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Cuente las colonias de la manera correcta

Cuente las colonias de la manera correcta


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Utilizo agar rosa de bengala cloramfenicol para buscar levaduras y mohos para su inclusión en petri plat. ¿Cuál es el método correcto para contar? ¿No estoy seguro de si cuento todo o solo el más grande?


Si tienes que contar cada individuo colonia.

Sin embargo, en la práctica la pregunta es más, qué se considera un plato contable y qué importancia tiene. En muchos laboratorios, encontrará que los técnicos y científicos no se molestarán en contar todas y cada una de las colonias en la placa si tiene un número visiblemente alto de colonias. Por ejemplo, simplemente dirán (con un poco de experiencia), el recuento de esta placa es superior a 300 (escriba>300).

Sin embargo, por supuesto, todavía necesitará un recuento, por lo que es una práctica común realizar una de las siguientes acciones:

  • Divida su plato en sectores de igual tamaño (puede dibujar líneas en la parte inferior del plato), cuente todas las colonias en un sector y luego multiplique este número por el número de sectores en los que se ha dividido. Entonces, digamos, ha dividido su la placa en 4 sectores (cuadrantes) dibujando una gran cruz en ella, contarías las colonias en un cuadrante y luego multiplicarías por 4. Esto es obviamente una extrapolación.
  • La otra opción es diluir la muestra hasta que esté dentro del rango contable. Entonces, podría hacer una dilución en serie, ponerla en placas y luego, una vez que sus organismos hayan crecido, puede contar toda la placa y luego multiplicar por el factor de dilución. Entonces, digamos, por ejemplo, tiene su muestra en un caldo de enriquecimiento y hace dos diluciones 1/10 (1/100) y luego distribuye 0.1 ml (cuenta como 1/10), tiene un factor de dilución final de 1000. Entonces tendrías que multiplicar el recuento que obtienes en este plato imaginario por 1000.

En su muestra, obviamente, tiene una variedad de organismos diferentes. Probablemente sea aconsejable verificar los métodos oficiales para ver lo que recomiendan. Aquí hay un extracto del método oficial BAM para levaduras, mohos y micotoxinas:

Cuente las placas después de 5 días de incubación. Si no hay crecimiento a los 5 días, vuelva a incubar durante otras 48 h. No cuente las colonias antes del final del período de incubación porque la manipulación de las placas podría provocar un crecimiento secundario de las esporas desprendidas, lo que invalidaría los recuentos finales. Cuente las placas que contienen de 10 a 150 colonias. Si están presentes principalmente levaduras, las placas con 150 colonias suelen ser contables. Sin embargo, si hay cantidades sustanciales de moho, dependiendo del tipo de moho, el límite superior contable puede tener que reducirse a discreción del analista. Informe los resultados en unidades formadoras de colonias (UFC) / go UFC / ml según el recuento promedio de conjuntos por triplicado. Redondee los recuentos a dos cifras significativas. Si el tercer dígito es 6 o más, redondee al dígito anterior (p. Ej., 456 = 460); si es 4 o menos, redondee al dígito inferior (p. ej., 454 = 450). Si el tercer dígito es 5, redondee al dígito siguiente si los primeros 2 dígitos son un número par (por ejemplo, 445 = 440); redondee al dígito anterior si los primeros 2 dígitos son un número impar (por ejemplo, 455 = 460). Cuando las placas de todas las diluciones no tengan colonias, informe los recuentos de hongos y levaduras (MYC) como menos de 1 vez la dilución más baja utilizada. Aislar colonias individuales en PDA o MA, si es necesario un análisis adicional e identificación de especies.

Por favor, vea el enlace aquí.


Terapia con células madre en recién nacidos: ha llegado (casi) el momento

Otras células madre para la displasia broncopulmonar

Células progenitoras endoteliales y células formadoras de colonias endoteliales

Tanto las ECFC como las ECFC-CdM han mejorado eficazmente la lesión pulmonar hiperóxica y la hipertensión pulmonar en animales inmunodeprimidos. 15 En el modelo de bleomicina de DBP, ECFC-CdM no tuvo ningún efecto sobre la estructura pulmonar pero previno la hipertensión pulmonar. 57 Esto podría limitar el potencial terapéutico de ECFC-CdM. Las ECFC mejoraron tanto la alveolarización como la hipertensión pulmonar. Curiosamente, las ECFC prematuras pero no a término perdieron su efecto terapéutico después de la exposición hiperóxica, lo que indica que los productos celulares pueden verse significativamente influenciados por cambios en las condiciones de cultivo.

Células epiteliales de amnios humanos

En la DBP inducida por bleomicina, la administración intravenosa de hAEC redujo la inflamación pulmonar y la fibrosis. 58 In vitro, las hAEC se podrían diferenciar en células alveolares tipo II productoras de surfactante. Después de la administración in vivo, las hAEC migraron al pulmón dañado y parecieron diferenciarse en células alveolares de tipo II. 58 Se observó una diferenciación similar en neumocitos de tipo I y tipo II después de la administración de hAEC en ovejas fetales con lesión pulmonar inducida por el ventilador. 59 Se observaron efectos proangiogénicos para las CEAa a término pero no para las prematuras en el modelo de bleomicina. 28 La comparación directa de las hAEC y las CMM derivadas de la membrana amniótica después de una lesión pulmonar inducida por bleomicina reveló un efecto superior de las CMM sobre la fibrosis pulmonar, pero efectos antiinflamatorios similares para ambas terapias celulares. 60

Se necesitan más datos sobre la dosificación óptima, el momento y la vía de administración antes de que las hAEC y las MSC puedan compararse de manera más concluyente.


Virginia

El primer asentamiento inglés en el nuevo mundo fue en Virginia, con el primer asentamiento permanente realizado en 1607, dirigido por comerciantes londinenses, que enviaron una colonia de cinco barcos para asentarse en la isla de Roanoke. Las tormentas los obligaron a entrar en la bahía de Chesapeake. Subieron por el río Powhatan, desembarcaron y formaron el asentamiento de Jamestown. El río fue nombrado Río James en honor a su Rey. Después de varias dificultades, el asentamiento prosperó y, en 1619, se celebró en Jamestown la primera Asamblea representativa en Virginia. Esta asamblea formó la base de lo que se convertiría en el estado de Virginia.


Descripción general de los procedimientos y usos de las técnicas asépticas.

El programa de laboratorio implicó el estudio de las técnicas asépticas. Estas técnicas asépticas son esenciales en un laboratorio porque ayudan a mantener el laboratorio estéril, y la esterilidad es vital en un laboratorio porque le permite al científico estudiar y aumentar las bacterias que necesita con precisión. La esterilidad también es importante para evitar las bacterias que no se requieren para replicarse y crecer en el medio de progreso estéril o en la placa de agar.

Hubo algunas técnicas asépticas que tuvimos que seguir al tratar con bacterias y medio de expansión estéril. Para evitar que el medio de desarrollo se contamine con bacterias del orificio del aire y otros sujetos que flotan libremente, se creó un mechero Bunsen cerca de donde, de hecho, se utilizarían las muestras de medio de progreso y bacterias. El mechero Bunsen creó una corriente de convección que aniquiló y destruyó la mayor parte de las bacterias transportadas por el medio ambiente y otra materia flotante libre cerca del lugar de trabajo. Esto redujo la posibilidad de que el medio de crecimiento y los ejemplos de bacterias se contaminen.

El mechero Bunsen también se configuró para permitir el uso de otra estrategia llamada flamear. Esta técnica consiste en transferir a través de la llama del quemador lo que haya entrado directamente en contacto con cualquier bacteria o cualquier cosa que vaya a entrar directamente en contacto con la muestra de bacterias. Las cosas que se inflaman son equipos de laboratorio como asas bacteriológicas, una pipeta de vidrio y cuellos de recipientes o matraces. Las cosas deben alcanzar una temperatura superior a los 100 oC para que se esterilicen.

Otra estrategia aséptica se llama manipulación. En esta técnica, se utiliza el dedo más pequeño para quitar la tapa de la botella que contiene las bacterias, lo que permite que todos esos otros dedos obtengan cualquier otra cosa que se requiera. Esta técnica también garantiza que la tapa del recipiente no se coloque sobre el banco donde es probable que se contamine y, por lo tanto, se contamine el cultivo de bacterias en el recipiente.

El enfoque aséptico anterior, pero el más crucial, es que alguien evite que las bacterias contaminen el laboratorio y el equipo. Cada persona porta una cantidad considerable de bacterias dentro y fuera de su cuerpo. Siempre que usamos bacterias en un laboratorio, teníamos que usar una capa de laboratorio, esto evita que las bacterias de nuestra ropa y sistemas se propaguen en el laboratorio. También debemos tener cuidado de que la gente no tosa o estornude en el medio de progreso, ya que esto conduciría al progreso de las bacterias liberadas por su cuerpo. Además, después de realizar el experimento, fue vital que se lavaran las manos con jabón antibacteriano para ayudar a prevenir los contaminantes cruzados. Si las manos no se lavan correctamente y si quedan bacterias en las manos, podrían multiplicarse a un ritmo exponencial y causar infecciones bacterianas.

La primera parte del experimento fue ver diferentes desviaciones y cantidades de bacterias en las manos antes del enjuague y después del lavado. Esto se hace colocando las manos en una placa de Petri con agar nutritivo. El agar nutritivo es un medio de progreso microbiológico comúnmente utilizado para el cultivo aburrido de bacterias. El plato se separó en dos y se etiquetó con una parte del plato que tenía huellas de manos previamente lavadas y la otra parte después del enjuague. Luego, el plato se colocó en incubación a 37 diplomas, ya que son las temperaturas óptimas donde las bacterias tienen la capacidad de multiplicarse a un ritmo exponencial dependiendo de algunos factores, por ejemplo, la cantidad de comida disponible o el espacio.

La siguiente parte del experimento consiste en hacer una placa de rayas. Esto se hizo utilizando la bacteria Staphylococcus aureus. Se utilizó una pequeña prueba de la bacteria SA y se colocó en un asa estéril y se extendió un medio de agar. En el siguiente diagrama se muestra un ejemplo del plato de racha que se llevó a cabo:

Diagrama que muestra el método de recubrimiento de rayas

1. Flamee el bucle y la línea y raye un bucle lleno de caldo como en A en el diagrama.

2. Vuelva a encender el lazo y enfríelo.

3. Separe como en B para propagar las bacterias originales sobre más agar.

4. Vuelva a encender el lazo y enfríelo.

5. Racha como en C, D E y F siguiendo el mismo procedimiento después de cada racha como se cita arriba.

6. Etiquetar la placa e incubarla invertida.

La siguiente parte del primer período fue hacer una dilución en serie. Esto le permite buscar la cantidad de células cutáneas en un cultivo bacteriano. Dado que las estadísticas de células bacterianas suelen ser altas en la prueba inicial, colocar esta prueba en placas sin diluir solo conduciría a la creación del patio trasero bacteriano (un frotis de varias, muchas colonias de bacterias individuales que están creciendo junto o encima de cada una de ellas). otro).

