada nucleótido está sujeto a una transición (por ejemplo, T a C) y 2 transversiones (por ejemplo, T a A o T a G).

Debido a que un sitio (o una secuencia) está sujeto a dos veces más transversiones que transiciones, la tasa total de transversiones para una secuencia puede ser mayor incluso cuando la tasa de transiciones es mayor por ruta. En la literatura sobre evolución molecular, el sesgo de la tasa por ruta se denota típicamente por κ (kappa), de modo que, si la tasa de cada transversin es tu, la tasa de cada transición es κu. Entonces, la razón de tasa agregada (transiciones a transversiones) es R = (1 * κu) / (2 * u) = κ / 2. Por ejemplo, en levadura, κ

1.2, [7] por lo tanto, el sesgo agregado es R = 1,2 / 2 = 0,6, mientras que en E. coli, κ

En una variedad de organismos, las mutaciones de transición ocurren varias veces más frecuentemente de lo esperado bajo uniformidad. [8] El sesgo en los virus animales es a veces mucho más extremo, por ejemplo, 31 de las 34 mutaciones de nucleótidos en un estudio reciente sobre el VIH fueron transiciones. [9] Como se señaló anteriormente, el sesgo hacia las transiciones es débil en la levadura y parece estar ausente en el saltamontes. Podisma pedestris. [10]

Sesgo de mutación masculina Editar

Definición Editar

El sesgo de mutación masculina también se denomina "evolución impulsada por el hombre". La tasa de mutaciones de la línea germinal masculina es generalmente más alta que en las mujeres. [11] El fenómeno del sesgo de mutación masculina se ha observado en muchas especies. [12]

Origen Editar

En 1935, el científico británico-indio J.B.S. Haldane descubrió que en la hemofilia, el trastorno de la coagulación de la sangre que se origina en los cromosomas X se debe a la mutación de la línea germinal del padre. [13] Luego propuso la hipótesis de que la línea germinal masculina contribuye desmesuradamente más mutaciones a las generaciones sucesivas que en la mutación de la línea germinal femenina. [14]

Evidencia Editar

En 1987, Takashi Miyata et al. diseñó un enfoque para probar la hipótesis de Haldane. [15] Si α es la relación entre la tasa de mutación masculina y la tasa de mutación femenina, Y y X se indican como Y y la tasa de mutación de secuencia ligada a X, incluye que la relación entre la tasa de mutación de secuencia ligada a Y y la tasa de mutación ligada a X La tasa de mutación de secuencia es:

La relación Y / X media es 2,25 en primates superiores. [16] Mediante el uso de la ecuación, podríamos estimar la proporción entre las tasas de mutación masculina y femenina α ≈ 6. En algunos organismos con un tiempo de generación más corto que los humanos, la tasa de mutación en los machos también es mayor que en las hembras. Porque sus divisiones celulares en los machos no suelen ser tan grandes. La proporción del número de divisiones de células germinales de una generación a la siguiente en hombres y mujeres es menor que en humanos. [17] [18] [19]

También hay otras hipótesis que quieren explicar el sesgo de mutación masculina. Creen que puede deberse a una tasa de mutación en la secuencia ligada a Y más alta que la tasa de mutación de la secuencia ligada a X. El genoma de la línea germinal masculina está muy metilado y más propenso a mutar que las hembras. Los cromosomas X experimentan mutaciones de selección más purificadoras en los cromosomas hemicigóticos. [20] Para probar esta hipótesis, la gente usa aves para estudiar su tasa de mutación. [21] [22] A diferencia de los humanos, los machos de las aves son homogametos (WW) y las hembras son heterogametos (WZ). Descubrieron que la proporción de aves entre machos y hembras en las tasas de mutación varía de 4 a 7. [23] También demostró que el sesgo de mutación se debe principalmente a una mayor mutación de la línea germinal masculina que a la femenina.

Explicación Editar

Una mutación es una variación hereditaria en la información genética de una pequeña región de secuencias de ADN. Las mutaciones se pueden clasificar en mutaciones dependientes de la replicación y mutaciones independientes de la replicación. Por lo tanto, existen dos tipos de mecanismos de mutación para explicar el fenómeno del sesgo de mutación masculino.

Mecanismo dependiente de la replicación Editar

El número de divisiones de células germinales en las hembras es constante y mucho menor que en los machos. En las hembras, la mayoría de los ovocitos primarios se forman al nacer. El número de divisiones celulares ocurridas en la producción de un óvulo maduro es constante. En los machos, se requieren más divisiones celulares durante el proceso de espermatogénesis. No solo eso, el ciclo de la espermatogénesis es interminable. Las espermatogonias continuarán dividiéndose durante toda la vida productiva del macho. El número de divisiones de células de la línea germinal masculina en la producción no solo es más alto que las divisiones de células de la línea germinal femenina, sino que también aumenta a medida que aumenta la edad del macho. [24]

Uno podría esperar que la tasa de mutación masculina sea similar a la tasa de divisiones de células germinales masculinas. Pero solo unas pocas especies se ajustan a la estimación de la tasa de mutación masculina. [19] Incluso en estas especies, la proporción de la tasa de mutación de hombre a mujer es más baja que la proporción de hombre a mujer en el número de divisiones de células de la línea germinal. [25]

Mecanismo independiente de la replicación Editar

Las estimaciones sesgadas de la tasa de tasa de mutación de hombre a mujer introducen el otro mecanismo importante que influye en gran medida en el sesgo de mutación masculina. Las mutaciones en los sitios CpG dan como resultado una transición de C a T. [26] Estas sustituciones de nucleótidos C a T ocurren de 10 a 50 veces más rápido que en los sitios de reposo en las secuencias de ADN, especialmente probablemente aparecieron en las líneas germinales masculinas y femeninas. [27] La ​​mutación CpG apenas expresa sesgos sexuales debido a la independencia de la replicación, y efectivamente reduce la tasa de mutación de hombre a mujer. [28] Además, las mutaciones dependientes del vecino también pueden causar sesgos en la tasa de mutación y pueden no tener relevancia para la replicación del ADN. Por ejemplo, si las mutaciones originadas por el efecto de mutágenos muestran un sesgo de mutación masculino débil, como la exposición a la luz ultravioleta. [29]

En resumen, el sesgo de mutación masculina se debe principalmente a mutaciones dependientes de la replicación ocurridas en la línea germinal masculina más que en la línea germinal femenina, pero las mutaciones independientes de la replicación también contribuyen a aliviar la diferencia.

Sesgo GC-AT Editar

Un sesgo de GC-AT es un sesgo con un efecto neto sobre el contenido de GC. Por ejemplo, si los sitios G y C son simplemente más mutables que los sitios A y T, en igualdad de condiciones, esto resultaría en una presión neta a la baja sobre el contenido de GC.

