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¿Metilación del ADN en la hebra directa frente a la inversa?

¿Metilación del ADN en la hebra directa frente a la inversa?


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Me pregunto si se supone que hay diferencias en la metilación del ADN entre la hebra directa y la inversa del gen. Me pregunto porque en el diseño de imprimaciones para la pirosecuenciación de bisulfito, solo se pueden diseñar imprimaciones para la hebra delantera. ¿Debería esto importar para el ADN humano / ratón?

Saludos y gracias de antemano por cualquier consejo.


En la mayoría de los tejidos, cerca del 100% de la metilación del ADN se produce en los sitios CpG. Esto proporciona un mecanismo sencillo para la herencia epigenética. Dado que C y G son complementarias, ambas cadenas tienen el sitio CpG en el mismo locus y la metilación está presente en ambas cadenas o en ninguna. Durante la replicación, cada molécula de ADN hija hereda una hebra parental con los sitios CpG (no) metilados. Las enzimas pueden reconocer cuando hay metilación de CpG asimétrica y, posteriormente, metilar la nueva hebra cuando sea necesario. Entonces, para los sitios CpG, ambas cadenas están metiladas o no.

En las células madre embrionarias e inducidas, sin embargo, ~ 25% de la metilación total ocurre en sitios que no son CpG (especialmente CpA). Por lo tanto, la metilación en un locus específico solo ocurriría en una hebra. Hasta donde yo sé, aún no se ha dilucidado cómo / si se hereda este patrón de metilación. Además, este tipo de metilación ocurre en todo el cromosoma y es particularmente alto en exones, mientras que la metilación de CpG generalmente ocurre aguas arriba de un sitio de inicio de la transcripción.


También existe un fenómeno llamado hemimetilación en el que una de las hebras está metilada mientras que la otra no está metilada o viceversa. Ha habido varias preguntas de investigación asociadas con la hemimetilación, puede encontrar más sobre esto aquí: http://nathansheffield.com/wordpress/what-is-hemimethylated-dna/


¿Metilación del ADN en la hebra directa frente a la inversa? - biología

Capítulo del cliente: Igual que el hilo de la Fuente. Para contenido personalizado, es el capítulo enviado por el cliente para el diseño de la sonda.

ILMN Strand, también conocido como Design Strand: La hebra utilizada por Illumina para diseñar sondas basadas en la estabilidad termodinámica y la especificidad del locus según NCBI BLAST. Por esta razón, puede diferir del capítulo Cliente / Fuente.

Línea de avance / retroceso (Fwd / Rev): Usado por dbSNP, las designaciones Fwd / Rev pueden cambiar con las actualizaciones de NCBI Genome Build, por lo que se debe especificar Genome Build al informar las cadenas Fwd / Rev. 1. Para SNP en productos de matriz estándar, Fwd strand = Source strand y se origina en dbSNP. 2. Para los SNP de productos de matriz personalizados sin rsid, el cliente puede identificar la línea de origen como Fwd o Rev, según sus propios criterios. Los archivos de productos personalizados de Illumina utilizan las designaciones Fwd / Rev del cliente. Nota: La hebra Fwd, tal como se identifica en los archivos de productos estándar de Illumina, no debe confundirse con la hebra Plus (+), que HapMap denomina indistintamente la "hebra directa".

Cadena más / menos (+/-): La designación estándar para todos los organismos eucariotas utilizados por HapMapand 1000 Genomes Project. El extremo 5 ′ de la hebra (+) está en la punta del brazo corto (brazo p) del cromosoma y el extremo 5 ′ de la hebra (-) está en la punta del brazo largo (brazo q). Las designaciones (+/-) pueden cambiar con las actualizaciones de NCBI Genome Build, por lo que se debe especificar Genome Build al informar (+/-) hebras.


Los patrones de metilación del ADN de senescencia replicativa son específicos de la hebra y reflejan cambios en la conformación de la cromatina.

La senescencia replicativa de las células en cultivo se asocia con cambios de metilación del ADN (ADNm) altamente reproducibles en sitios específicos del genoma. Hasta ahora, no está claro si estas modificaciones epigenéticas están reguladas directamente o si son evocadas aleatoriamente por otros cambios de cromatina durante el cultivo a largo plazo.