Las estadísticas de células bacterianas deben reducirse, lo que se realiza diluyendo constantemente la cantidad de bacterias en la prueba. Se mezcla una pequeña cantidad de muestra de bacterias con una solución diluyente (como caldo estéril) y luego se hacen diluciones sucesivas. A continuación, se multiplica una pequeña cantidad de cada una de las muestras de bacterias diluidas en una placa de agar. Se cuentan las cantidades de colonias de bacterias que se expanden en cada placa. Trabajando hacia atrás usando la multiplicación con el "factor de dilución" (el número de veces que ha diluido la prueba de bacterias con la solución diluyente), pudimos hacer una dedicación del número de bacterias en la muestra inicial. Después de que se crearon las diluciones, 100 l de cada dilución se transfirieron a una placa de agar con una pipeta, luego se pasaron a través de la placa de agar con un esparcidor. Estas seis placas de agar se pusieron luego en incubación a 37 ° C todos los días y noches. Al distribuir el traspatio bacteriano se hizo primero la placa con el nivel de dilución 10-5 y luego los otros 10-4, 10-3, 10-2. Esto se debe a que el esparcidor que se usó era de plástico, por lo que la bacteria de enfoque inferior se transmitió primero, ya que el esparcidor de plástico transparente no se podía incendiar para destruir las bacterias. Si no se usaba esta estrategia aséptica y se usaba primero la mejor concentración de bacterias hubiera significado que las harinas bacterianas podrían haberse contaminado y además no se ganarían colonias de bacterias. Si se usó un esparcidor de vasos, entonces podría hacerlo en orden ascendente, ya que el vidrio podría inflamarse poniendo etanol en la superficie matando las bacterias en el esparcidor de vidrio antes de hacer otra parte de la dilución en serie.

El área final de las primeras clases de laboratorio fue preparar frotis de bacterias para tinción de Gram. La tinción de Gram es una técnica común que se utiliza para diferenciar dos grandes grupos de bacterias que se basan en sus diferentes componentes de la estructura de la pared celular. El proceso de tinción de Gram distingue entre grupos Gram positivos y Gram negativos coloreando estas células de la piel de rosa o púrpura. Las bacterias Gram positivas se tiñen de púrpura debido a la presencia de cualquier capa gruesa de peptidoglicano en la superficie de sus paredes celulares, que retiene el cristal violeta con el que están teñidas estas células. Además, las bacterias Gram negativas se tiñen de rosa, lo que se atribuye a una estructura de pared de peptidoglicano más delgada, que no retendrá el cristal violeta durante el proceso de decoloración.

La tinción de Gram implica tres técnicas: tinción con un tinte soluble en agua llamado cristal violeta, decoloración y contratinción, generalmente con safanina. Debido a las distinciones en el ancho de una cubierta de peptidoglicano en la membrana celular entre bacterias Gram positivas y Gram negativas, las bacterias Gram positivas (con un nivel de peptidoglicano más grueso) conservan la tinción de violeta cristal a través del proceso de decoloración, mientras que las bacterias Gram negativas pierden la tinción de violeta cristal y en su lugar se tiñen con la safranina en el proceso de tinción final. El proceso consta de tres pasos:

1. Las células se tiñen con colorante violeta cristal. A continuación, se agrega una solución de yodo de Gram (yodo y yoduro de potasio) para formar una sustancia orgánica entre el cristal violeta y el yodo. Este complejo es una molécula más grande que la tinción original de violeta cristal y el yodo y es insoluble en agua.

2. Se pone en la prueba un decolorante, como bebidas alcohólicas etílicas o acetona, que deshidrata el recubrimiento de peptidoglicano, encogiéndolo y tensándolo. El gran cristal violeta-yodo orgánico no es capaz de penetrar en esta cubierta de peptidoglicano apretada y, por lo tanto, es capturado en la célula en bacterias Gram positivas. Por el contrario, la membrana externa de las bacterias Gram negativas se degrada y la capa más delgada de peptidoglicano de las células Gram negativas lucha por retener el complejo cristal violeta-yodo y se pierde el color.

3. Se agrega a la prueba una contratinción, como la safranina soluble en agua débilmente normal, que la tiñe de verde. Dado que la safranina es más clara que el cristal violeta, no altera la coloración carmesí de las células cutáneas Gram positivas. Sin embargo, las células Gram negativas decoloradas se tiñen de rojo.

(Los métodos descriptivos se muestran en el manual de todos los experimentos).


Método más simple para medir las infecciones virales en las abejas.

Puede ser difícil evaluar la gravedad de una infección por virus en una colonia de abejas. Una nueva herramienta del Departamento de Agroecología lo facilita. Crédito: Colourbox

Científicos de la Universidad de Aarhus han desarrollado un modelo que facilita a los apicultores evaluar la gravedad de las infecciones virales en sus abejas melíferas.

¿Necesita hacer sonar la alarma si hay 100,000 partículas de virus en las colmenas, o no hay nada de qué preocuparse hasta que haya 10 millones? Puede ser difícil para la mayoría de las personas hacer malabares con números tan grandes, pero ahora los científicos de la Universidad de Aarhus han facilitado que los apicultores concluyan sobre la gravedad de la presión de las infecciones virales en sus colonias de abejas.

Sobre la base de las observaciones en las colonias de abejas danesas, los científicos han agrupado la incidencia de infecciones virales en cuatro categorías. Esto significa que en lugar de utilizar una escala móvil de números con muchos ceros detrás, puede referirse a las cuatro categorías. Esto hace que sea más fácil para los apicultores cuando, por ejemplo, necesitan decidir si tomar medidas preventivas o no y si una colonia de abejas se puede utilizar para una mayor cría. También es una herramienta importante para los científicos.

"Cuando tienes que luchar contra epidemias, es importante saber qué tan extendida está la enfermedad y cuál es su causa. Esto también se aplica a la prevalencia de virus en las abejas melíferas. Con nuestro método es más sencillo evaluar esta prevalencia", dice el científico senior Per Kryger del Departamento de Agroecología de la Universidad de Aarhus.

Las abejas melíferas son actores importantes en nuestra cadena alimentaria. Ayudan a asegurar que los cultivos se polinicen para que las flores se conviertan en frutos. En los últimos años, las abejas melíferas han experimentado problemas a escala mundial: las colonias de abejas se han derrumbado por razones desconocidas. Desde 2006, alrededor del 30 por ciento de las colonias de abejas melíferas se pierden cada año en los EE. UU. Si bien la situación en Dinamarca no es tan grave, sigue siendo un problema que las colonias colapsen sin saber la causa exacta.

Varios factores pueden ser los culpables, ya sea solos o al unísono, incluidos virus, parásitos y diversas formas de estrés. Se han criado con éxito abejas melíferas resistentes al ácaro varroa y al parásito microscópico, parecido a una esponja, Nosema apis. Quizás se podría hacer lo mismo en la batalla contra los virus.

Estudios anteriores han demostrado que el virus prevalece en muchas colonias de abejas y que solo unas pocas colonias de abejas están completamente libres de virus. Esto también se aplica a colonias aparentemente sanas, por lo que se debe haber desarrollado una especie de tolerancia que significa que las abejas no se enferman incluso cuando están infectadas.

Este hecho implica que es posible que crezcan colonias resistentes. Sin embargo, la cría selectiva requiere que se pueda contar el número de partículas de virus para poder seleccionar las colonias adecuadas para producir la próxima generación.

Colonias de abejas bajo el microscopio.

Para tener una idea del nivel de infección actual en Dinamarca, los científicos examinaron colonias de abejas melíferas danesas sanas en busca de siete virus diferentes. También examinaron colonias de colmenares con una alta incidencia del ácaro varroa o una alta tasa de mortalidad en invierno.

"Observamos el nivel de infección de las abejas danesas con un enfoque en colonias de abejas saludables. Los resultados pueden formar el nivel de referencia para las evaluaciones de la salud de una colonia de abejas", dice Esmaeil Amiri, quien llevó a cabo este proyecto como parte de su doctorado. estudia en la Universidad de Aarhus con la ayuda de numerosos apicultores daneses que enviaron abejas sanas al estudio.

Resultó que había una gran diferencia en la aparición del virus en colonias sanas y enfermas. De las colonias sanas, el 36 por ciento no contenía virus en absoluto. En las colonias enfermas, había al menos un tipo de virus en cada colonia. También hubo una gran variación en el número de partículas de virus en ambos grupos, y era común ver varios tipos de virus simultáneamente en la misma colonia. El virus más común fue el virus Sacbrook (SBV), el virus Black Queen Cell (BQCV) y el virus del ala deformada (DWV).

Sobre la base de sus observaciones, los científicos establecieron cuatro categorías de nivel de infección:

  • Libre (0 partículas de virus)
  • Bajo (más de 0 pero menos de 1000 partículas de virus)
  • Intermedio (mayor o igual a 1,000 pero menos de 10,000,000 partículas de virus)
  • Alto (más o igual a 10,000,000 de partículas virales)

La clasificación del número viral en cuatro categorías permitió a los científicos comparar estadísticamente los niveles de virus en colonias de abejas sanas y enfermas. Esta clasificación beneficia no solo a los científicos.

"Cuando los apicultores pueden trabajar con cuatro categorías de números de virus en lugar de una escala móvil, les resulta más fácil tomar decisiones estratégicas para prevenir una mayor propagación de la enfermedad o en el trabajo de cría", dice Per Kryger y continúa:

"Es importante que los legos puedan entender el conocimiento que generamos. Creemos que este conjunto de datos simplificado es un medio para lograr este fin".


¿Qué son las colonias de moho?

Pregunta: Hice pruebas de algunas muestras de moho en un laboratorio aquí en los EE. UU. Los resultados devueltos mostrando Aspergilo 19 colonias para la primera muestra. Los resultados de la segunda muestra fueron Aspergilo 3 colonias, Geotrichum 1 colonia, y Penicillium 1 colonia. ¿Qué son las colonias y cuál es su número? Hay un problema grave en nuestro hogar y ninguno de nosotros está muy bien en cuanto a salud. Cualquier información que pueda darme será muy apreciada.