Los estudios de acumulación de mutaciones en levaduras han indicado un sesgo hacia la AT de aproximadamente el doble. [7]

Una idea común en la literatura sobre evolución molecular es que el uso de codones y la composición del genoma reflejan los efectos del sesgo de mutación, por ejemplo, el uso de codones se ha tratado con un modelo de mutación-selección-deriva que combina sesgos de mutación, selección de codones preferidos en la traducción y deriva . [30] En la medida en que el sesgo de mutación prevalezca en este modelo, el sesgo de mutación hacia GC es responsable de los genomas con alto contenido de GC, y del mismo modo, el sesgo opuesto es responsable de los genomas con bajo contenido de GC.

A partir de la década de 1990, quedó claro que la conversión génica sesgada por GC era un factor importante, antes no anticipado, que afectaba el contenido de GC en organismos diploides como los mamíferos. [31]

De manera similar, aunque puede darse el caso de que la composición del genoma bacteriano refleje fuertemente los sesgos de GC y AT, no se ha demostrado que existan los sesgos mutacionales propuestos. De hecho, Hershberg y Petrov [2] sugieren que la mutación en la mayoría de los genomas bacterianos está sesgada hacia AT, incluso cuando el genoma no es rico en AT. Por lo tanto, no se ha establecido la importancia de los sesgos de GC-AT en la contabilidad de los efectos de composición y es un área de investigación en curso.


3 fases del proceso de replicación del ADN (con diagrama)

Lea este artículo para conocer las tres fases del proceso de replicación del ADN.

Las tres fases del proceso de replicación son: (1) Inicio (2) Alargamiento y (3) Terminación.

La replicación en procariotas y eucariotas ocurre por mecanismos muy similares y, por lo tanto, la mayor parte de la información presentada aquí para la replicación bacteriana también se aplica a las células eucariotas.

Está compuesto por tres fases que se enumeran a continuación:

Implica el reconocimiento de las posiciones en una molécula de ADN donde comenzará la replicación.

Incluye los eventos que ocurren en la bifurcación de replicación, donde se copian los polinucleótidos originales.

Se comprende menos. Ocurre cuando la molécula madre se ha replicado por completo.

(a) Iniciación:

En una célula, la replicación del ADN comienza en lugares específicos del genoma, llamados & # 8220origins & # 8221. En el caso de E. coli, el origen de la replicación es una secuencia de aproximadamente 245 pares de bases (pb) denominada oriC. Los orígenes contienen secuencias de ADN reconocidas por proteínas iniciadoras de la replicación (por ejemplo, DnaA en E. coli y el Complejo de reconocimiento de origen en la levadura), estas proteínas se unen para iniciar el proceso de replicación. Las proteínas iniciadoras reclutan otras proteínas para separar las dos cadenas e iniciar horquillas de replicación.

El desenrollado del ADN en el origen y la síntesis de nuevas hebras forman una bifurcación de replicación. La bifurcación de replicación es una estructura que se forma cuando se replica el ADN. Se crea mediante la acción de la helicasa, que rompe los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las dos cadenas de ADN. La estructura resultante tiene dos & # 8220 puntas & # 8221 ramificadas, cada una formada por una sola hebra de ADN.

En las bacterias, que tienen un solo origen de replicación en su cromosoma circular, este proceso eventualmente crea una & # 8220theta estructura & # 8221 (que se asemeja a la letra griega theta: 8). Por el contrario, los eucariotas tienen cromosomas lineales más largos e inician la replicación en múltiples orígenes y cuyas bifurcaciones de replicación progresan a distancias más cortas. Por ejemplo, la levadura tiene aproximadamente 322 orígenes, lo que corresponde a 1 origen por cada 36 kb de ADN, y los seres humanos tienen unos 20.000 orígenes, o 1 origen por cada 150 kb de ADN. Una vez iniciada, dos horquillas de replicación pueden emerger del origen y progresar en dirección opuesta a lo largo del ADN. Por tanto, la replicación es bidireccional con la mayoría de los genomas (fig. 3.4).

Inicio de la replicación del ADN en microorganismos (E. coli):

Sabemos mucho más sobre la síntesis de ADN en procariotas que en eucariotas. Como hemos comentado, el oriC de E. coli abarca 245 pb de ADN. El análisis de secuencia de este segmento muestra que contiene dos motivos repetidos cortos, uno de nueve nucleótidos y el otro de 13 nucleótidos. Las cinco copias del motivo de repetición de nueve nucleótidos se presentan dispersas a lo largo de oriC.

Estas regiones son el sitio de unión de una proteína llamada DnaA. Como hay cinco copias de las secuencias de unión, podría imaginarse que cinco copias de DnaA se unen al origen, pero de hecho las proteínas de DnaA unidas cooperan con moléculas no unidas hasta que unas 30 copias se asocian con el origen. La unión ocurre solo cuando el ADN está superenrollado negativamente, como es la situación normal para el cromosoma de E. coli.

El resultado de la unión de DnaA es que la doble hélice se abre (se funde) dentro de la matriz en tándem de tres repeticiones de 13 nucleótidos ricas en AT ubicadas en un extremo de la secuencia oriC. Se desconoce el mecanismo exacto, pero el DnaA no parece poseer la actividad enzimática necesaria para romper los pares de bases y, por lo tanto, se supone que la hélice se funde por las tensiones de torsión introducidas por la unión de las proteínas DnaA.

Un modelo atractivo imagina que las proteínas DnaA forman una estructura en forma de barril alrededor de la cual se enrolla la hélice. La fusión de la hélice es promovida por HU, la más abundante de las proteínas de empaquetamiento de ADN de E. coli. La fusión de la hélice inicia una serie de eventos que construyen una nueva bifurcación de replicación en cada extremo de la región abierta. El primer paso es la unión de un complejo de cebado previo en cada una de estas dos posiciones.

Cada complejo de pre-cebado inicialmente comprende 12 proteínas, seis copias de DnaB y seis copias de DnaC, pero el DnaC tiene un papel transitorio y se libera del complejo poco después de su formación, probablemente su función sea simplemente ayudar a la unión de DnaB. .

Esta última es una helicasa, una enzima que puede romper los pares de bases. DnaB comienza a aumentar la región monocatenaria dentro del origen, lo que permite a las enzimas involucradas en la fase de elongación de la replicación en E. coli a medida que las horquillas de replicación comienzan a alejarse del origen y comienza la copia del ADN.

Inicio de la replicación del ADN en levadura:

Los orígenes identificados en la levadura se denominan secuencias de replicación autónoma o ARS. El origen de la levadura atípica es más corto que el E. coli oriC, y suele tener menos de 200 pb de longitud. En él se reconocen cuatro subdominios.

Dos de estos subdominios A y B1 & # 8211 forman la secuencia de reconocimiento de origen, un tramo de unos 40 pb en total que es el sitio de unión para el complejo de reconocimiento de origen (ORC), un conjunto de seis proteínas que se unen al origen.