Hemos identificado dinucleótidos CG (CpG) que se vuelven continuamente hiper o hipometilados en el curso de la expansión del cultivo de células madre mesenquimales (MSC) y otros tipos de células. Estas modificaciones proporcionan un biomarcador para la senescencia replicativa y se correlacionan con el número de pases. in vitro. Durante la reprogramación en células madre pluripotentes inducidas (iPSC), el ADNm asociado a la senescencia se invierte simultáneamente con los cambios del ADNm asociados a la pluripotencia. La secuenciación de amplicones con código de barras de bisulfito (BBA-seq) demostró que al pasar los patrones de DNAm de los CpG vecinos se vuelven más complejos sin evidencia de desarrollo continuo de patrones. En particular, BBA-seq de moléculas de ADN unidas a horquilla demostró que muchas díadas CpG están metiladas solo en la hebra delantera o inversa. Esta hemimetilación se conservó durante muchos pases, lo que indica que no se debió a un mantenimiento insuficiente de los patrones de DNAm. La captura de conformación de cromatina circularizada (4C) de los CpG asociados a la senescencia reveló cambios reproducibles durante la senescencia sin evidencia de interacción preferencial entre los CpG que se vuelven hiper o hipometilados.

En conjunto, el ADNm asociado a la senescencia fluctúa estocásticamente en sitios específicos del genoma. El ADNm específico de la hebra y los cambios reproducibles en 4C indican que las modificaciones epigenéticas de estas díadas CG no están reguladas de manera dirigida, sino más bien causadas por estados de conformación de cromatina de orden superior específicos de pasaje.


Cómo podemos medir la edad biológica

Para comprender las formas en que podemos medir la edad biológica y conectar los puntos entre el envejecimiento biológico y la metilación del ADN, que, como su nombre indica, es la adición y eliminación de grupos metilo a las hebras de ADN, debemos dar un paso atrás y mirar algunos de los gigantescos avances científicos realizados en las últimas dos décadas. Uno de los más emocionantes ha sido nuestra creciente comprensión de epigenética.

La epigenética es la capa bioquímica descrita como situada encima de nuestro ADN, que regula cómo se lee el material genético. Dependiendo de los patrones epigenéticos de un gen en particular, ese gen puede estar "encendido" (es decir, ser leído y utilizado activamente) o "desactivado" (es decir, apagado y en silencio). Los genes que quizás desee activar son los que, como los genes supresores de tumores, que combaten el cáncer, y los que quizás desee desactivar, o al menos desactivar, son los que promueven la inflamación. Sin embargo, esto es exactamente lo contrario de lo que les sucede a estos genes a medida que nuestra edad biológica aumenta. Es casi como si estuviéramos programados para la enfermedad. A menos que podamos encontrar una manera de retrasar o revertir el proceso de envejecimiento en sí.

Con mucho, el mecanismo epigenético bioquímico más destacado y mejor investigado es la metilación del ADN, que implica la adición de un minúsculo "grupo metilo" (simplemente un carbono con tres hidrógenos unidos) a una base de citosina expuesta en la cadena de ADN.

La metilación del ADN es el mecanismo epigenético mejor estudiado y está profundamente relacionado con el envejecimiento biológico.

Recientemente se ha demostrado que los patrones de metilación del ADN predicen la edad biológica con una precisión increíble. Hace solo unos años, en 2013, el Dr. Steve Horvath, uno de los investigadores epigenéticos más importantes, publicó un artículo tremendamente emocionante. En él, presentó el trabajo que él y su equipo en UCLA habían hecho para predecir la edad humana midiendo el estado de metilación de 353 sitios de citosina en nuestro ADN y hacerlo significativamente más que la longitud de los telómeros y los biomarcadores metabólicos.

Otros científicos también comenzaron a publicar sus propios predictores de la edad epigenética y, en conjunto, estos se conocieron como "relojes epigenéticos" o "relojes biológicos". Son el mejor método que tenemos para determinar la edad biológica.

Y también pueden ayudarnos a evaluar cómo nuestras intervenciones de salud están afectando nuestro envejecimiento.