Respuesta: En biología, una colonia (del latín colonia) se refiere a varios organismos individuales de la misma especie que viven juntos. En caso de moho, las colonias se refieren a crecimientos individuales (ver imagen). El número de colonias es un recuento de esos crecimientos individuales (colonias) y pueden pertenecer a diferentes tipos de moho o al mismo tipo. Por ejemplo, en su caso, la primera muestra solo tenía Aspergilo (19 colonias) y la segunda muestra tenía 3 tipos diferentes de moho. Eso & # 8217s Aspergilus (3 colonias), Geotrichum (1 colonia) y Penicillium (1 colonia). La imagen de la derecha muestra colonias de 2 tipos diferentes de mohos. Las colonias azul verdosas pertenecen a Penicillium y el resto (con centros verdosos) son Stachybotrys colonias.

El número de colonias informado para las 2 muestras no parece ser alto, pero esto no significa que no tenga un problema de moho. Es posible que desee buscar la ayuda de un consultor ambiental local calificado que pueda evaluar la extensión del crecimiento de moho en su hogar y asesorarlo sobre qué hacer.

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Acerca de Jackson Kung'u

El Dr. Jackson Kung'u trabaja para MBL, un laboratorio que se especializa en la identificación y enumeración de moho y bacterias que se detectan comúnmente en aire, fluidos y muestras a granel recolectadas de hogares, escuelas, oficinas, hospitales, industriales, agrícolas y otros entornos laborales. Jackson también ofrece un curso de formación de moho único sobre cómo reconocer el moho en interiores, desarrollar estrategias de muestreo eficaces, interpretar los resultados de laboratorio y cómo controlar el crecimiento del moho.


Introducción

El crecimiento bacteriano es un indicador esencial en muchos estudios sobre microorganismos. La selección de antibióticos (Van Doorn et al., 2000), las pruebas de toxicología (Chen et al., 2004) y la evaluación de la seguridad de los alimentos y medicamentos (Itoh et al., 1998) requieren la determinación de las tasas de supervivencia de los microorganismos para verificar logros de la investigación. Por lo general, esto implica contar el número de bacterias en una unidad de volumen de caldo bacteriano utilizando varios métodos, que incluyen citometría de flujo, espectrofotometría, filtrado de membrana y el método de placa de agar. La citometría de flujo (Macey, 2007) combina el uso de propiedades bacterianas con diversas sustancias fluorescentes. Las bacterias se colocan en un citómetro de flujo, en el que las sustancias fluorescentes que transportan son excitadas por láseres ajustados a frecuencias particulares para la generación de señales ópticas. Los filtros de varias longitudes de onda convierten estas señales en señales electrónicas para permitir el recuento de bacterias. La espectrofotometría (Schmidt y Schmidt, 2004) es una medida cuantitativa de la transmisión óptica de una suspensión bacteriana en función de la longitud de onda. La cantidad de luz que atraviesa la suspensión es indicativa de la concentración de ciertas bacterias que no permiten el paso de la luz. El método del filtro de membrana (Inatomi, 2003) consiste en pasar muestras adecuadamente diluidas a través de un filtro de membrana con diámetros de poro más pequeños que los de los microorganismos. Los microorganismos permanecen en la membrana, que luego se coloca en un medio de cultivo. El número total de bacterias en la muestra original se puede calcular de acuerdo con el número de colonias que se forman en el filtro de membrana. El método de la placa de agar (Barbosa, 1995) implica untar la suspensión bacteriana diluida en un medio de cultivo apropiado. Dado que solo los microbios supervivientes crecen y forman colonias en la placa, al contar el número de colonias, se puede obtener el número de bacterias viables. De estos métodos, el método de la placa de agar se usa comúnmente para analizar la tasa de supervivencia de los microbios.

Sin embargo, el recuento manual de colonias requiere mucho tiempo y es impreciso. Para ahorrar tiempo y evitar inconsistencias, se han desarrollado varios programas de software de procesamiento de imágenes, como ImageJ. ImageJ es un programa de análisis de imágenes gratuito que se puede utilizar para muchos procesos y análisis de imágenes. Sin embargo, para los usuarios que no tienen un conocimiento profundo del procesamiento de imágenes, se requieren más esfuerzos y familiaridad con el idioma para obtener resultados satisfactorios. Además, Clarke et al. (2010) propuso un sistema de conteo de colonias de bajo costo y alto rendimiento que consta de un software de conteo de colonias y una cámara digital o un escáner de documentos para consumidores. El software, llamado "NICE" (NIST & # x27s Integrated Colony Enumerator), lee formatos de imagen estándar y, por lo tanto, puede usarse junto con muchos sistemas de imágenes. El programa (OpenCFU) creado por Geissmann (2013) que proporciona control sobre los parámetros de procesamiento también se puede utilizar para contar colonias de células y otros objetos circulares. Niyazi y col. (2007) desarrollaron Clono-Counter, que utiliza tres parámetros, a saber, niveles de gris, tamaño máximo de una colonia y distribución del nivel de gris dentro de la colonia, para el recuento de colonias. Los usuarios deben tener algo de experiencia para encontrar los parámetros adecuados, pero se proporcionan algunas pautas para acelerar el proceso. Zhang y Chen (2007) propusieron un contador de colonias automático para el recuento de colonias bacterianas sin ninguna intervención humana, que ha demostrado ser más preciso que Clono-Counter. Aunque tiene una alta precisión en imágenes con medios de color, tiene problemas con aquellas con medios transparentes. Chen y Zhang (2009) propusieron un método para eliminar las diferencias de color resultantes del cultivo en diversos ambientes de cultivo, lo que permite su aplicación a placas de Petri de diversos medios. Se demostró un rendimiento razonable para imágenes con soportes transparentes y en color. Men et al. (2008) eliminaron los bordes de las placas de Petri asumiendo que son círculos perfectos a pesar de la adherencia de colonias en los bordes. A través de una serie de iteraciones, identificaron valores de umbral capaces de aislar las colonias del fondo, emplearon la transformación de distancia y un algoritmo de cuenca para dividir las colonias, y luego utilizaron la relación de compacidad para eliminar el ruido antes del recuento. Hong (2008) propuso un método basado en la máquina de vectores de soporte (SVM) para la identificación de colonias. Su enfoque utilizó seis parámetros, a saber, área, perímetro, diámetro equivalente, factor de forma, longitud y ancho, para identificar colonias, con tasas de reconocimiento de más del 96%. Ates y Gerek (2009) propusieron un método que requería que los usuarios seleccionaran primero tres puntos. Usando el hecho de que tres puntos pueden definir un círculo, luego identificaron semiautomáticamente los bordes de las placas de Petri y usaron la relación de compacidad para determinar la existencia de colonias agrupadas que requieren división. Brugger y col. (2012) utilizaron un CCD para capturar imágenes de colonias. El límite del plato se veía como un círculo perfecto. Se eliminaron las colonias que tocan el límite. Los resultados estuvieron altamente correlacionados con los obtenidos del conteo manual. Dahle y col. (2004) emplea un escáner de lecho plano para contar colonias en 12 placas de Petri a la vez. Después de la tinción, las placas de Petri se colocaron en las rejillas especialmente diseñadas que se utilizan para fijar las placas en la misma posición de un experimento a otro y disminuir el sombreado. Bae y col. (2009) propuso un instrumento microbiológico que integra un localizador de colonias, un dispersómetro delantero y un controlador de movimiento 2D que no solo cuenta y localiza las colonias bacterianas, sino que también mide automáticamente la firma de dispersión directa para identificar las especies de la colonia bacteriana bajo investigación. Ogawa y col. (2012) propusieron el análisis de imágenes de sombras por lapso de tiempo (TSIA), que consiste en capturar una imagen de la placa de Petri cada hora y luego analizar las diferencias según las sombras. Esta técnica permite a los observadores identificar la ubicación de las colonias. También se han aplicado otras técnicas novedosas como la transformada de distancia (Mukherjee et al., 1995), la transformada de Hough (Barber et al., 2001) y la lógica difusa (Marotz et al., 2001) para facilitar el conteo automatizado.

Varios autores (Men et al., 2008, Ates y Gerek, 2009, Brugger et al., 2012) han observado problemas asociados con la detección de colonias alrededor de la periferia de la placa Peri y, por lo tanto, excluyen esta área del procesamiento. Sin embargo, dado que las colonias se distribuyeron por toda la superficie de una placa, excluir las colonias alrededor de la periferia de la placa puede reducir la precisión estadística. Además, algunos algoritmos (Niyazi et al., 2007, Ates y Gerek, 2009) requieren que los usuarios proporcionen manualmente los parámetros antes del proceso automatizado. Para superar estos problemas, este estudio propone un sistema totalmente automático y eficaz para el recuento de colonias. Se tienen en cuenta las colonias tanto alrededor del área central como en las áreas del borde de una placa de Petri. El rendimiento del sistema propuesto se compara con recuentos manuales verificados. También se desarrolla una interfaz gráfica de usuario (GUI) fácil de usar.

La siguiente sección presenta los procedimientos de cultivo de colonias bacterianas y captura de imágenes. Los métodos de procesamiento de imágenes, que comprenden la segmentación de imágenes, el recuento de colonias en el área central y el recuento de colonias en el área del borde se presentan en la Sección 3, seguidos de los resultados experimentales y las discusiones. En la Sección 5 se ofrecen un resumen y conclusiones.


Cuente las colonias de la manera correcta - Biología

La técnica estéril es siempre un asunto relativo. Las precauciones necesarias dependen de la situación experimental, incluidos los medios de cultivo utilizados, las capacidades competitivas del organismo experimental, la duración del experimento y el uso previsto del cultivo. Para estos experimentos, el problema de contaminación más grave es el moho. Muchos mohos comunes crecen bien en medios de levadura y compiten de manera efectiva, sobrepasando las placas y oscureciendo las levaduras que logran crecer. Las bacterias son un problema menor ya que la mayoría de ellas no crecen bien en estos medios y, con un poco de experiencia, se pueden distinguir fácilmente de la levadura. Otras cepas de levadura pueden ser contaminantes desastrosos si no se detectan. En particular, una levadura roja que aparece a veces puede ser muy confusa, pero se distingue de nuestra levadura roja porque no requiere adenina.