Los ORC se han descrito como versiones de levadura de las proteínas DnaA de E. coli, pero esta interpretación probablemente no sea estrictamente correcta porque los ORC parecen permanecer unidos a los orígenes de la levadura durante todo el ciclo celular. Más bien, estas son proteínas iniciadoras genuinas. Es más probable que los ORC estén involucrados en la regulación de la replicación del genoma, actuando como mediadores entre los orígenes de replicación y las señales reguladoras que coordinan el inicio de la replicación del ADN con el ciclo celular.

Hay secuencias similares en levaduras a las de oriC de E. coli. Esto nos lleva a las otras dos secuencias conservadas en el origen típico de levadura, los subdominios B2 y B3. Nuestro conocimiento actual sugiere que estos dos subdominios funcionan de manera similar al origen de E. coli. El subdominio B2 parece corresponder a la matriz de repeticiones de 13 nucleótidos del origen de E. coli, siendo la posición en la que las dos hebras de la hélice se separan por primera vez.

Esta fusión es inducida por el estrés de torsión introducido por la unión de una proteína de unión al ADN, el factor de unión a ARS 1 (ABF1), que se une al subdominio B3. Como en E. coli, la fusión de la hélice dentro de un origen de replicación de levadura es seguida por la unión de la helicasa y otras enzimas de replicación al ADN, completando el proceso de iniciación y permitiendo que las horquillas de replicación comiencen su progreso a lo largo del ADN. Los orígenes de las replicaciones en eucariotas superiores no se han entendido mucho.

(b) Alargamiento:

Una vez que se ha iniciado la replicación, las horquillas de replicación avanzan a lo largo del ADN y participan en la síntesis de una nueva hebra. A nivel químico, la síntesis de ADN dependiente de la plantilla es muy similar a la síntesis de ARN dependiente de la plantilla que se produce durante la transcripción, pero los dos procesos son bastante diferentes.

1. La síntesis de hebras discontinuas y el problema del cebado: durante la replicación del ADN, deben copiarse ambas hebras de la doble hélice. Sin embargo, las enzimas ADN polimerasa solo pueden sintetizar ADN en la dirección 5 & # 8242 3 & # 8242. Esto significa que una hebra de la doble hélice principal, llamada hebra principal, se puede copiar de manera continua, pero la replicación de la hebra retrasada debe realizarse de forma discontinua, lo que da como resultado una serie de segmentos cortos que deben ligarse entre sí para producir la hebra hija intacta.

Estos segmentos cortos de polinucleótidos se denominan fragmentos de Okazaki. Estos fragmentos se aislaron por primera vez de la bacteria E. coli en 1969. Los fragmentos de Okazaki tienen una longitud de 1000-2000 nucleótidos, pero en eucariotas los fragmentos equivalentes parecen ser mucho más cortos, quizás menos de 200 nucleótidos de longitud.

2. La otra característica de la replicación del ADN es que la ADN polimerasa no puede iniciar la síntesis de ADN en una molécula que es completamente monocatenaria: debe haber una región monocatenaria corta para proporcionar un extremo 3 & # 8242 en el que la enzima pueda agregar nuevos nucleótidos. Los nucleótidos se añaden a una velocidad de 50.000 bases por minuto. La elección del nucleótido está determinada por la naturaleza complementaria.

A este ritmo, las posibilidades de error son de uno en mil pares de bases replicados. Sin embargo, la tasa real es bastante baja (uno en mil millones). Esto equivale a aproximadamente un error por genoma por mil ciclos de replicación bacteriana. Este error se corrige aún más mediante la corrección de pruebas (Eliminación del nucleótido de desajuste por la ADN polimerasa III). Esto significa que se necesitan cebadores, uno para iniciar la síntesis de la hebra complementaria en el polinucleótido principal y uno para cada segmento de ADN discontinuo sintetizado en la hebra retrasada.

Como la ADN polimerasa no puede lidiar con una plantilla completamente monocatenaria, las ARN polimerasas no tienen ninguna dificultad a este respecto, por lo que los cebadores para la replicación del ADN están hechos de ARN. En las bacterias, los cebadores se sintetizan mediante primasa, una ARN polimerasa especial con cada cebador de 4-15 nucleótidos de longitud y la mayoría comienza con la secuencia 5 & # 8242-AG-3 & # 8242. Una vez que se ha completado el cebador, la ADN polimerasa III continúa la síntesis de la hebra.

En eucariotas, la situación es más compleja porque la primasa está estrechamente unida a la ADN polimerasa ay coopera con esta enzima en la síntesis de los primeros nucleótidos de un nuevo polinucleótido. Esta primasa sintetiza un cebador de ARN de 8-12 nucleótidos y luego se entrega a la ADN polimerasa a, que extiende el cebador de ARN agregando aproximadamente 20 nucleótidos de ADN. Después de completar el cebador de ADN-ARN, la principal enzima replicativa, la ADN polimerasa 5, continúa la síntesis de ADN.

El cebado debe ocurrir solo una vez en la hebra principal, dentro del origen de replicación, porque una vez cebado, la copia de la hebra principal se sintetiza continuamente hasta que se completa la replicación. En la hebra rezagada, el cebado es un proceso repetido que debe ocurrir cada vez que se inicia un nuevo fragmento de Okazaki.

3. Alargamiento de horquilla de replicación: al igual que con la unión de DnaB helicasa, seguida de la extensión de la región fundida del origen de replicación, finaliza la fase de iniciación. Después de que la helicasa se ha unido al origen para formar el complejo de pre-cebado, la primasa está involucrada, lo que da como resultado el primosoma, que inicia la replicación de la cadena principal. Lo hace sintetizando el cebador de ARN que la ADN polimerasa III necesita para comenzar a copiar la plantilla. Se conoce más de una helicasa y esta enzima está involucrada en varios procesos, como la transcripción, recombinación además de replicaciones.

4. Las hebras complementarias de un ADN tienden a convertirse en dúplex. Durante el proceso de replicación, se evita que estos ADN monocatenarios pegajosos se conviertan en dúplex mediante proteínas especiales denominadas proteínas de unión monocatenarias (SSB). Una vez que se añaden 1000-2000 nucleótidos en la cadena principal, comienza la síntesis de la cadena rezagada o fragmentos de Okazaki. Esto también requiere un cebador de ARN y una ADN polimerasa III similar a la cadena principal.

5. La ADN polimerasa I participa en la eliminación del cebador de ARN de los fragmentos de Okazaki, que tiene actividad exonucleasa 5 & # 8242 → 3 & # 8242. El espacio creado por el cebador se rellena añadiendo nucleótidos en el extremo 3 & # 8242. La muesca entre dos fragmentos de Okazaki está sellada por ADN ligasa mediante la formación de enlaces fosfodiéster (Fig. 3.5).

(c) Terminación:

Debido a que las bacterias tienen cromosomas circulares, la terminación de la replicación ocurre cuando las dos horquillas de replicación se encuentran en el extremo opuesto del cromosoma parental. E. coli regula este proceso mediante el uso de secuencias de terminación que, cuando se unen a la proteína Tus, permiten que solo pase una dirección de la horquilla de replicación.