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Conclusiones

Los alopoliploides pueden emplear diversos mecanismos para hacer frente a genomas duplicados y redundantes. Si bien estudios previos de Tragopogon Los alopoliploides demostraron que la pérdida de homeólogos es una consecuencia común de la alopoiploidización, aquí mostramos que la metilación del ADN puede silenciar a un homeólogo progenitor o puede regular el nivel de expresión de los dos homeólogos progenitores. Como recursos genómicos adicionales para Tragopogon se desarrollan, se deben realizar análisis de metilación de todo el genoma para evaluar qué tan extensa es la metilación homeológica dentro de las especies alopoliploides.


Información del autor

Dirección actual: Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de California-Irvine, Irvine, CA, EE. UU.

Estos autores contribuyeron igualmente: Jocelyn Charlton y Timothy L. Downing.

Afiliaciones

Departamento de Regulación del Genoma, Instituto Max Planck de Genética Molecular, Berlín, Alemania

Jocelyn Charlton, Sven Klages, Bernd Timmermann y el amplificador Alexander Meissner

Departamento de Células Madre y Biología Regenerativa, Universidad de Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.

Jocelyn Charlton, Timothy L. Downing, Zachary D. Smith, Kendell Clement, Ramona Pop, Veronika Akopian, Alexander M. Tsankov y Alexander Meissner

Broad Institute of MIT y Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.

Timothy L. Downing, Zachary D. Smith, Hongcang Gu, Kendell Clement, Alexander M. Tsankov, Andreas Gnirke y Alexander Meissner

El Departamento de Neurología de Ken & amp Ruth Davee, Departamento de Fisiología, Escuela de Medicina Feinberg, Universidad Northwestern, Chicago, IL, EE. UU.

David P. Santos y Evangelos Kiskinis

Departamento de Psiquiatría Traslacional, Instituto Max Planck de Psiquiatría, Múnich, Alemania

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Contribuciones

J.C., T.L.D. y yo. diseñó el estudio con aportes de Z.D.S. T.L.D., J.C., R.P. y V.A. realizó los experimentos. H.G. y A.G. desarrollaron el protocolo RRBS de célula única multiplexado, generaron las bibliotecas de secuenciación y ayudaron con el diseño y análisis experimental. K.C., S.K., B.T. y M.J.Z. asistido en el procesamiento de datos. J.C. realizó análisis bioinformáticos. A.M.T. realizó el análisis del ciclo celular de RNA-seq de una sola célula. D.P.S. y E.K. realizó la diferenciación, caracterización y recolección de muestras de MN. J.C., T.L.D., Z.D.S., A.G. y A.M. interpretó los datos. J.C., T.L.D., Z.D.S. y yo. escribió el manuscrito con la ayuda de los otros autores.

Autor correspondiente


Figura complementaria 1 Análisis de aislamiento y metilación global de núcleos neuronales (NeuN +) y no neuronales (NeuN -) de tejidos cerebrales congelados.

(a) Los núcleos en este ejemplo representativo se aislaron mediante clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FANS) de la corteza prefrontal (BA9) y se excluyeron los residuos, los dobletes y los núcleos autofluorescentes. Los núcleos restantes se separaron basándose en la detección de anticuerpo anti-NeuN conjugado con AlexaFluor 488. FANS se repitió un mínimo de 8 veces por región del cerebro. (B) Ejemplo de núcleos teñidos con anti-NeuN y DAPI, tanto la tinción previa como la posterior a la clasificación, repetida dos veces con resultados similares. (C) Proporción de núcleos NeuN + aislados mediante FANS de muestras de tejido de las regiones cerebrales indicadas. Las flechas indican dos punzones de la misma muestra de tejido. Los tejidos son de BA9, corteza cingulada anterior (BA24), hipocampo (HC) y núcleo accumbens (NAcc) de seis individuos como se indica. (D) Proporción de núcleos NeuN + aislados mediante FANS representados frente al intervalo post-mortem de muestras de tejido de las regiones cerebrales indicadas (BA9, norte = 11 BA24, norte = 13 HC, norte = 13 NAcc, norte = 8 individuos). Se superpone una línea que muestra la media condicional y el intervalo de confianza del 95% sombreado para esta relación según se estima utilizando un modelo lineal dentro de cada tejido. (mi) CpG autosómico promedio (mCG) y (F) metilación sin CpG (mCH) de NeuN + (norte = 6 individuos para BA9, HC, NAcc y norte = 5 para BA24) y NeuN - núcleos (norte = 6 individuos para BA9, HC, NAcc y norte = 4 para BA24) se indican diferencias significativas en la mC global entre tejidos dentro de contextos de dinucleótidos y estado de NeuN. Valores p en (mi,F) se ajustan para comparaciones múltiples utilizando la prueba honesta de diferencias significativas de Tukey.