Sin embargo, a diferencia de los experimentos a corto plazo, los medios de esterilización deben ser bastante rigurosos porque el almacenamiento deja tiempo suficiente para que se desarrollen incluso los contaminantes de crecimiento lento. Hemos llegado a la conclusión de la experiencia que almacenar los medios en frío es realmente contraproducente. No previene la contaminación, pero frena su crecimiento. En consecuencia, la contaminación puede pasar desapercibida hasta que se incuban los cultivos. Es mucho mejor almacenar los medios a temperatura ambiente y detectar la contaminación antes de usarlos.

(1) Esterilización con calor húmedo

El calor húmedo proporcionado por un autoclave o una olla a presión es una forma eficaz de esterilizar la mayoría de los materiales. A una presión de 15 psi por encima de la presión atmosférica, el agua alcanza una temperatura de aproximadamente 121 ° C antes de hervir. La mayoría de los materiales se esterilizan eficazmente mediante una exposición de 15 minutos a esta temperatura. Si no se dispone de un autoclave, una olla a presión doméstica normal esterilizará eficazmente los suministros de medios en pequeños lotes.

(2) Esterilización con calor seco

Los materiales secos como el vidrio y el metal se pueden esterilizar en un horno, pero esto requiere una temperatura más alta (160 ° C) y más tiempo (al menos 2 horas) que un autoclave. Esto es más práctico para la cristalería cuando se dispone de un horno controlado por un temporizador automático para que la esterilización y el enfriamiento puedan ocurrir durante la noche. El uso de utensilios de plástico desechables preesterilizados hace que el horno sea menos importante.

La llama de un quemador de gas esteriliza eficazmente pequeños objetos metálicos o de vidrio, como asas de inoculación, pero se debe evitar "freír" la levadura por contacto con objetos calentados en una llama. Sumerja los esparcidores de vidrio en alcohol y luego use la llama para encender el alcohol. Coloque las herramientas de metal como lazos en la llama hasta que estén al rojo vivo. Enfríe las herramientas calientes tocándolas con el agar o dentro de un tubo de vidrio estéril. Sin embargo, dado que las llamas son peligrosas, este método puede y debe evitarse siempre que sea posible. Hemos descubierto que el flameado solo es necesario para esterilizar los lazos de inoculación y los instrumentos pequeños. No hemos podido demostrar ningún valor en incendiar las aberturas de tubos, botellas o matraces en estos experimentos.

(4) Esterilizar con alcohol

En muchos procedimientos experimentales, la forma más eficaz de esterilizar objetos es con etanol. El 95% o el 70% funcionarán. El último es en realidad más eficaz, pero el primero suele ser más conveniente. Por supuesto, se debe permitir que el alcohol se evapore o se queme antes de que el objeto se use en contacto con la levadura. Use una llama para quemar el alcohol, una vela es generalmente menos costosa y más segura que un quemador de gas. El alcohol, más que el calor, hace la esterilización, así que simplemente "encienda" el alcohol para minimizar el calentamiento y acelerar el proceso. Además, limpie el banco con alcohol antes de comenzar un experimento para eliminar el polvo cargado de moho, la fuente más común de contaminación. Si su piel no es particularmente sensible, límpiese también las manos con una pequeña cantidad de alcohol.

(5) Mantener estériles las cosas estériles

Las fuentes más comunes de contaminación durante un experimento son el polvo, proveniente de la mesa, del aire y de las personas. Esto dicta varios principios obvios:
1) Mantenga las cosas cubiertas tanto como sea posible.
2) No toque nada que entre en contacto con el cultivo y, si lo toca, esterilícelo nuevamente antes de usarlo.
3) Limpie la superficie alrededor del experimento con alcohol y minimice la turbulencia del aire.
4) Evite hablar, cantar, silbar, toser o estornudar en la dirección de cosas que deberían estar esterilizadas. El cabello largo, si no está recogido, puede ser una fuente de contaminación.
5) Mantenga un área adecuada para preparar, almacenar y usar medios estériles. Desafortunadamente, las plantas de interior, los animales y otros materiales como los medios de Drosophila, que se encuentran comúnmente en las aulas de biología, son fuentes abundantes de moho y deben mantenerse alejados del área utilizada para los procedimientos estériles.

(6) Estudie su contaminación para evitarla la próxima vez

Si algunas de sus placas de agar se contaminan, a menudo puede saber al examinar la placa cómo se produjo la contaminación. Si los contaminantes están incrustados en el agar, probablemente el contaminante se vertió con el medio. Si la contaminación está debajo del agar, podría haber estado en el plato antes de verterlo o entrar cuando se abrió la tapa para verter. Si la contaminación está en la parte superior, podría haber entrado antes de que se cerrara la tapa después de verter, mientras se abría la tapa para eliminar la condensación o mientras se inoculaba la placa.

(7) Adapte sus técnicas a sus necesidades

Una técnica estéril adecuada es esencial para el éxito de los experimentos microbiológicos, pero las precauciones excesivas pueden ser distracciones graves. Las levaduras y las bacterias requieren diferentes métodos de cultivo de tejidos. La levadura crece con fuerza, superando a la mayoría de las cosas, excepto algunos hongos filamentosos (difusos) y algunas bacterias. Los experimentos pueden contaminarse y aún no perderse cuando los estudiantes están usando levadura porque la levadura crecerá lo suficientemente bien, a pesar de la contaminación, para que los resultados de un experimento se puedan leer a través del crecimiento ofensivo. Por lo tanto, tenga mucho cuidado al preparar y verter el sustrato.

La mayoría de los experimentos de este manual utilizan uno o dos de los siguientes tipos de medios:
1) un medio nutricionalmente completo que contiene una cantidad subóptima de adenina (YED),
2) un medio nutricionalmente completo que contiene un exceso de adenina (YEAD),
3) un medio químicamente definido que carece de adenina (MV),
4) un medio químicamente definido con adenina (MV + Ade),
5) un medio de esporulación (YEKAC),
6) un medio utilizado para identificar pequeños mutantes (PETITE) y
7) un medio rico utilizado para almacenar cepas de levadura (YEPAD).

Usamos medios preparados a partir de ingredientes disponibles comercialmente. El pequeño gasto adicional de estos ingredientes está más que compensado por su uniformidad y confiabilidad. Los ahorros que pueden lograrse mediante el uso de ingredientes "caseros" son menores de lo que cabría esperar porque todavía no hemos encontrado un sustituto para el ingrediente más caro, el agar. Aunque las fuentes comunes, como varios tipos de jugos de verduras, pueden suministrar la mayoría de los demás ingredientes, hemos descubierto que el sacrificio de la reproducibilidad no está justificado.

El medio YED (extracto de levadura + dextrosa) será nuestro medio de crecimiento estándar. Se llama medio "complejo" porque está hecho de ingredientes naturales (levadura) y se desconoce su composición química exacta. Contiene todo lo que hay en la levadura, incluida la adenina, por supuesto, por lo que también es un medio "completo". Los mutantes rojos que requieren adenina crecen bien en este medio y desarrollan el pigmento rojo característico.

El medio YEAD (extracto de levadura + adenina + dextrosa) contiene los mismos ingredientes que YED pero tiene un exceso de adenina añadida. Los mutantes rojos que requieren adenina crecen bien en este medio y no Desarrollar el pigmento rojo característico.

El medio YEPAD (extracto de levadura + peptona + adenina + dextrosa) contiene los mismos ingredientes que YEAD pero tiene peptona añadida. Este es un medio muy rico que se utiliza para almacenar cepas de levadura.

El medio MV (Minimal plus Vitamins) es un medio químicamente definido, lo que significa que está compuesto por el mínimo de ingredientes químicos puros necesarios para apoyar el crecimiento de la levadura de tipo salvaje. Usaremos MV cuando necesitemos un medio que no contenga adenina.

MV + Ade medium (Minimal plus Vitamins + adenina) contiene los mismos ingredientes que MV pero tiene un exceso de adenina agregada.

YEKAC (extracto de levadura más acetato de potasio) induce diploide levadura para esporular y someterse mitosis. Está desequilibrado nutricionalmente, por lo que se producirá muy poco crecimiento.

El medio PETITE contiene glicerol como fuente de carbono y se utiliza para identificar mutantes de colonias pequeñas. Las células pequeñas no crecerán en este medio.

Recetas para medios de crecimiento de agar

Si está utilizando una mezcla preenvasada, siga las instrucciones del paquete. Si está pesando ingredientes secos, utilice las siguientes recetas. Las recetas se dan para la preparación de 100 mililitros. Si desea hacer más, simplemente multiplique las cantidades para obtener el volumen que desea. Ejemplo: para hacer 500 mililitros, multiplique cada ingrediente por 5. No ponga más de 600 mililitros en un matraz de 1000 mililitros. Si llena los contenedores demasiado, pueden hervir durante el proceso de esterilización.Se necesitan aproximadamente 25 mililitros de medio para verter una placa estándar de 100 x 15 mm. (Se pueden preparar medios líquidos a partir de estas recetas omitiendo el agar).

Medio de dextrosa de extracto de levadura (YED):

1 gramo de extracto de levadura
2 gramos de dextrosa anhidra (glucosa)
2 gramos de agar (agar-agar-goma-agar)
100 ml de agua

Medio de extracto de levadura adenina dextrosa (YEAD):

1 gramo de extracto de levadura
2 gramos de dextrosa anhidra (glucosa)
2 gramos de Agar (agar-agar-goma-agar)
8 ml de solución madre de adenina
92 ml de agua

Medio de extracto de levadura peptona adenina dextrosa (YEPAD):

1 gramo de extracto de levadura
2 gramos de peptona
2 gramos de dextrosa anhidra (glucosa)
2 gramos de Agar (agar-agar-goma-agar)
8 ml de solución madre de adenina
92 ml de agua

1 gramo de extracto de levadura
0,025 gramos de dextrosa anhidra (glucosa)
2,4 ml de glicerol
2 gramos de agar (agar-agar-goma-agar)
98 ml de agua

0,15 gramos de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos y sulfato de amonio
0,52 gramos de sulfato de amonio
2 gramos de dextrosa anhidra (glucosa)
2 gramos de agar (agar-agar-goma-agar)
100 ml de agua

Medios mínimos más adenina (MV + ade):

0,15 gramos de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos ni sulfato de amonio
0,52 gramos de sulfato de amonio
2,0 gramos de dextrosa anhidra (glucosa)
2,0 gramos de agar (agar-agar-goma-agar)
8,0 ml de solución madre de adenina
92 ml de agua

1 gramo de acetato de potasio
0,25 gramos de extracto de levadura
2 gramos de agar (agar-agar-goma-agar)
100 ml de agua

400 mg de adenina en 400 ml de agua (1 mg / ml)
Almacenar a temperatura ambiente.
Utilice 2 ml de solución madre por 100 ml de medio y reduzca 2 ml de agua añadida al medio.