Como resultado, las horquillas de replicación están obligadas a encontrarse siempre dentro de la región de terminación del cromosoma. Los eucariotas inician la replicación del ADN en múltiples puntos del cromosoma, por lo que las horquillas de replicación se encuentran y terminan en muchos puntos del cromosoma; no se sabe que estén regulados de ninguna manera en particular.


Presentado

Reflejos

A lo largo de nuestra vida, desde el óvulo fertilizado hasta el adulto, nuestras células deben dividirse muchas veces. Para hacer eso, las células deben copiar todo nuestro genoma de aproximadamente tres mil millones de pares de bases cada vez que se dividen. Las proteínas especiales se unen para formar una maquinaria molecular llamada replisoma, que desenrolla la doble hélice de ADN en una célula, exponiendo las dos hebras y sintetizando una nueva secuencia complementaria de ADN para cada una.

“Imagínese atravesar miles de millones de estas pequeñas escaleras en solo unas pocas horas”, dice Marcus B. Smolka, Biología Molecular y Genética. “El replisome tiene que hacer una copia perfecta. Si comete un error, se producen mutaciones o roturas cromosómicas, y ese es el sello distintivo del cáncer ".

ATR: supervisión del proceso de replicación

Muchas de las mutaciones que conducen al cáncer se encuentran en genes que producen las proteínas necesarias para la replicación y el mantenimiento del genoma. Smolka y su laboratorio estudian una clase de proteínas, conocidas como quinasas, con funciones importantes en la replicación del genoma. Han encontrado un área de investigación particularmente fructífera en la quinasa ATR, la proteína maestra que monitorea el proceso de replicación.

“Si algo sale mal, ATR puede detectarlo y llegará a la región donde está el problema”, explica Smolka. ATR es una enzima, por lo que puede modificar otras proteínas agregándoles un fosfato. Esta fosforilación inicia una cascada de señales, un circuito de eventos que orquesta la detección y reparación del daño antes de que la célula se divida en dos.

“Antes de que empezáramos a analizar esto, la gente pensaba que ATR funcionaba en una vía lineal en la que se enfocaría en una proteína, y esa proteína se enfocaría en otra proteína”, dice Smolka. “Nuestro trabajo ha cambiado el paradigma de cómo se ve la acción de esta quinasa. No es una acción simple, es realmente una red de eventos. ATR fosforila cientos de proteínas diferentes ".

ATR y células cancerosas

Comprender el papel fundamental de ATR en la replicación es importante para la investigación del cáncer porque las células cancerosas dependen de ATR mucho más que las células normales. “Las células cancerosas proliferan mucho más rápido que las células normales, lo que causa estrés en la maquinaria de replicación y más rotura cromosómica, por lo que se vuelven adictas a ATR”, dice Smolka. “Lo necesitan para reparar el daño. Si ATR no está allí, morirán después de un ciclo de replicación. La replicación en las células normales tiende a ser mucho más regulada y robusta, por lo que si inhibe un poco la ATR, las células normales aún estarán bien ".

La investigación de Smolka arroja luz sobre el trabajo realizado por otros miembros de la comunidad científica que se centran en crear fármacos que inhiban la ATR. Estos medicamentos se encuentran actualmente en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer. "Hemos estudiado la acción de los inhibidores de ATR y son muy poderosos", dice Smolka. “El problema es que los investigadores que trabajan en la creación de estos medicamentos pueden ver sus efectos (las células cancerosas mueren) pero no comprenden cómo los medicamentos hacen lo que hacen. Nuestro trabajo está revelando qué procesos están siendo afectados por los inhibidores ”.

Técnicas para capturar ATR en acción

Parte de la investigación básica de Smolka se centra en la acción de las quinasas en la levadura, que es un sistema simple que tiene aspectos análogos a la biología humana. “Trabajamos en levaduras y también en sistemas de mamíferos y líneas celulares humanas”, dice. “Pero es mucho más fácil mapear la acción de estas quinasas y llegar a una comprensión fundamental de lo que hacen en la levadura. Eso nos da un lugar poderoso desde el que abordar la comprensión de las quinasas humanas ".

Smolka tuvo que desarrollar técnicas especiales para capturar la acción de ATR y otras quinasas. Para identificar la acción de ATR en una célula, su laboratorio utiliza espectrometría de masas, que identifica la constitución química de una sustancia al separar los iones de acuerdo con sus diferentes masas y cargas.

“Podemos romper células abiertas y extraer trozos que componen los miles y miles de proteínas”, dice. “Para averiguar qué está haciendo ATR en las células, podemos analizar estos fragmentos de proteínas y definir cuáles tienen el fosfato particular utilizado por ATR para modificar un objetivo. De esa manera podemos mapear con precisión dónde está el fosfato, y podemos hacerlo de manera cuantitativa. Eso nos permite determinar exactamente a qué proteínas se dirige ATR ".

Descubrimientos clave para comprender el cáncer

Una pregunta clave que Smolka y sus colegas quieren responder se centra en cómo ATR mantiene la integridad del genoma. En 2017 descubrieron que la quinasa promueve la reparación de roturas cromosómicas en el ADN. La quinasa controla las proteínas que llevan a cabo la reparación mediante el proceso de recombinación homóloga, donde se intercambian secuencias de nucleótidos entre moléculas de ADN similares o idénticas. “Ese fue un hallazgo muy emocionante”, dice Smolka. "Creo que nos permitirá definir el mecanismo de funcionamiento de ATR para evitar la rotura de los cromosomas".

Los investigadores hicieron otro descubrimiento inesperado que también puede cambiar las reglas del juego para comprender el cáncer. Descubrieron que ATR puede actuar de formas muy diferentes, dependiendo de cómo se active. Cuando el ATR se activa en la ruptura del ADN de una célula, promueve la reparación del ADN cuando se activa en otras ubicaciones de la célula, no promueve la reparación, sino que permite que las células se repliquen más rápido.

“Esta era una nueva función para ATR que no conocíamos antes. Podría ayudar a explicar por qué las células cancerosas son adictas al ATR ".

"Esta era una nueva función para ATR que no conocíamos antes", dice Smolka. “Podría ayudar a explicar por qué las células cancerosas son adictas a ATR. Esta quinasa no solo previene la rotura cromosómica, sino que permite que el replisoma pase más rápido por el ADN para que las células se repliquen más rápidamente. Estamos tratando de averiguar en este momento cómo lo hace ".

Terapias eficaces contra el cáncer: posibles mediante el mapeo de la acción de las quinasas

ATR es solo una de las muchas quinasas que estudia el laboratorio Smolka. Los investigadores están dirigiendo su atención a varios otros miembros de las familias VRK y TLK que también parecen afectar la replicación de las células cancerosas. También continúan expandiéndose y mejorando la tecnología que utilizan para mapear la acción de las quinasas. Han comenzado a utilizar un sistema de edición genética conocido como CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas) que utiliza la nucleasa Cas9 para apuntar a secuencias de ADN específicas. "Estamos creando líneas de células humanas en las que podemos eliminar quinasas específicas", explica Smolka. “Entonces podemos ver qué conjunto de fosfatos objetivo también desaparecen. De esa manera podemos mapear lo que hace cada quinasa ".