Figura complementaria 2 Las diferencias en la metilación del ADN entre las regiones del cerebro se limitan a los núcleos neuronales.

Análisis de componentes principales (PCA) de distancias derivadas de los niveles de metilación de CpG autosómicos promedio en intervalos de 1 kb en (a) tejidos a granel, (B) Núcleos NeuN +, (C) tejidos a granel y núcleos clasificados combinados, y (D) NeuN - núcleos. Los tejidos, el tipo de muestra y los individuos se indican como se muestra. (mi) Matriz de correlación entre muestras basada en la metilación promedio de CpG compartidos en todas las muestras. (a-e) Los tejidos provienen de la corteza cingulada anterior (BA24 NeuN + n = 5 individuos NeuN - norte = 4, a granel norte = 6), corteza prefrontal dorsolateral (BA9 NeuN + norte = 6, NeuN - norte = 6, a granel norte = 6), hipocampo (HC NeuN + norte = 6, NeuN - norte = 6, a granel norte = 6) y núcleo accumbens (NAcc NeuN + norte = 6, NeuN - norte = 6, a granel norte = 6).

Figura complementaria 3 Análisis de variabilidad entre tipos de muestras.

(a) Correlaciones de Pearson para la metilación del ADN entre muestras del mismo tejido dentro de un donante (muestras a granel compuestas de NeuN + y NeuN - norte = 27) o un tipo de célula (NeuN +, norte = 23 o NeuN -, norte = 22 muestras). (B) Entre la variación de la muestra dentro de una región del cerebro y el tipo de muestra, en función del nivel de metilación. (C) Proporción de CpG con una diferencia de metilación absoluta estimada superior al 10% (elegido porque todos los CG-DMR tienen una diferencia de metilación absoluta & gt 10%) entre las regiones cerebrales indicadas, estratificadas por tipo de muestra (NeuN +, NeuN -, a granel).

Figura 4 complementaria Los perfiles de metilación son distintos entre núcleos neuronales y no neuronales y entre neuronas de distintas regiones del cerebro.

(a) Agrupación jerárquica de muestras basada en el promedio de metilación por muestra de las 20.000 principales CG-DMR específicas del tipo de célula. Ejemplos de (B) CG-DMR específicos del tipo celular y un bloque de metilación diferencial específico del tipo celular (NeuN + es verde NeuN - es púrpura) y (C) CG-DMR neuronales. Los valores de metilación se muestran con CG-DMR sombreados en rosa y se superponen con los genes que codifican proteínas representados debajo de cada gráfico. (D) Valores medios de metilación de CpG para núcleos NeuN + dentro de cada región del cerebro en una ventana de 3 kb centrada en los CG-DMR (norte = 208) identificados entre BA9, BA24 y HC. Para BA9 y HC, norte = 6 personas y norte = 5 individuos para BA24. Los CG-DMR se agruparon mediante agrupación de k-medias en función de sus patrones de metilación. Los gráficos de metageno para cada grupo se muestran a la derecha con el número de CG-DMR indicado. (mi) Como en (C) con cobertura de secuenciación ATAC normalizada para núcleos NeuN + de NAcc y BA9 (los medios individuales son líneas transparentes y los medios de tejido son líneas opacas). Las regiones de accesibilidad diferencial (DAR), CG-DMR y CG-blocks están sombreadas en rosa.

La metilación complementaria de la Figura 5 sin CpG es similar en todas las hebras y contextos.

La metilación neuronal (NeuN +) no CpG se midió en contenedores de 1 kb (norte = 2,881,044) a través de los autosomas. Se retiraron los contenedores con poca o ninguna cobertura de citosinas. (a) Metilación sin CpG en el contexto de CA en la hebra positiva en comparación con dos réplicas biológicas. (B) Metilación sin CpG en el contexto de CA comparada entre la hebra positiva y negativa dentro de una muestra individual. (C) Metilación sin CpG en la hebra positiva comparada entre el contexto CA y el contexto CT dentro de una muestra individual. La línea roja continua es y = x, la línea roja discontinua es la mejor línea de regresión a través del origen (la correlación y la ecuación se muestran en el gráfico).