Discos de papel secante de adenina

1,25 gramos de adenina
150 ml de agua destilada
discos de papel secante de arte
Agregue adenina al agua destilada en un vaso de precipitados lo suficientemente grande para que la solución no se derrame. Hervir cinco minutos. Agregue los discos de papel secante y hierva cinco minutos más. Retire los discos con unas pinzas estériles a un recipiente cubierto estéril, como una placa de Petri. Colócalos en una sola capa y déjalos secar durante varios días.

Para muchos de los experimentos a corto plazo, es posible "esterilizar" el agua hirviéndola.
1) coloque el agua en un recipiente ligeramente tapado,
2) coloque el recipiente en una olla con agua hirviendo durante 15 minutos,
3) después de que se enfríe, apriete la tapa del recipiente de agua.

Probablemente una mejor manera de preparar agua esterilizada es colocar los recipientes de agua sin cubrir en un autoclave o olla a presión y luego esterilizar el agua en las mismas condiciones que se usan para los medios de cultivo.

F.Temperatura de incubación y tasas de crecimiento

La temperatura de crecimiento óptima para estas cepas es de aproximadamente 30 ° C, pero crecerán de manera bastante satisfactoria en un rango mucho más amplio. Todos estos experimentos se pueden realizar a una temperatura ambiente agradable, pero la levadura tolera casi cualquier temperatura que la gente pueda. Sin embargo, la temperatura afectará la tasa de crecimiento. A temperaturas más bajas, las células crecerán más lentamente y la velocidad debe determinarse mediante experimentos. Los tiempos de incubación estimados en estos experimentos se basan en la incubación a temperaturas dentro de uno o dos grados de 30 ° C.

De hecho, se puede ralentizar la levadura enfriándola para que los experimentos encajen en los horarios de clase. Simplemente refrigere o simplemente enfríe los platos en diferentes etapas para ralentizar el crecimiento. Sin embargo, tenga en cuenta que después de que un cultivo se haya refrigerado, puede haber un período de retraso de varias horas antes de que comience a crecer nuevamente. Por supuesto, si ha alcanzado la fase estacionaria, no crecerá más a ninguna temperatura.

Las cepas de levadura se pueden almacenar durante períodos prolongados en el refrigerador a temperaturas justo por encima del punto de congelación. Algunas cepas seguirán creciendo, aunque muy lentamente, a estas temperaturas, pero la mayoría seguirá siendo viable durante semanas o meses, y algunas durante años.

Deben evitarse temperaturas superiores a 30 ° C. Aunque las células crecerán a temperaturas más altas, acumulan pequeñas mutaciones indeseables y la esporulación se inhibe fuertemente. El pigmento rojo en los mutantes de adenina también se inhibe a temperaturas más altas. Es más seguro incubar cultivos que se esporulan a una temperatura ambiente agradable.

Incubar los cultivos en la oscuridad o con luz reducida tanto como sea conveniente. Aunque no es crítico, la exposición prolongada a la luz normal de la habitación o una luz más brillante reducirá la viabilidad de las células que contienen el pigmento rojo. La cepa sensible a los rayos UV G948-1C / U no debe tener una exposición prolongada a fuentes de luz.

Para un crecimiento óptimo y para que se desarrolle el pigmento rojo, las placas deben ser aeróbicas. Incubamos los platos en bolsas de plástico abiertas para almacenar alimentos. Hay suficiente oxígeno disponible con las bolsas abiertas para apoyar la respiración aeróbica. Las bolsas de plástico evitan que los platos se sequen demasiado rápido, los protegen de la contaminación y facilitan su transporte sin que se derramen.

G. Uso de palillos de dientes y asas de inoculación

Para la mayoría de los propósitos, la forma más fácil de mover la levadura de un lugar a otro en medio de agar es con un palillo de dientes estéril. El palillo de dientes de estilo plano es más fácil de usar que el de estilo redondo. El extremo puntiagudo es útil para tomar muestras de colonias individuales o para hacer pequeñas manchas o rayas. El extremo plano es bueno para esparcir la levadura, para esparcirla para aislar colonias individuales y para mezclar. Los palillos de dientes son estériles directamente de la caja siempre que la caja no esté contaminada. Simplemente corte una esquina para hacer un pequeño agujero (aproximadamente de 1/4 a 1/2 pulgada de ancho) y la caja servirá como dispensador. Los palillos de una caja apuntan en ambas direcciones, pero puede seleccionar fácilmente el extremo que prefiera para cualquier tarea. Por supuesto, uno debe tener cuidado de manipular cada palillo solo por el extremo que no toque la levadura o el medio.

El palillo de dientes es una alternativa al asa de inoculación tradicional, que está disponible comercialmente, incluso en platino. Hacemos nuestros propios bucles de inoculación a partir de una pieza de varilla de latón de 6 a 8 pulgadas (como se usa para soldar) y alambre de nicromo. Taladre un pequeño orificio cerca del extremo de la varilla para anclar el cable, inserte el extremo del cable en el orificio, enrolle varias vueltas alrededor de la varilla y deje una pulgada o dos de alambre recto. Al final de la parte recta, forme un lazo con un par de alicates de punta fina. Flame el alambre en un mechero Bunsen hasta que se ilumine en rojo para esterilizarlo antes de cada uso y, por supuesto, déjelo enfriar antes de que toque (o fríe) la levadura. Tocarlo con el agar lo enfría inmediatamente.

Hay varias formas de propagar las células. Utilizan varios tipos de equipos de pipeteo y varios métodos para mover las células sobre la superficie del agar.
Método de recubrimiento cuantitativo por vertido
Este método requiere la preparación de un tubo de dilución final separado para cada placa y luego se vierte todo el contenido del tubo sobre la superficie del agar. Este método tiene la ventaja de no requerir el uso de una llama. Tiene la desventaja de no ser tan reproducible.

1. Haga una serie de diluciones de 1 a 10 de suspensiones de células de levadura.
2. Pipetee 0,1 ml de la suspensión adecuada en un tubo estéril que contenga 0,9 ml de agua estéril. Gire el tubo para suspender las células y luego vierta todo el contenido del tubo sobre la superficie del medio de agar. Incline y gire la placa para distribuir uniformemente la suspensión sobre la superficie del agar.
3. Si hay manchas que no se cubren, use un palillo de dientes estéril para esparcir la suspensión sobre las áreas descubiertas.

La suspensión debe ser se deja empapar en el agar antes de que las placas se expongan al tratamiento experimental. Para acelerar el proceso, haga las placas de agar con varios días de anticipación y deje que se sequen un poco antes de verter la suspensión de levadura.

La sección de video Dilución en serie y recuentos de células viables ilustra el método de vertido en placas.

Método de difusión cuantitativo
Cuando desee datos precisos, es mejor utilizar un método de recubrimiento alternativo. La suspensión celular se pipetea con precisión sobre la superficie del agar y luego se extiende con un esparcidor estéril. Hay dos tipos de esparcidores:

Esparcidor de clip de papel sin llama
Puede hacer fácilmente un esparcidor reutilizable económico al enderezar dos curvas en un clip grande, dejando un extremo en forma de horquilla para extender y un mango recto en ángulo recto. Puede esterilizar varios esparcidores juntos en vasos de precipitados cubiertos o envueltos en papel de aluminio o papel.
Esparcidor de vidrio flameado
Si tiene el equipo y las habilidades para trabajar con varilla de vidrio, puede hacer un esparcidor de vidrio simple calentando y doblando una sección de una pulgada al final de un trozo corto de varilla de vidrio. Estos esparcidores también se pueden comprar.

1. Haga una serie de diluciones de 1 a 10 de suspensiones de células de levadura.
2. Utilice una punta de pipeta nueva para pipetear 0,1 ml de la suspensión adecuada sobre la superficie del agar. Golpee el tubo antes de tomar la muestra. Si está haciendo varias placas, puede pipetear células en cada placa con la misma punta de pipeta y luego esparcirlas sin quemar el esparcidor entre cada placa.
3. Esterilice el esparcidor en etanol al 95% y luego páselo por una llama para encender el alcohol. Sostenga el esparcidor con cuidado hasta que todo el alcohol en el esparcidor se queme por completo. El uso de llamas de alcohol es un paso peligroso y requiere cuidado y supervisión cercana por parte del maestro.
4. Enfríe el esparcidor tocándolo con el agar. Use el lado plano para extender la suspensión sobre la superficie y luego use la parte curva del esparcidor para hacer trazos superpuestos. Gire la placa 90 grados y repita el proceso de hacer trazos superpuestos. La tapa se puede sostener sobre la placa para minimizar la contaminación. Evite esparcir la suspensión hasta el borde donde pueda escurrirse entre el agar y el costado de la placa de Petri.

La sección de video Usando levadura para medir los rayos UV solares, ilustra un método de recubrimiento con esparcidor de vidrio flameado.

Método de enchapado de vertido cualitativo para producir céspedes de células
Este método produce un crecimiento espeso y uniforme de células (césped) sobre la superficie de la placa de agar. Este es un método rápido y es útil para una variedad de experimentos cualitativos.

1. Haga una suspensión turbia de células de levadura.
2. Pipetee 1,0 ml de la suspensión sobre la superficie del medio de agar. Incline y gire la placa para distribuir uniformemente la suspensión sobre la superficie del agar.
3. Si hay manchas que no se cubren, use un palillo de dientes estéril para esparcir la suspensión sobre las áreas descubiertas.

Al igual que en el método de recubrimiento por vertido cuantitativo, la suspensión debe ser se deja empapar en el agar antes de que las placas se expongan al tratamiento experimental. Si haces las placas de agar con varios días de anticipación y dejas que se sequen un poco antes de verter la suspensión de levadura, acelerarás el proceso.

Sección de video Efecto de la radiación solar ultravioleta en las células ilustra el método de vertido de enchapado para un césped.