Cuanto más comprendan los científicos acerca de los mecanismos detrás de cómo funcionan las quinasas, más aplicaciones para la terapia del cáncer deberían resultar. Para comprender cómo las células se replican y mantienen su estabilidad, y por qué las células cancerosas son tan buenas en eso, la acción de las quinasas debe entenderse desde una perspectiva más integrada. “Hay muchas preguntas sobre biología que aún no tienen respuesta”, dice Smolka. “Creo que existe un enorme potencial para incorporar nueva tecnología para comprender estos complicados sistemas desde una perspectiva holística y, al mismo tiempo, llevar la investigación a una visión reduccionista y señalar un evento específico. Nuestro laboratorio tiene la capacidad poco común de hacer ambas cosas ".


Introducción

Los agentes infecciosos pueden evolucionar rápidamente en respuesta a las intervenciones de salud [1]. Aquí, nos preguntamos si la adaptación del patógeno a los huéspedes vacunados puede resultar en la evolución de patógenos más virulentos (definidos aquí como aquellos que causan una mayor o más rápida mortalidad en los huéspedes no vacunados).

La vacunación podría provocar la evolución de patógenos más virulentos de la siguiente manera. Por lo general, se asume que la fuerza principal que impide la aparición evolutiva de cepas más virulentas es que matan a sus huéspedes y, por lo tanto, truncan sus propios períodos infecciosos. Si es así, mantener vivos a los huéspedes con vacunas que reducen la enfermedad pero no previenen la infección, la replicación y la transmisión (las llamadas vacunas “imperfectas”) podría permitir la circulación de cepas más virulentas. La selección natural incluso favorecerá su circulación si las cepas virulentas tienen una mayor transmisión en ausencia de muerte del huésped o son más capaces de vencer la inmunidad del huésped. Por lo tanto, las vacunas que salvan vidas tienen el potencial de aumentar la virulencia media de la enfermedad de una población de patógenos (según lo analizado en huéspedes no vacunados) [2-4].

La plausibilidad de esta idea (en lo sucesivo denominada “hipótesis de la vacuna imperfecta”) se ha confirmado con modelos matemáticos [2,5–9]. La eficacia y el modo de acción son fundamentales. Si la vacuna se esteriliza, de modo que se detiene la transmisión, no puede ocurrir evolución. Pero si no es esterilizante, de modo que los patógenos adquiridos naturalmente puedan transmitirse de individuos inmunizados (lo que de aquí en adelante llamaremos una vacuna "con fugas"), las cepas virulentas podrán circular en situaciones en las que la selección natural las habría eliminado una vez [2 ]. Por lo tanto, las vacunas contra las enfermedades (las que reducen la replicación o la patogenicidad en el huésped) tienen el potencial de generar una evolución dañina para el bienestar humano y animal que las vacunas que bloquean la transmisión o la infección no lo hacen [2-9]. Note that the possibility of vaccine-driven virulence evolution is conceptually distinct from vaccine-driven epitope evolution (antigenic escape), in which variants of target antigens evolve because they enable pathogens that are otherwise less fit to evade vaccine-induced immunity. The evolution of escape variants has been frequently observed [4,10].

The imperfect-vaccine hypothesis attracted controversy [11–14], not least because human vaccines have apparently not caused an increase in the virulence of their target pathogens. But most human vaccines are sterilizing (transmission-blocking) or not in widespread use or only recently introduced [4]. Moreover, unambiguous comparisons of strain virulence and the impact of vaccination on transmission require experimental infections in the natural host—clearly impossible for human diseases. The situation is different for veterinary infections. Here, we report experiments with Marek’s disease virus (MDV), a highly contagious oncogenic herpesvirus that costs the global poultry industry more than $US2 billion annually [15]. We test a key prediction of the imperfect-vaccine hypothesis: that vaccination will elevate the fitness of highly virulent strains above that of less virulent strains.

Chickens become infected with MDV by inhalation of dust contaminated with virus shed from the feather follicles of infected birds. In a contaminated poultry house, chicks are infected soon after hatching and remain infectious for life [16]. The virus can remain infectious in poultry dust for many months [17,18]. As originally described, Marek’s disease (MD) was a paralysis of older birds, but by the 1950s, “acute MD” characterised by lymphomas in multiple organs in younger birds was occurring. This became the dominant form of MD, with increasing virulence, characterised by more severe lymphomas and mortality at increasingly early ages and, under some circumstances, paralysis and death in the first weeks of life, well before lymphoma formation [15,19].

MDV has been evolving in poultry immunized with leaky anti-disease vaccines since the introduction of the first vaccines in 1970 [15,19–24]. All MD vaccines are live viruses administered to 18-day-old embryos or immediately after hatch, and vaccinated birds can become infected and shed wild-type virus [25–28]. Wild-type MD viruses are so-called serotype 1 viruses. First-generation vaccines include a serotype 3 herpesvirus of turkeys called HVT second-generation vaccines are a combination of HVT and SB-1, a serotype 2 isolate. Third-generation vaccines are based on an attenuated serotype-1 virus isolate CVI998, the so-called Rispens vaccine [15,19–24].


Mutations due to Transposable Elements

Transposable elements (TEs) también se conocen como elementos genéticos móviles, or more informally as genes saltarines. They are present throughout the chromosomes of almost all organisms. These DNA sequences have a unique ability to be cut or copied from their original location and inserted into new locations in the genome. This is called transposition. These insert locations are not entirely random, but TEs can, in principle, be inserted into almost any region of the genome. TEs can therefore insert into genes, disrupting its function and causing a mutation. Researchers have developed methods of artificially increasing the rate of transposition, which makes some TEs a useful type of mutagen. However, the biological importance of TEs extends far beyond their use in mutant screening. TEs are also important causes of disease and phenotypic instability, and they are a major mutational force in evolution.

There are two major classes of TEs in eukaryotes (Figure (PageIndex<3>)).

  • Class I elements include retrotransposons these transpose by means of an RNA intermediate. The TE transcript is reverse transcribed into DNA before being inserted elsewhere in the genome through the action of enzymes such as integrase.
  • Clase II elements are known also as transposones. They do not use reverse transcriptase or an RNA intermediate for transposition. Instead, they use an enzyme called transposasa to cut DNA from the original location and then this excised dsDNA fragment is inserted into a new location. Note that the name transposon is sometimes used incorrectly to refer to any type of TEs, but in this book we use transposon to refer specifically to Class II elements.

TEs are relatively short DNA sequences (100-10,000 bp), and encode no more than a few proteins (if any). Normally, the protein-coding genes within a TE are all related to the TE&rsquos own transposition functions. These proteins may include la transcriptasa inversa, transposase, and integrase. However, some TEs (of either Class I or II) do not encode any proteins at all. Estas non-autonomous TEs can only transpose if they are supplied with enzymes produced by other, autónomo TEs located elsewhere in the genome. In all cases, enzymes for transposition recognize conserved nucleotide sequences within the TE, which dictate where the enzymes begin cutting or copying.