Figura 6 complementaria La metilación sin CpG es coherente a lo largo de la hebra y el contexto y con la metilación de CpG.

Agrupación jerárquica de muestras basada en la puntuación z de metilación sobre (a) CA (-) DMR, (B) CT (+) DMR y (C) CT (-) DMR. (D) Agrupación jerárquica de muestras basada en puntuaciones z de metilación para CA (+) DMR que se superponen a CG-DMR.

Figura complementaria 7 Las regiones de cromatina abiertas distinguen claramente las muestras de NeuN + de NeuN -.

(a) Ejemplo de matriz de correlación de recuentos de lectura de ATAC-seq [log2(recuentos por millón)] en regiones de cromatina abiertas (verde = NeuN + núcleos, púrpura = NeuN - núcleos, naranja = núcleo accumbens (NAcc), azul = corteza prefrontal (BA9)). Para NeuN + y NeuN: muestras de BA9 y NAcc, norte = 6 individuos cada uno. (B) Gráfico de diferencia de medias de los datos de accesibilidad máxima comparando: núcleos NeuN + a NeuN -. Las regiones de acceso diferencial (DAR) se muestran en naranja. Los datos fueron muestreados al azar (100% de DAR, 10% de no DAR).

La metilación del ADN de la Figura 8 complementaria y la accesibilidad a la cromatina se correlacionan con la expresión génica.

(a) Niveles medios de metilación alrededor de genes codificadores de proteínas (norte = 19.823) con diferentes niveles de expresión en núcleos neuronales aislados de nucleus accumbens (NAcc) y corteza prefrontal (BA9). Cada longitud de gen se divide en 100 contenedores y los datos se extienden en dos longitudes hacia arriba y hacia abajo. La expresión genética se divide en cuartiles basados ​​en RPKM. (b, c) Diagramas de dispersión que muestran la correlación de Pearson de la expresión diferencial de genes [log2(doblar el cambio)] (norte = 16538) con: (B) mCA diferencial y mCG, y (C) accesibilidad diferencial [log2(cambio de veces)] de los núcleos neuronales NAcc frente a BA9. Los genes codificadores de proteínas (DEG) expresados ​​diferencialmente se muestran en naranja. Los valores de correlación (con IC del 95%) se dan debajo de cada gráfico. (D,mi) Diagramas de dispersión que muestran las correlaciones de Pearson de la expresión diferencial de genes [log2(cambio de pliegue)] con características epigenéticas diferenciales de núcleos neuronales NAcc vs BA9 que se superponen (D) promotores y (mi) cuerpos genéticos. Los DEG se muestran en naranja y se indica el número de genes (n) con una característica (s). (F) Relaciones entre la expresión de genes que codifican proteínas y la accesibilidad a la cromatina, mCA y mCG dentro del cuerpo del gen en los núcleos neuronales NAcc y BA9. Los contornos muestran densidades de puntos, la línea roja muestra una tendencia suavizada. (a-F) norte = 6 individuos para muestras neuronales NAcc y BA9.

Figura 9 Análisis SLDSR complementario de cada característica.

Cada característica representada en la figura se incluyó por separado en un análisis SLDSR que incluyó 53 características de referencia. Los resultados de nuestro diferencial y las 3 características epigenómicas no diferenciales (Brain H3K27ac 30, CNS 51, chromHMM 15) se muestran por rasgo; los mismos resultados se muestran en la Fig. 5 sin la capacidad de identificar rasgos individuales. (a) Puntajes z de coeficiente. El enriquecimiento solo se informa para los rasgos donde al menos un rasgo tiene una puntuación z significativamente mayor que 0 (prueba z unilateral con alfa = 0.05, valores P corregidos dentro de cada rasgo usando el método de Holm). (B) Enriquecimiento + / - 2 errores estándar. Los tamaños de GWAS para cada rasgo se informan en la Tabla complementaria 24.

Figura 10 complementaria Análisis SLDSR de características epigenómicas diferenciales, controlando las características epigenómicas no diferenciales.