Micropipetas automáticas, pipetas serológicas y pipetas de bulbo desechables

Las pipetas automáticas son los caballos de batalla de la biología molecular y la microbiología modernas. Son rápidos y precisos, y ahorran una gran cantidad de tiempo y frustración. Los experimentos de este manual a menudo requieren el uso de una pipeta de 0,1 ml. Aunque son relativamente costosos, hacen el trabajo tan rápido que varios estudiantes o grupos de laboratorio pueden compartir uno fácilmente. Lo usará para hacer diluciones en serie y para sembrar células en agar. Las puntas estériles están empaquetadas en dispensadores de plástico reutilizables. Practique el uso de la pipeta con agua hasta que se sienta cómodo con ella. (Si no se dispone de micropipetas automáticas, es posible sustituir pipetas de bulbo desechables, pipetas serológicas o tubos capilares graduados)

1. Presione firmemente el extremo pequeño de la pipeta en el extremo abierto de una punta mientras la punta todavía está en el dispensador.
2. Para llenarlo, presione lentamente el émbolo hasta que sienta resistencia, pero no tanto como sea posible. Sumerja la punta en la solución y luego suelte lentamente el émbolo. Si alguna gota se adhiere a la punta, límpiela en el borde del recipiente.
3. Coloque la punta en el líquido del tubo en el que está pipeteando y presione lentamente el émbolo. Esta vez presiónelo todo lo posible para expulsar toda la muestra. Retire la punta de la pipeta de la solución, suelte el émbolo y deseche la punta.

Se pueden utilizar pipetas serológicas y bombas de pipeta en lugar de pipetas automáticas. Estas pipetas darán medidas de volumen muy precisas. Es posible comprar pipetas serológicas preesterilizadas en varios tamaños. Debe tener un juego de bombas de pipeta disponible para que los estudiantes las utilicen con estas pipetas. Recuerde que nunca es una buena práctica usar la boca para introducir líquido en una pipeta. ¡Ni siquiera agua esterilizada!

Las pipetas con bulbo desechables también son aceptables para la mayoría de los experimentos de este manual. Tres gotas de una pipeta con bulbo de un mililitro equivalen aproximadamente a 0,1 ml. Las mediciones de volumen no son tan precisas, pero estas pipetas son económicas y no requieren el uso de bombas de pipeta. Estas pipetas también se pueden comprar preesterilizadas y envueltas individualmente. Los envoltorios de las pipetas preesterilizadas proporcionan un práctico soporte estéril para la pipeta durante el procedimiento experimental.

J. Hacer un subcultivo de levadura

Los nutrientes de la levadura pueden ser suministrados por un medio sólido o líquido. Cuando las cepas de levadura provienen de un proveedor, generalmente crecen en agar inclinados. Si mantiene estas inclinaciones bien cerradas y refrigeradas, puede almacenarlas hasta por un año. Las inclinaciones más pequeñas le permiten usar palillos de dientes para mover la levadura. Es mejor tener cultivos frescos para sus experimentos. Por lo tanto, el día antes de que tenga la intención de usar la levadura, transfiera una pequeña cantidad de células del cultivo madre al medio fresco (generalmente YED). Puede usar un asa flameada para transferir las células, pero un palillo estéril suele ser más fácil. Toque con el palillo las celdas en la inclinación, no es necesario transferir muchas celdas. Haga una raya de células en la superficie del agar y trate de no perforar la superficie del agar. Este procedimiento de cultivo de levadura fresca se llama subcultivo. Debe realizar un subcultivo al menos 12 horas antes de que desee utilizar la levadura.

A veces, los cultivos se enviarán desde centros de stock de levadura en papel de leche. Para hacer un nuevo subcultivo: Abra la lámina de forma estéril y, con unas pinzas estériles, coloque el pequeño cuadrado de papel de leche en una placa YED de agar estéril. Si pasa el papel por el agar varias veces, debería obtener colonias individuales para usar y crecerá una gran cantidad de células donde se coloca el papel. Muchas cepas cultivadas de esta manera tardarán de 3 a 5 días en alcanzar un tamaño adecuado. Las culturas enviadas de esta manera son menos vulnerables a las inclemencias del tiempo y a los largos tiempos de viaje.

K. Aislamiento de colonias individuales

Muchos experimentos requieren el crecimiento de colonias a partir de células individuales aisladas. Esto se logra fácilmente esparciendo los cultivos en una placa de agar con el extremo plano de un palillo de dientes. El propósito de la técnica es diluir las células en la superficie del agar en sucesivas rayas superpuestas, hasta que las células individuales se separen o distribuyan para formar colonias individuales aisladas. La siguiente figura ilustra la técnica, que debe practicar hasta que sea competente.

El primer paso es hacer una sola línea corta de células (de unos 2 cm de largo) cerca del borde del agar en una placa de Petri. Con un palillo de dientes nuevo, haga una segunda franja superpuesta, en un ángulo de aproximadamente 15 grados con respecto a la primera, arrastrando las células de la primera franja a agar fresco. Haz varias rayas más paralelas con el mismo palillo. Luego, tome un palillo nuevo y repita el proceso comenzando dentro del final de la última racha. Repita esta secuencia hasta cubrir todo el plato. Dado que la población de células que se produce a partir de una sola célula madre es un clon, este es un proceso de clonación de levadura. Si un cultivo no es puro, por cualquier motivo, esto proporciona un método para aislar clones puros. Se puede lograr el mismo resultado usando un bucle flameado y enfriado en cada paso donde se usa un palillo nuevo. Este enfoque es más lento y corre el riesgo de freír las células.

En algunos experimentos, transferimos muchos cultivos de un tipo de medio a uno o varios otros tipos, para determinar los requisitos de crecimiento de los cultivos. Esto se puede hacer usando palillos de dientes o lazos, pero si hay muchas cepas para transferir, se vuelve laborioso. Un método simple y rápido, la replicación en placas, jugó un papel importante en el desarrollo de la genética microbiana y es uno de los grandes ahorradores de mano de obra de todos los tiempos. Los experimentos que se describen a continuación se pueden realizar sin esta técnica, pero es fascinante y vale la pena configurarla. Incluso con experimentos modestos, el esfuerzo es una buena inversión a largo plazo.

El principio de la reproducción enchapado es el de un sello de goma.

Se utiliza un sello de terciopelo de algodón para sellar una réplica del patrón de células que crecen en una placa a una o varias placas más. El aparato consiste en un soporte cilíndrico para el terciopelo que es del tamaño adecuado para caber dentro del fondo de una placa de Petri, y un anillo de algún tipo para mantener el terciopelo en su lugar. Para placas de plástico estándar de 10 cm, el diámetro apropiado es de aproximadamente 3,3 pulgadas. El soporte puede ser un cilindro de madera, metal, plástico o cualquier otro material que puedas fabricar. Incluso puede ser una lata de comida de una libra u otro recipiente cilíndrico pesado si el fondo es plano. (Un círculo cortado de una bandeja de espuma para carne es una buena superficie plana para colocar en una lata de comida) El anillo para sujetar el terciopelo puede ser una abrazadera de manguera grande, algún otro objeto encontrado o incluso una banda de goma grande.

El terciopelo, por supuesto, debe esterilizarse, y el terciopelo de algodón recién cortado por lo general debe deslindarse con un trozo de cinta adhesiva antes de esterilizarlo. Esterilizar y secar bien. Usamos cuadrados de seis pulgadas, que apilamos y envolvemos en papel, los colocamos en autoclave y luego los secamos al vacío. Si no dispone de autoclave, séquelos en un horno caliente o déjelos reposar sobre la encimera hasta que se sequen. Para reutilizar los cuadrados de terciopelo, enjuáguelos con agua corriente y vuelva a esterilizar. Se pueden utilizar otras telas, como varias capas de gasa de algodón, en lugar de terciopelo de algodón.

Para reproducir la placa, invierta la placa maestra, la que tiene la levadura, sobre el terciopelo del soporte y presione la placa firmemente contra la superficie de la tela estéril. Luego, despegue lentamente la placa, dejando una réplica o impresión del patrón de celda en el terciopelo. Transfiera la réplica del terciopelo a una o una serie de platos estériles presionando cada plato suavemente sobre el terciopelo y retirándolo. Es posible hacer hasta 20 réplicas de una sola placa maestra si es necesario. El procedimiento se ilustra en la Figura 13.

La forma en que se quita el plato del terciopelo controla la cantidad de levadura transferida del terciopelo al plato o del plato al terciopelo. Si quita la placa maestra del terciopelo con un movimiento lento y giratorio, quedará más levadura en el terciopelo que si lo quita con un movimiento vertical rápido. Es deseable transferir la menor cantidad de células posible y aún poder ver la impresión de las células en la placa de réplica.

M. Estimación del número de células de levadura en un cultivo

Hay muchas formas de contar las células directamente, la más común haciendo uso de cámaras de conteo para el microscopio o contadores electrónicos de partículas. Estos tienen poco valor instructivo en genética y no son adecuados para uso general en el aula.Por lo tanto, hemos diseñado experimentos que no dependen de recuentos precisos de partículas. Cuando se necesitan recuentos de células, los determinamos a partir del número de colonias en las placas (ver Procedimientos de dilución y galvanoplastia).

Sin embargo, muchos experimentos requieren hacer estimaciones aproximadas del número de células en una suspensión líquida para obtener un número razonable de colonias en placa. Para ello utilizará uno de los instrumentos ópticos más sofisticados y sensibles que existen: el ojo humano. Con sorprendentemente poca práctica, puede aprender a estimar la cantidad de células en una suspensión con solo mirarla.

La estimación visual de la densidad celular se basa en el umbral bastante nítido del ojo para observar la turbidez. Cuando se observan en un tubo estándar de 13 x 100 mm, las suspensiones de levadura de menos de aproximadamente 1 millón de células por ml no son visiblemente turbias. Por encima de este umbral de densidad, están visiblemente nublados. Ajustando el número de células en una suspensión hasta apenas visible, puede obtener una suspensión de densidad conocida (aproximadamente 1 x 106 células / ml) y luego usar diluciones seriadas para obtener otras concentraciones. (Ver también el experimento Diluciones en serie y recuentos de células viables)

  • Tubos de cultivo estériles y tapados de 13 x 100 ml
  • Agua esteralizada
  • Pipetas estériles de 1 ml (pipetas de bulbo desechables o pipetas serológicas y bomba de pipeta)
  • Micropipeta y puntas estériles (opcional)

Procedimiento:
una. Coloque de 1 a 2 ml de agua esterilizada en un tubo.
B. Use un asa de inoculación flameada enfriada o un palillo de dientes estéril para suspender una pequeña cantidad de levadura, aproximadamente del tamaño de la cabeza de un alfiler, en el agua.
C. Mezcle bien la suspensión sosteniendo el tubo sin apretar cerca de su parte superior entre el pulgar y el índice, y golpeándolo cerca de la parte inferior con el lado de la palma de uno o más dedos de la otra mano, impartiendo un movimiento giratorio. (El movimiento de golpe se aproxima al gesto que uno haría para llamar a alguien para que venga aquí).
Esta suspensión debe contener aproximadamente 1 x 107 células / ml, pero esta densidad es difícil de juzgar, por lo que la diluiremos antes de juzgar su densidad.
D. Pipetee 0,9 ml de agua estéril en un tubo con una pipeta estéril de 1,0 ml.
mi. Diluya 0.1 ml de su suspensión celular en este tubo y golpéelo. Compárelo con un tubo que contiene agua esterilizada. Si el tubo con células está apenas turbio, entonces contiene casi 1 x 106 células / ml.
F. Si el tubo no está visiblemente turbio, agregue volúmenes adicionales de 0.1 ml de la suspensión original hasta que lo esté. Si cree que está más turbio que el límite de visibilidad, agregue más agua esterilizada. Ajuste los volúmenes de agua y células hasta que esté convencido. Lleve un registro de los volúmenes que agrega para saber la dilución final que ha realizado.