The human genome consists of nearly 45% TEs, the vast majority of which are families of Class I elements called LINEs y SINEs. The short, Alu type of SINE occurs in more than one million copies in the human genome (compare this to the approximately 21,000, non-TE, protein-coding genes in humans). Indeed, TEs make up a significant portion of the genomes of almost all eukaryotes. Class I elements, which usually transpose via an RNA copy-and-paste mechanism, tend to be more abundant than Class II elements, which mostly use a cut-and-paste mecanismo. But even the cut-paste mechanism can lead to an increase in TE copy number. For example, if the site vacated by an excised transposon is repaired with a DNA template from a homologous chromosome that itself contains a copy of a transposon, then the total number of transposons in the genome will increase.

Besides greatly expanding the overall DNA content of genomes, TEs contribute to genome evolution in many other ways. As already mentioned, they may disrupt gene function by insertion into a gene&rsquos coding region or regulatory region. More interestingly adjacent regions of chromosomal DNA are sometimes mistakenly transposed along with the TE this can lead to gene duplication. The duplicated genes are then free to evolve independently, leading in some cases to the development of new functions. The breakage of strands by TE excision and integration can disrupt genes, and can lead to chromosome rearrangement or deletion if errors are made during strand rejoining. Furthermore, having so many similar TE sequences distributed throughout a chromosome sometimes allows mispairing of regions of homologous chromosomes at meiosis, which can cause unequal crossing-over, resulting in deletion or duplication of large segments of chromosomes. Thus, TEs are a potentially important evolutionary force, and may not be included as merely &ldquojunk DNA&rdquo, as they once were.


What is a Mutation

A mutation is a heritable change in the nucleotide sequence of the genome of a particular organism. It can occur during DNA replication or due to external mutagens. DNA repair mechanisms are responsible for correcting both types of errors. However, most mutations with a positive effect are inheritable. Here, the effect of the mutation can be either beneficial or harmful. Beneficial mutations exert phenotypes that make the organism more suitable to the environment. Also, many mutations are harmful since they disrupt the normal function of genes, causing diseases like cancers.

Figure 1: A Mutation Causes Yellow Color in Red Tulip

Furthermore, the more common form of classification of mutations is by the effect of the mutation on the structure of the nucleotide sequence. Here, mutations with a minute effect are small-scale mutations (point mutations) including insertions, deletions, and nucleotide substitutions. Meanwhile, mutations with a considerable effect on the structure of the chromosomes are large-scale mutations including gene duplications, chromosomal rearrangements like translocations and inversions, and loss of heterozygosity.

Figure 2: Point Mutations

Also, mutations can be classified based on their effect on the function of the gene. These mutations are gain-of-function mutations, loss-of-function mutations, dominant negative mutations, lethal mutations, etc. Based on the effect on fitness, there are three types of mutations they are the harmful mutations, beneficial mutations, and neutral mutations. By the impact of the protein sequence, frameshift mutations can be classified as synonymous mutations, missense mutations, and nonsense mutations.


The Hallmarks of Cancer: 7 – Genome Instability and Mutation

All cancers share ten underlying principles, also known as the Hallmarks of Cancer. You can read about the first six here. The seventh is defined as genome instability and mutation.

All cancers share ten underlying principles, also known as the Hallmarks of Cancer . You can read about the first six here . The seventh is defined as genome instability and mutation.

Cancer Cells Evolve

Not all cancer cells are equal. They vary, they compete, and the fittest survive to pass on their genes to daughter cells, which continue to vary, compete and survive. If this sounds familiar, it's because it is cancer cells evolve. Within the complex ecosystem that is our body, cancer cells mutate and face selective pressures as they change and adapt to their environment. The evolving cancer cell has to out-compete the normal cells surrounding it, evade attack by immune cells, escape the apoptotic machinery which causes cells to self-destruct, corrupt and co-opt otherwise loyal surrounding cells and migrate to distant parts of the body.

Sometimes, when the sequences of nucleotides called genes mutate, those mutations are not corrected. It doesn’t happen often (each nucleotide has only a one-in-a-hundred-billion to a one-in-a-billion chance of being miscopied), but each time a cell divides and passes a copy of its DNA to its daughter cell, the chance of error increases. An average gene comprises about 1,700 nucleotides. Over one hundred million billion cell divisions occur over the average human lifetime. The average gene is thus home to somewhere between one hundred million and ten billion mutations, spread over its copies in each cell. If just one of those mutations increases the evolutionary fitness of its cell, then that mutation will expand into many cells, increasing the probability that subsequent mutations will build on the first.

We know that cancer occurs because we can see the stepwise accumulation of mutations. If a cancer cell acquires a mutation that enables it to grow faster, or survive longer and produce more offspring than the surrounding cells without that mutation, then that cancer cell has a selective advantage. Its descendants will be fitter they will outgrow and dominate the local tissue environment. These principles of population genetics and evolutionary biology describe the process of tumor formation and are key to understanding how cancer cells can become resistant to drug treatment they evolucionar that resistance.

Mutations 101

Mutations enable cancer cells to embark on their frenzied growth within our bodies. But what are mutations, and how do they happen? In genetics, a mutation is a change in an organism’s DNA sequence. The nucleotide letters A, T, C and G that make up our DNA can be deleted or substituted, and single or double stranded breaks can occur in the DNA molecule. Complete sections of our DNA can also be deleted or swapped with other sections. These changes can occur spontaneously or from exposure to inducers such as harmful chemicals or radiation. Our metabolic activities cause mutations all the time oxygen, the vital molecule that helps us live, also creates dangerous DNA-damaging free radicals when metabolized by our cells. A sunny day at the beach can introduce thousands of mutations into our DNA. In fact, mutations are inevitable each time our cells divide, the imperfect DNA replication process introduces temporary errors into our DNA. It has been estimated that all these processes can result in thousands of individual molecular lesions per cell per day. Our genome surveillance system and DNA repair mechanisms must be doing a fantastic job: based on these mutation rates, cancer should occur from the moment we are conceived.

What is our genome surveillance system? If a cell is to survive, all the different mutations must be repaired. Typically, this repair involves cutting out and re-synthesizing the damaged portion of the DNA. Although there are many different types of DNA repair, all are so important that the proteins involved can be found in everything from the humblest bacterium to our own cells.