Cada una de las características epigenómicas diferenciales (CG-DMR neuronales, DAR y CG-DMR y DAR de tipo celular) se incluyó por separado en un análisis SLDSR con las 3 características epigenómicas no diferenciales (Brain H3K27ac 30, CNS 51, chromHMM 15) incluidas en la línea de base (53 características). Los resultados se muestran por rasgo, los mismos resultados se muestran en la Fig. 5 sin la capacidad de identificar rasgos individuales. (a) Puntajes z de coeficiente. El enriquecimiento solo se informa para los rasgos donde al menos un rasgo tiene una puntuación z significativamente mayor que 0 (prueba z unilateral con alfa = 0.05, valores P corregidos dentro de cada rasgo usando el método de Holm). (B) Enriquecimiento + / - 2 errores estándar. Los tamaños de GWAS para cada rasgo se informan en la Tabla complementaria 24.

Figura 11 complementaria Análisis SLDSR de características epigenómicas diferenciales, controlando las características epigenómicas no diferenciales al excluir su superposición de la línea de base.

Cada una de las características epigenómicas diferenciales (CG-DMR neuronales, DAR y CG-DMR y DAR de tipo celular) se incluyó por separado en un análisis SLDSR que incluyó las 3 características epigenómicas no diferenciales (Brain H3K27ac 30, CNS 51, chromHMM 15) en la línea de base. Para las 3 características epigenómicas no diferenciales incluidas en la línea de base, eliminamos cualquier superposición con las características epigenómicas diferenciales. Los resultados se muestran por rasgo, los mismos resultados se muestran en la Fig. 5 sin la capacidad de identificar rasgos individuales. (a) Puntajes z de coeficiente. El enriquecimiento solo se informa para los rasgos donde al menos un rasgo tiene un puntaje z significativamente mayor que 0 (prueba z unilateral con alfa = 0.05, valores P corregidos dentro de cada rasgo usando el método de Holm). (B) Enriquecimiento + / - 2 errores estándar. Los tamaños de GWAS para cada rasgo se informan en la Tabla complementaria 24.


Abreviaturas

5mC5-metilcitosina
5hmC5-hidroximetilcitosina
AuNPsNanopartícula de oro
pbBase par
CGIIsla CPG
ConnecticutUmbral de ciclo
COBRAAnálisis de restricción de bisulfito combinado
DNMTADN metiltransferasa
ELISAEnsayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
CEElectroquímica
HRCAAmplificación de círculo rodante hiperramificado
HPLCCromatografía líquida de alta resolución
VPHVirus del papiloma humano
HRPPeroxidasa de rábano picante
IVDdiagnóstico in vitro
LUMAEnsayo de metilación luminométrica
LODLímite de detección
MBDDominio de unión a metil-CpG
MS-PCRPCR específica de metilación
MS-HRMFusión de alta resolución específica de metilación
MSREEnzimas de restricción sensibles a la metilación
MeDIPInmunoprecipitación de ADN metilado
MIRAEnsayo de recuperación de isla de CpG metilado
MS-SnuPEExtensión del cebador de un solo nucleótido sensible a la metilación
MS-MLPAAmplificación de sonda dependiente de ligadura múltiple sensible a metilación
MALDI-TOFTiempo de vuelo de ionización / desorción láser asistida por matriz
MS-MRMMonitoreo de reacciones múltiples por espectrometría de masas
NGSSecuenciación de próxima generación
NSCLCCarcinoma de pulmón de células no pequeñas
Nuevo Testamentonucleótido
sobredosisDensidad óptica
REEnzima restrictiva
RRBSSecuenciación de bisulfito de representación reducida
SNPPolimorfismo de nucleótido simple
SMRTSecuenciación en tiempo real de una sola molécula
WGBSSecuenciación de bisulfito del genoma completo

Imprimaciones de bisulfito- & # 34Top & # 34 y & # 34Bottom & # 34 Strand - (17 / Sep / 2012)

Hola, Estoy buscando ayuda con respecto al diseño de cebadores de secuenciación de bisulfito.