N. Procedimientos de dilución y enchapado

En muchos experimentos, uno debe esparcir un número aproximadamente conocido de células en una placa para que crezcan en colonias. Usamos diluciones en serie, haciendo varias diluciones pequeñas, una tras otra, en lugar de hacer una gran dilución. El método ahorra material y evita el uso de grandes volúmenes que son difíciles de medir y esterilizar.

  • Tubos de cultivo estériles y tapados de 13 x 100 ml
  • Agua esteralizada
  • Pipetas estériles de 1 ml (pipetas de bulbo desechables o pipetas serológicas y bomba de pipeta)
  • Micropipeta y puntas estériles (opcional)
  • Clip de papel o esparcidor de vidrio: Las células se distribuyen por la superficie del agar con esparcidores.

Hacer diluciones en serie:
El siguiente procedimiento produce una serie de diluciones que varían en factores de diez. Podrá utilizar este procedimiento para la mayoría de los experimentos que requieren diluciones en serie (Figura 12).

una. Prepare una suspensión que contenga aproximadamente 1 x 106 células / ml en agua estéril utilizando el procedimiento descrito en Estimación del número de células de levadura en un cultivo.
B. Pipetee 0,9 ml de agua esterilizada en cada uno de los tres tubos y etiquételos. Recomendamos hacer un diagrama en su cuaderno que muestre el procedimiento y el significado de sus etiquetas.
C. Resuspenda las células en la suspensión original. Retirar 0,1 ml con la micropipeta y una punta nueva y transferirlo a uno de los tubos de agua. Luego golpee el tubo para suspender las células.
D. Repita el procedimiento en serie, utilizando una pipeta nueva o una punta de pipeta para cada uno de los tubos restantes, de modo que cada tubo contenga una décima parte del número de células que el anterior. La tercera dilución debe contener aproximadamente 1 x 103 células / ml.

Chapado de las diluciones:
Si espera que todas las células crezcan, solo colocará en placa la dilución final, ya que los otros tubos estarían demasiado concentrados y las placas hechas con ellos contendrían demasiadas colonias para contar. Sin embargo, en los experimentos de radiación, utilizará las diluciones que contienen más células para compensar el número reducido de células que sobreviven a la irradiación. De esta forma obtendrás un número óptimo de colonias para contar en cada placa, incluso cuando la mayoría de las células estén muertas.

mi. Tendrá mejores datos si hace todos los enchapados por duplicado o triplicado. Primero etiquete las placas con un rotulador (un Pilot SC-UF o un Sharpie). (También utilizará este mismo tipo de bolígrafo para marcar las colonias cuando las cuente). Le recomendamos que identifique cada placa con el número de cepa, la dosis (para experimentos de radiación), la placa de dilución y sus iniciales, pero puede que prefiera para codificar esta información en sus notas y poner las letras o números del código en la placa. Escriba solo en la tapa o en letras minúsculas en el borde del fondo, dejando el fondo despejado para marcar las colonias cuando las cuente.

F. Resuspenda las células en cada tubo golpeándolo antes de tomar una muestra, luego pipetee 0.1 ml en el centro de cada una de las placas duplicadas. Si está utilizando esparcidores de clip de papel, saque un esparcidor estéril del sobre. Si está utilizando un esparcidor de vidrio, retírelo del alcohol, enciéndalo en una llama y, después de que la llama se apague, toque el agar de una de las placas alejadas de las células. Extienda las células sobre la superficie con cualquier esparcidor, teniendo cuidado de mantener las células al menos a 0,5 cm del borde del agar. (Si está utilizando el método de vertido en placa, pipetee 0,1 ml de la suspensión en 0,9 ml de agua estéril. Mezcle las células en el agua. Vierta toda la mezcla sobre la superficie del agar, luego incline y gire la placa hasta que la mezcla se distribuya uniformemente sobre la superficie del agar.)

O. Examen microscópico de levadura

La forma más fácil de examinar las levaduras bajo el microscopio es mirarlas directamente en la placa. Esto solo funciona con objetivos de baja potencia (10x) porque los de mayor potencia se acercan demasiado al agar y se empañan. Para ver más detalles, haga una diapositiva de montaje en húmedo. Ponga una gota de agua en un portaobjetos de microscopio. Transfiera una pequeña cantidad de levadura al agua con un palillo de dientes estéril y revuelva un poco. Luego coloque un cubreobjetos sobre la suspensión de levadura en el portaobjetos. Si varios estudiantes van a ver los preparativos, selle el cubreobjetos al portaobjetos con esmalte de uñas y el portaobjetos se podrá ver durante varias horas. La inmersión en aceite no debería ser necesaria y por meramente observar las formas de las células no es necesario teñirlas. Con métodos de tinción adecuados, se puede ver el núcleo, pero la levadura cromosomas son demasiado pequeños para verlos con la mayoría de los microscopios ópticos.

Para las demostraciones en el aula, es posible que desee utilizar un microscopio de vídeo. Hay varios microscopios de vídeo muy buenos disponibles en el mercado. Si no tiene uno, es posible obtener muchos de los mismos resultados con un microscopio de aula y una cámara de video doméstica. Cuando miramos a través de un microscopio, nuestros ojos se enfocan en el infinito. Si colocamos una cámara de video cerca del ocular del microscopio y ajustamos el enfoque de la cámara al infinito, "verá" lo mismo que nuestros ojos. Ayuda a cortar la luz que entra por el costado envolviendo la lente de la cámara y el ocular del microscopio con un trozo de tela oscura o papel de aluminio.

Los experimentos utilizan las siguientes cepas:

Q. Irradiación de levadura con radiación ultravioleta

Las lámparas UV-C germicidas estándar, que son tubos de descarga de vapor de mercurio a baja presión, son una fuente de luz ultravioleta ideal para irradiar levadura de tipo salvaje con enzimas normales de reparación del ADN. El sol o las luces de patio halógenas de cuarzo son buenas fuentes de rayos ultravioleta para irradiar cepas mutantes de levadura que son deficientes en las enzimas normales de reparación del ADN.

Las lámparas UV-C germicidas estándar son tubos fluorescentes comunes sin una capa fluorescente y con una envoltura que es transparente a los rayos ultravioleta. El espectro de mercurio de baja presión es un espectro de líneas con la línea más prominente que tiene una longitud de onda de 253,7 nanómetros. Esto está fortuitamente cerca de los 260 nanómetros que es óptimo para la absorción por ADN.

El diseño de la U.V. La cámara de radiación se rige por varias consideraciones, la más importante es la seguridad. (Ver Instrucciones para construir una cámara de radiación ultravioleta) La radiación emitida por las lámparas germicidas provocará quemaduras dolorosas y peligrosas en los ojos y la piel, por lo que deben protegerse eficazmente. La exposición a las células no se puede controlar encendiendo y apagando la lámpara porque la intensidad de salida de la lámpara depende en gran medida de la temperatura. Por lo tanto, debe estar encerrado en una caja blindada con un mecanismo de obturación para que pueda calentarse a una temperatura constante antes de ser utilizado. La puerta y la contraventana deben estar enclavadas para que no puedan abrirse al mismo tiempo.

Procedimiento operativo para cámara de radiación UV:

1. Enchufe la lámpara y enciéndala. Puede saber con seguridad cuándo la lámpara está encendida al ver la luz indicadora.
2. Deje que la lámpara se caliente durante 30 minutos, si es posible.
3. Centre la placa de Petri para exponerla en la marca en la parte inferior de la caja, retire la tapa de la placa, baje suavemente la puerta y abra el obturador. Mida el tiempo de exposición desde que se abrió el obturador. Cuando haya transcurrido el tiempo, cierre la persiana, levante suavemente la puerta, coloque la tapa en la placa de Petri y retírela. Mover la puerta demasiado rápido provoca turbulencias de aire que probablemente causen contaminación de las placas de agar. Si la caja está equipada con una lámpara UV-B, se puede seguir el mismo procedimiento.

Procedimiento de exposición con luz solar o halógena de cuarzo:

1. Cubra el plato con papel oscuro y mientras permanece cubierto coloque el plato en un ángulo de 90 grados con respecto a la fuente de luz. Si está utilizando una luz halógena de cuarzo, retire la cubierta de vidrio de la luz. Si bien el sol y la luz del jardín producen menos radiación ultravioleta que el tubo germicida, se deben tomar precauciones razonables. No mire directamente a la fuente y evite cualquier exposición directa a largo plazo de la piel.

PRECAUCIÓN: Una bombilla halógena de cuarzo se calienta mucho. El uso de esta lámpara debe estar bajo la supervisión directa del maestro.

2. Retire la cubierta oscura de la placa y comience a medir el tiempo de exposición. Cuando haya transcurrido el tiempo tapar el plato y llevarlo a la incubadora. Por lo general, no es necesario quitar la tapa de las placas de Petri de plástico cuando utiliza el sol o las luces de jardín halógenas de cuarzo como fuente de rayos ultravioleta. La mayoría de las placas de Petri de plástico son transparentes a las longitudes de onda de los rayos UV producidos por estas fuentes. Es posible que desee realizar un experimento de prueba en cada nuevo lote de placas de Petri. Si está obteniendo tasas de supervivencia más altas de lo esperado, es posible que desee quitar las tapas durante la exposición a los rayos UV. Si la contaminación se convierte en un problema, es posible que desee cubrir los platos con una envoltura de plástico delgada o una bolsa para sándwiches. Estas finas películas de plástico no absorberán cantidades significativas de rayos UV.