DNA Repair Mechanisms

The beauty of DNA repair comes from the structure of DNA: The double helix carries two separate copies of all the genetic information in each of its two strands. When one strand is damaged, the other is used as a template to restore the sequence to the damaged strand. When both strands of the double helix are broken, however, leaving no template strand for repairs, cells may use one of two distinct alternative mechanisms to address breaks. The first, known as Non-Homologous End Joining (NHEJ), is a quick and dirty method for fixing the break simply put, the two broken ends are brought together and joined, usually with the loss of one or two nucleotide letters at the site of joining. Although this loss results in a permanent change in the DNA sequence, it is less harmful for the cell than a persisting double-stranded break. And, since very little of our genome actually codes for protein, the resulting mutation is statistically unlikely to be of much consequence. In contrast to the error-prone NHEJ mechanism, Homologous Recombination DNA Repair exploits the fact that each cell contains two copies of each double helix (i.e. each cell has two copies of each chromosome). In this case, the repair mechanism is able to transfer nucleotide sequence information from the intact double helix to the broken one. Recombination proteins recognize regions of similarity between the two double helices and bring these regions together. Then, DNA replication proteins use the intact helix as a template to repair the broken one.

Molecular Caretakers: BRCA1 and BRCA2

Two of the most famous proteins in cancer, BRCA1 y BRCA2, play a central role in DNA repair. These proteins move to the site of DNA damage and recruit other proteins to initiate DNA repair complexes. When either BRCA1 or BRCA2 are absent as the result of a mutation, these DNA repair complexes do not form after DNA damage. Therefore, cells that are missing BRCA1 or BRCA2 are hypersensitive to agents that damage DNA, such as UV light and various chemical carcinogens. Women with an abnormal BRCA1 or BRCA2 gene, for example, have an extremely high risk of developing breast cancer and a high risk of developing ovarian cancer. As a result, many women who have a family history of breast and ovarian cancers undergo genetic testing. If they test positive for either gene mutation, they may opt to undergo a preventative mastectomy. Actress Angelina Jolie, who tested positive for a BRCA1 mutation and opted to undergo a preventative double mastectomy, recently brought this issue to the spotlight. While the publicity she generated was controversial, Jolie reduced her risk for developing breast cancer from 87 to less than five percent.

In addition to being crucial for DNA repair, BRCA1 and BRCA2 are also involved in cell cycle control. The Retinoblastoma protein, which detects damaged DNA, acts as the brake in cell cycle progression . Once they detect damaged DNA, BRCA1 and BRCA2 are crucial for the activation of these cell cycle checkpoints. BRCA1 also activates P53, a key protein involved in activating apoptosis in response to irreparable DNA damage. These essential roles for BRCA1 and BRCA2 proteins highlight their role in DNA repair, underscoring their function as molecular caretakers in our genome surveillance system.

Stacking The Deck

When our genome surveillance system is compromised, the rate of mutations increases (similar to how anarchy breaks loose when local law enforcement is indisposed). The effect of a mutation is still random, but cancer cells can stack the deck in their favor when the genome surveillance system is compromised, ensuring that future mutations occur more frequently. When cancer cells evolve, there is selection for mutations that can overcome the ten anticancer defense mechanisms represented by the Hallmarks of Cancer. Mutations in Ras allow cancer cells to remain independent from growth factors . Mutations in Retinoblastoma remove the brakes, allowing for uncontrolled cell division . P53 mutations allow cells to escape cell death . All of these mutations are produced initially by direct DNA damage, and secondarily as a result of mutations in genes that increase the probability of more mutations (i.e. mutations in DNA repair). Thus, as cancer cells continue to evolve and cells with specific mutations are selected, cells that carry mutations in genes that normally function in maintaining the stability of the genome are also selected. Genomes vary widely between different tumor types, but nearly all of them have DNA repair defects. Thus, genome instability and mutation are essential to tumor progression.

Las opiniones expresadas son las del autor (es) y no son necesariamente las de Scientific American.


Chromosomal mutation vs mitochondrial mutation:

Mitochondria are the powerhouse organelle of our cell. Mitochondrial DNA (mtDNA) is present in mitochondrial (not in the nucleus), and it has its own replication and transcription machinery.

Genomic mutations may be either syndromic or Mendelian while the mitochondrial mutations are neither syndromic nor Mendelian.

Because it inherited from the maternal organism only, it is known as maternally inherited DNA. Thus, if any mutation is induced in the mtDNA and is inherited to male offspring, it can’t further be transmitted.

Chromosomal DNA is inherited from both the parents. notably, not all chromosomal mutations are inherited in Mendelian fashion.

For instance, Cry du chat syndrome, Down syndrome, and Patau syndrome are some of the common types of chromosomal disorders that do not follow Mendelian inheritance.

Mitochondrial DNA is inherited maternally, it is rarest among rare.

Kearns- syre syndrome, Leigh syndrome and non-syndromic hearing loss are some of the mitochondrial disorders which arise due to the mutation in mtDNA.

Deletion, duplication, translocation and inversion are some of the common types of mutations observed in mtDNA, same as genomic DNA.


Extended Data Fig. 1 Results of pilot study.

Three genes were selected for knockout (∆): MSH6, UNG y ATP2B4 (negative control). Two genotypes per gene were obtained and grown in culture to gauge reproducibility of signatures between different genotypes of a gene-knockout. These lines were cultured under normoxic (20%) and hypoxic (3%) states, for defined culture times of

15, 30 or 45 days. Two single-cell subclones were derived for whole genome sequencing for each parental line (equivalent to four subclones per gene edit). Uno de los UNG genotypes appeared to be heterozygous, which was excluded in downstream analysis. a, Substitution burden for knockouts of ATP2B4, UNG y MSH6 under hypoxic and normoxic conditions as well as different culturing time. B, The cosine similarities between the mutational profile of each subclone and background signature of culture. C, Indel burden for knockouts of ATP2B4, UNG y MSH6 under hypoxic and normoxic conditions as well as different culturing time. D, The cosine similarities between the mutational profile of each subclone with background signature of culture. Overall, the differences between normoxic and hypoxic conditions were not marked, although normoxic conditions produced slightly more mutations. Time in culture made only a marginal, non-linear difference to burden of mutagenesis. Given the results of the pilot, weighing up the costs and risks associated with prolonged culture time (risk of infection, risk of selection, marked increase in cost of experimental reagents) with the minimal return in terms of mutation number, and also intending to minimize transitions between hypoxic to normoxic conditions while handling cell cultures, we opted to proceed with the full-scale study under normoxic conditions and for 15 days for the rest of study.

Extended Data Fig. 2 Detecting mutational consequences of knockouts in the absence of added external DNA damage.

a,B, Schematic illustration of potential components of background signature (a) and possible mutational consequences of the DNA repair gene knockouts for proteins that are critical mitigators of mutagenesis (B). C-mi, Mutation burden of whole-genome-sequenced subclones of gene knockouts. C, Substitution, (D) indel and (mi) double substitution. Bars represent the mean. Individual data points are shown in orange dots. In all comparative analyses, all gene knockouts were cultured for 15 days and only daughter subclones that were fully clonal (that is, clearly derived from a single cell) were included. norte = 2

4, which is the number of clonal knockout subclones cultured under normoxic condition for 15 days (see Supplementary Table 2). F, 96-channel substitution mutation profiles of 173 gene knockout subclones.