Mientras revisaba la literatura, he visto que algunos artículos se refieren a juegos de imprimaciones diseñados específicamente para la hebra inferior o la superior. Esto puede tener una explicación simple que me falta, pero todavía tengo dificultades para comprender esto. Cuando diseñamos cebadores para PCR normal, elegimos un cebador de la hebra superior y un cebador de la hebra inversa. ¿Cómo elegiríamos cebadores de una sola hebra si las secuencias son las mismas, pero solo el complemento inverso entre sí? Agradezco cualquier información que pueda proporcionar & # 33

¿Podría citar a qué artículos se refiere?

Después de la modificación con bisulfito, dos cadenas de ADN ya no son complementarias. Cuando diseñamos cebadores de PCR de bisulfito, generalmente los diseñamos en la hebra de ADN con sentido, aunque no es incorrecto diseñar cebadores en la hebra menos. Esto se basa en el hecho de que la metilación del ADN es simétrica. Espero haberme hecho entender.

Debido a que las dos cadenas de ADN ya no son complementarias después de la modificación con bisulfito, se utilizan cebadores específicos de cadena para la amplificación por PCR. Por lo general, la hebra de sentido se elige para el diseño del cebador.

Muchas gracias por todas sus respuestas. El documento que estoy analizando específicamente es:

Hansen, R. S. "Metilación específica de inactivación X de elementos LINE-1 por DNMT3B: Implicaciones para la hipótesis de la repetición de Lyon". Genética molecular humana 12.19 (2003): 2559-567.

Aquí hay otro principiante confundido. Todavía no estoy 100% seguro de entender lo que se habla sobre los cebadores "específicos de cada hebra". ¿No es esto como un diseño de cebador de PCR "tradicional", excepto que uno, por supuesto, utiliza una secuencia convertida con bisulfato?

Quiero decir, normalmente uso solo la secuencia de cadena de sentido como plantilla de diseño y uso algo como Primer3 para elegir los cebadores. Si ahora uso la secuencia de sentido convertida con bisulfato, obviamente obtendré un cebador inverso (antisentido) que es completamente complementario a la hebra con sentido, y un cebador directo (sentido) que NO es complementario a la hebra antisentido debido a la conversión de bisulfato. . Por lo tanto, durante la primera ronda de la PCR, solo se amplificará la cadena con sentido. Y después de eso, el cebador directo se unirá a los nuevos productos y el resto es una amplificación exponencial de la cadena de sentido original. ¿Es esto lo que significa la especificidad de la hebra?

No veo qué más puedo hacer. Quiero decir, si diseñara los cebadores que se ajustan a ambas hebras convertidas, amplificarían bien las plantillas originales, pero no los productos, por lo que la amplificación sería solo lineal.


Un interruptor de encendido y apagado para la edición de genes

Durante la última década, el sistema de edición de genes CRISPR-Cas9 ha revolucionado la ingeniería genética, permitiendo a los científicos realizar cambios específicos en el ADN de los organismos. Si bien el sistema podría ser potencialmente útil para tratar una variedad de enfermedades, la edición CRISPR-Cas9 implica cortar hebras de ADN, lo que lleva a cambios permanentes en el material genético de la célula.

Ahora, en un artículo publicado en línea en Celda el 9 de abril, los investigadores describen una nueva tecnología de edición de genes llamada CRISPRoff que permite a los investigadores controlar la expresión génica con alta especificidad sin modificar la secuencia del ADN. Diseñado por el miembro del Whitehead Institute Jonathan Weissman, el profesor asistente Luke Gilbert de la Universidad de California en San Francisco, el postdoctorado del laboratorio Weissman James Nuñez y sus colaboradores, el método es lo suficientemente estable como para ser heredado a través de cientos de divisiones celulares, y también es completamente reversible.

“La gran historia aquí es que ahora tenemos una herramienta simple que puede silenciar la gran mayoría de genes”, dice Weissman, quien también es profesor de biología en el MIT e investigador del Instituto Médico Howard Hughes. “Podemos hacer esto para múltiples genes al mismo tiempo sin ningún daño en el ADN, con mucha homogeneidad y de una manera que se puede revertir. Es una gran herramienta para controlar la expresión genética ".

El proyecto fue financiado parcialmente por una subvención de 2017 de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa para crear un editor de genes reversible. “Avance rápido cuatro años [desde la subvención inicial], y CRISPRoff finalmente funciona como se imaginó en una forma de ciencia ficción”, dice el coautor principal Gilbert. "Es emocionante ver que funciona tan bien en la práctica".