Colonización y autogobierno temprano

El comienzo del siglo XVII encontró a tres países —Francia, España e Inglaterra— compitiendo por el dominio de América del Norte. De estos Inglaterra, el más tardío en la escena, finalmente se hizo con el control de los inicios de lo que hoy es Estados Unidos. Los franceses, preocupados por las guerras extranjeras y las disputas religiosas internas, durante mucho tiempo no se dieron cuenta de las grandes posibilidades del nuevo continente, y sus asentamientos en el valle de San Lorenzo se debilitaron. Los españoles estaban preocupados por América del Sur y las tierras bañadas por el Caribe y el Golfo de México. Pero los ingleses, después de los fracasos iniciales de Sir Humphrey Gilbert y Sir Walter Raleigh, establecieron asentamientos firmes desde Maine hasta Georgia, los nutrieron con un flujo constante de personas y capital, y pronto absorbieron la pequeña empresa colonizadora de los holandeses en el Hudson Valley y el pequeño esfuerzo sueco en el río Delaware. En un siglo y medio, los británicos tenían 13 colonias florecientes en la costa atlántica: Massachusetts, Nueva Hampshire, Rhode Island, Connecticut, Nueva York, Pensilvania, Delaware, Nueva Jersey, Maryland, Virginia, Carolina del Norte, Carolina del Sur y Georgia.

En poco tiempo, los colonos avanzaron desde la franja de Tidewater hacia los Apalaches y finalmente cruzaron las montañas por Cumberland Gap y el río Ohio. Década tras década se volvieron menos europeos en hábitos y perspectivas y más estadounidenses; la frontera en particular les marcó. Su libertad de la mayoría de las herencias feudales de Europa occidental, y la autosuficiencia que necesariamente adquirieron al someter la naturaleza, los hizo sumamente individualistas.


Vectores de expresión: 5 cosas que debe conocer | Clonación

Con frecuencia es el producto del gen clonado, más que el gen en sí, lo que es de interés principal, particularmente cuando la proteína tiene valor comercial, terapéutico o de investigación.

Con una mayor comprensión de los fundamentos del ADN, el ARN y el metabolismo de las proteínas y su regulación, los investigadores ahora pueden manipular células para expresar genes clonados con el fin de estudiar sus productos proteicos.

Los vectores de expresión se diseñan para que cualquier inserto clonado pueda transcribirse en ARN y, en muchos casos, incluso traducirse en proteína. Pueden construirse bibliotecas de expresión de ADNc en vectores especialmente diseñados derivados de plásmidos o bacteriófagos l.

Las proteínas codificadas por los diversos clones de ADNc dentro de tales bibliotecas de expresión pueden sintetizarse en las células hospedadoras y, si se dispone de ensayos adecuados para identificar una proteína particular, su clon de ADNc correspondiente puede identificarse y aislarse. Se encuentran disponibles vectores de expresión diseñados para expresión de ARN o expresión de proteínas, o ambas.

Cosa # I. Expresión de ARN:

Puede construirse un vector para la expresión in vitro de inserciones de ADN como transcripciones de ARN colocando un promotor altamente eficaz junto a un sitio de clonación versátil. La figura 4.14 representa un vector de expresión de este tipo. El ADN del vector recombinante linealizado se transcribe in vitro usando ARN polimerasa SP6. Se pueden obtener grandes cantidades de producto de ARN de esta manera si se usan ribonucleótidos radiactivos como sustratos, se preparan moléculas de ARN marcadas útiles como sondas.

Cosa # II. Expresión de proteínas:

Debido a que los ADNc son copias de ADN de los ARNm, los ADNc son copias ininterrumpidas de los exones de los genes expresados. Debido a que los ADNc carecen de intrones, es factible expresar estas versiones de ADNc de genes eucariotas en huéspedes procariotas que no pueden procesar las complejas transcripciones primarias de genes eucariotas. Para expresar una proteína eucariota en E. coli, el cDNA eucariota debe clonarse en un vector de expresión que contenga señales reguladoras tanto para la transcripción como para la traducción.

Por consiguiente, un promotor en el que la ARN polimerasa inicia la transcripción, así como un sitio de unión al ribosoma para facilitar la traducción, se diseñan en el vector justo aguas arriba del sitio de restricción para insertar ADN extraño. El codón de iniciación AUG que especifica el primer aminoácido de la proteína (el sitio de inicio de la traducción) lo aporta el inserto (fig. 4.15).

Se han construido fuertes promotores que impulsan la síntesis de proteínas extrañas a niveles iguales al 30% o más de la proteína celular total de E. coli. Un ejemplo es el promotor híbrido, ptac, que se creó fusionando parte del promotor de los genes de E. coli que codifican las enzimas del metabolismo de la lactosa (el promotor lac) con parte del promotor de los genes que codifican las enzimas de la biosíntesis de triptófano ( el promotor trp) (Fig. 4.16).

En las células que portan vectores de expresión ptac, no se induce al promotor ptac para que dirija la transcripción del inserto extraño hasta que las células se exponen a inductores que conducen a su activación. Los análogos de lactosa (un β-galactósido) como el isopropil-β-tiogalactósido, o IPTG, son excelentes inductores de ptac. Por tanto, la expresión de la proteína extraña se controla fácilmente. La producción bacteriana de valiosas proteínas eucariotas representa uno de los usos más importantes de la tecnología del ADN recombinante.

Por ejemplo, la insulina humana para el tratamiento clínico de la diabetes ahora se produce en bacterias. Los sistemas análogos para la expresión de genes extraños en células eucariotas incluyen vectores que llevan elementos promotores derivados de virus de mamíferos, tales como el virus simio 40 (SV40), el virus de Epstein-Barr y el citomegalovirus humano (CMV).

Un sistema para la expresión de alto nivel de genes extraños utiliza células de insectos infectadas con el vector de expresión de baculovirus. Los baculovirus infectan insectos lepidópteros (mariposas y polillas). En los vectores de baculovirus modificados genéticamente, el gen extraño se clona aguas abajo del promotor de la polihedrina, una proteína estructural codificada por el virus principal, y el vector recombinante que se incorpora puede conducir a la acumulación del producto del gen extraño a niveles tan altos como 500 mg / l.

Cosa # III. Detección de bibliotecas de expresión de ADNc con anticuerpos:

A menudo se encuentran disponibles anticuerpos que reaccionan específicamente de forma cruzada con una proteína particular de interés. Si es así, estos anticuerpos pueden usarse para cribar una biblioteca de expresión de ADNc para identificar y aislar clones de ADNc que codifican la proteína. La biblioteca de ADNc se introduce en bacterias hospedadoras, que se cultivan en placas y se cultivan durante la noche, como en el esquema de hibridación de colonias descrito anteriormente.

Se colocan membranas de nailon que se unen al ADN en las placas para obtener una réplica de las colonias bacterianas. A continuación, la membrana de nailon se incuba en condiciones que inducen la síntesis de proteínas a partir de los insertos de ADNc clonados y las células se tratan para liberar la proteína sintetizada.

La proteína sintetizada se une firmemente a la membrana de nailon, que luego se puede incubar con el anticuerpo específico. La unión del anticuerpo a su producto de proteína diana revela la posición de cualquier clon de ADNc que exprese la proteína, y estos clones pueden recuperarse de la placa original. Al igual que otras bibliotecas, las bibliotecas de expresión también se pueden cribar con sondas de oligonucleótidos.

Cosa # IV. Expresión de proteína de fusión:

Algunos vectores de expresión llevan insertos de ADNc clonados directamente en la secuencia codificante de un gen que codifica una proteína transmitida por un vector (fig. 4.17). La traducción de la secuencia recombinante conduce a la síntesis de una proteína híbrida o proteína de fusión. La región N-terminal de la proteína fusionada representa secuencias de aminoácidos codificadas en el vector, mientras que el resto de la proteína está codificado por el inserto extraño.

Tenga en cuenta que la secuencia de codones del triplete dentro del inserto clonado debe estar en fase con los codones aportados por las secuencias del vector para producir la proteína correcta. La secuencia de la proteína N-terminal aportada por el vector se puede elegir para satisfacer los propósitos. Además, la adición de una secuencia señal N-terminal que se dirige a la proteína híbrida para la secreción de la célula simplifica la recuperación de la proteína de fusión.

Se han desarrollado una variedad de sistemas de fusión de genes para facilitar el aislamiento de una proteína específica codificada por un inserto clonado. Los procedimientos de aislamiento se basan en la purificación por cromatografía de afinidad de la proteína de fusión mediante la explotación de las propiedades únicas de ligadura y unión de la proteína codificada por el vector (Tabla 4.2).

Cosa # V. 1 -β-galactosidasa y selección azul o blanca:

Una versión de estos vectores de expresión de la proteína de fusión coloca el sitio de clonación al final de la región codificante de la proteína β-galactosidasa, de modo que, entre otras cosas, la proteína de fusión se une a la β-galactosidasa y se puede recuperar purificando la β-galactosidasa. actividad.

Alternativamente, colocar el sitio de clonación dentro de la región codificante de la β-galactosidasa significa que los insertos clonados interrumpen la secuencia de aminoácidos de la β-galactosidasa, inactivando su actividad enzimática. Esta propiedad se ha aprovechado para desarrollar un protocolo de cribado visual que distingue los clones de la biblioteca que llevan inserciones de los que carecen de ellos.

Las células que se han transformado con una biblioteca de ADNc de expresión de β-galactosidasa basada en plásmidos (o infectadas con una biblioteca similar construida en un vector de fusión de β-galactosidasa basado en bacteriófagos λ) se siembran en placas en medios que contienen 5-bromo-4-cloro-3 -indolil-β-D-galactopiranósido o X-gal (fig. 4.18).

X-gal es un sustrato cromogénico, una sustancia incolora que por reacción enzimática produce un producto coloreado. Después de la inducción con IPTG, las colonias bacterianas (o placas) que albergan vectores en los que el gen de la β-galactosidasa está intacto (los vectores que carecen de insertos) expresan una β-galactosidasa activa que escinde X-gal, liberando 5-bromo-4-cloro-indoxil , que se dimeriza para formar un producto azul índigo.

Estas colonias (o placas) azules representan clones que carecen de inserciones. El gen de la P-galactosidasa se inactiva en los clones con inserciones, por lo que las colonias (o placas) que permanecen & # 8220 blancas & # 8221 (en realidad, incoloras) son clones recombinantes.