Extended Data Fig. 3 Results of contrastive principal component analysis and t-SNE.

a, Contrastive principal component analysis (cPCA) was employed to discriminate knockout profiles from control profiles (∆ATP2B4). Each figure contains six different genes. Nine gene knockouts separate from the controls. Using this method, ∆ADH5 did not separate clearly from ∆ATP2B4, indicative of either having no signature or a weak signature. Dot colours indicate the repair/replicative pathway that each gene is involved: in black - control green - MMR orange – BER dark purple – HR and HR regulation light purple - checkpoint. Each dot represents a subclone. The number of subclones for each gene knockout (N = 2

4) can be found in Supplementary Table 2. B, The t-SNE algorithm was applied to discriminate the mutational profiles of gene knockouts from those of control knockouts. Gene knockouts that produce mutational signatures separate clearly from control subclones and other knockouts which do not have signatures. Subclones of the gene knockouts which produce signatures are clustered together, indicating consistency between subclones.

Extended Data Fig. 4 Oxidative damage-associated mutational signatures.

a, Relative mutation frequency of G>T/C>A in 256 possible channels which take two adjacent bases 5’ and 3’ of each mutated base (4×4×4×4=256) for ∆ATP2B4, ∆OGG1, a head and neck cancer with strong SBS18 and SBS18. B, Left: tSNE plot of tissue-specific mutational signature 18. Two groups are featured with predominant peaks at TGRAMOC>TTC/GCA>GAA (highlighted in green) and AGRAMOA>ATA/TCT>TAT (highlighted in purple), respectively. Right: heatmap of 21 tissue-specific mutational signatures at C>A. We compared experimental signatures to previously published cancer-derived signatures, focusing on 21 tissue-specific variations of Signature 18. Interestingly, we found two distinct groups of Signature 18. Signatures of ∆OGG1, cellular models and signatures derived from head and neck tumors, pancreas, myeloid, bladder, uterus, cervix, lymphoid tumors were most similar to each other, with the predominant G>T/C>A peak at TGRAMOC>TTC/GCA>GAA. By contrast, an alternative version of this signature with a predominant G>T/C>A peak at AGRAMOA>ATA/TCT>TAT was noted in colorectal, esophagus, stomach, bone, lung, CNS, breast, skin, prostate, liver, head and neck tumors (Signature Head_neck_G), ovary, biliary and kidney cancers. Indeed, there are many types of oxidative species which could fluctuate between tissues, variably affecting trinucleotides resulting in the variation observed in Signature 18.

Extended Data Fig. 5 Indel signatures and double substitution signatures.

a, 15-channel Indel signatures. B, 186-channel Indel signatures. C, Aggregated double substitution profile of ∆RNF168 and ∆EXO1.

Extended Data Fig. 6 Similarities between ∆EXO1, ∆RNF168 signatures and RefSig5 and results of analysis on transcriptional strand bias and distribution of mutations on replication timing domains.

a, Hierarchical clustering of cancer-derived reference signatures (RefSig) with ∆EXO1 and ∆RNF168 signatures. B, Hierarchical clustering of tissue-specific signature 5 with ∆EXO1 and ∆RNF168 signatures. C, Transcriptional strand bias in 9 gene knockouts. Pearson’s Chi-Squared test (chisq.test()) was used to calculate the p-value. P-value was corrected using p.adjust(). Unlike mutational signatures of environmental mutagens, we do not observe striking transcriptional strand bias in signatures generated by DNA repair gene knockouts, except for T>C generated by ∆EXO1 and ∆RNF168. Since transcriptional strand bias is largely induced by NER repairing DNA bulky adducts, lack of it indicates that most of the endogenous DNA damage is not particularly bulky or DNA-deforming. D, Distribution of mutation density across replication timing domains (separated into deciles) for signatures associated with different gene knockouts. Green bars indicate observed distribution. Blue lines indicate expected distribution with correction of trinucleotide density of each domain. Bars and error bars represent mean ± SD of bootstrapping replicates (norte=100).

Extended Data Fig. 7 Putative outcomes of all possible base-base mismatches.

Outcomes from 12 possible base-base mismatches. The red and black strands represent lagging and leading strands, respectively. The arrowed strand is the nascent strand. The highlighted pathways are the ones that generate C>A (blue), C>T (red) and T>C mutations (green) in the ∆MSH2 mutational signature.

Extended Data Fig. 8 Distribution of G>T/C>A mutations in polyG tracts of ∆MSH2, ∆MSH6 and ∆MLH1.

a, Relative frequency of occurrence of G>T/C>A in polyG tracts. B, Occurrence of G>T/C>A in polyG tracts.

Extended Data Fig. 9 Gene-specific mutational signatures in MMR-deficiency.

Proportion of different mutation types of substitution (a) and indel (B) signatures for four MMR gene knockouts. C, The ratio of substitution and indel burden. D, Schematic interpretation of the relative mutation burdens of ∆MSH2 and ∆MSH6.

Extended Data Fig. 10 Development of MMRDetect.

(a)-(mi) Distribution of the five parameters across IHC-determined MMR gene abnormal (orange) and MMR gene normal (green) samples. black dots and error bars represent mean ± SD of the paramenters. norteAbnormal=79 samples (yellow) norteNormal= 257 samples (green). a, Exposure of MMRd signatures. B, Cosine similarity between the substitution profile of cancer samples and that of MMR gene knockouts. C, Number of indels in repetitive regions. D, Cosine similarity between the profile of repeat-mediated deletions of cancer sample and that of knockout generated indel signatures, (mi) the cosine similarity between the profile of repeat-mediated insertion of cancer sample and that of knockout generated indel signatures. P-values were calculated through two-sided Mann-Whitney test. F, Distribution of coefficients from 10-fold cross validation using training data set. Box plots denote median (horizontal line) and 25th to 75th percentiles (boxes). The lower and upper whiskers extend to 1.5× the inter-quartile range. norte = 10 iterations. gramo, MMRDetect-calculated probabilities for 336 colorectal cancers. With cut-off of 0.7, 77 out of 336 were predicted to be MMR-deficient samples (probability < 0.7). Colour bars represent the MSI status determined by IHC staining: red – abnormal blue – normal. Four samples with abnormal IHC staining have probabilities > 0.7, whilst 2 samples with normal IHC staining have probabilities < 0.7. The four samples were revealed to be false positive cases and the two samples were false negative ones for IHC staining through validation using MSIseq and seeking coding mutations in MMR genes. h, Distribution of the mutation number of repeat-mediated indels, MMRd signatures and non-MMRd signatures across four groups of samples: MMR-deficient samples determined by only MMRDetect (yellow), MMR-deficient samples determined by only MSIseq (purple), MMR-deficient samples determined by both MMRDetect and MSIseq (blue) and non-MMR-deficient samples determined by both MMRDetect and MSIseq (pink). P-values were calculated through two-sided Mann-Whitney test. Numbers of MMR-deficient samples determined by MMRDetect only (blue), MSIseq only (pink), both (yellow) and none (purple) are 34, 20, 587 and 6,718, respectively.


Ver el vídeo: Replicación del ADN (Febrero 2023).