Ingeniería genética 2.0

El sistema clásico CRISPR-Cas9 utiliza una proteína de corte de ADN llamada Cas9 que se encuentra en el sistema inmunológico bacteriano. El sistema puede dirigirse a genes específicos en células humanas utilizando un ARN guía único, donde las proteínas Cas9 crean pequeñas rupturas en la cadena de ADN. Luego, la maquinaria de reparación existente de la celda repara los agujeros.

Debido a que estos métodos alteran la secuencia de ADN subyacente, son permanentes. Además, su dependencia de los mecanismos de reparación celular "internos" significa que es difícil limitar el resultado a un único cambio deseado. “Tan hermoso como es CRISPR-Cas9, transfiere la reparación a los procesos celulares naturales, que son complejos y multifacéticos”, dice Weissman. "Es muy difícil controlar los resultados".

Ahí es donde los investigadores vieron la oportunidad de un tipo diferente de editor de genes, uno que no alteraba las secuencias de ADN en sí mismas, sino que cambiaba la forma en que se leían en la célula.

Este tipo de modificación es lo que los científicos llaman "epigenética": los genes pueden silenciarse o activarse en función de cambios químicos en la cadena de ADN. Los problemas con la epigenética de una célula son responsables de muchas enfermedades humanas, como el síndrome del X frágil y varios cánceres, y pueden transmitirse de generación en generación.

El silenciamiento de genes epigenéticos a menudo funciona a través de la metilación, la adición de etiquetas químicas en ciertos lugares de la cadena de ADN, lo que hace que el ADN se vuelva inaccesible para la ARN polimerasa, la enzima que lee la información genética en la secuencia de ADN en transcripciones de ARN mensajero, que en última instancia, pueden ser los planos de las proteínas.

Weissman y sus colaboradores habían creado previamente otros dos editores epigenéticos llamados CRISPRi y CRISPRa, pero ambos tenían una salvedad. Para que funcionen en las células, las células tenían que expresar continuamente proteínas artificiales para mantener los cambios.

“Con esta nueva tecnología CRISPRoff, puede [expresar una proteína brevemente] para escribir un programa que la célula recuerde y ejecute indefinidamente”, dice Gilbert. “Cambia el juego, así que ahora básicamente estás escribiendo un cambio que se transmite a través de las divisiones celulares; de alguna manera, podemos aprender a crear una versión 2.0 de CRISPR-Cas9 que sea más segura e igual de efectiva, y que pueda hacer todo esto otras cosas también ".

Construyendo el interruptor

Para construir un editor epigenético que pudiera imitar la metilación natural del ADN, los investigadores crearon una pequeña máquina de proteínas que, guiada por pequeños ARN, puede pegar grupos metilo en puntos específicos de la hebra. Estos genes metilados se "silencian" o desactivan, de ahí el nombre CRISPRoff.

Debido a que el método no altera la secuencia de la cadena de ADN, los investigadores pueden revertir el efecto de silenciamiento utilizando enzimas que eliminan los grupos metilo, un método que llamaron CRISPRon.

Mientras probaban CRISPRoff en diferentes condiciones, los investigadores descubrieron algunas características interesantes del nuevo sistema. Por un lado, podrían apuntar el método a la gran mayoría de genes en el genoma humano, y funcionó no solo para los genes en sí, sino también para otras regiones del ADN que controlan la expresión génica pero no codifican proteínas. “Eso fue un gran impacto incluso para nosotros, porque pensamos que solo sería aplicable para un subconjunto de genes”, dice el primer autor Nuñez.

Además, sorprendentemente para los investigadores, CRISPRoff incluso fue capaz de silenciar genes que no tenían grandes regiones metiladas llamadas islas CpG, que anteriormente se habían considerado necesarias para cualquier mecanismo de metilación del ADN.

“Lo que se pensaba antes de este trabajo era que el 30 por ciento de los genes que no tienen una isla CpG no estaban controlados por la metilación del ADN”, dice Gilbert. “Pero nuestro trabajo muestra claramente que no se necesita una isla CpG para desactivar genes por metilación. Eso, para mí, fue una gran sorpresa ".

CRISPRoff en investigación y terapia

Para investigar el potencial de CRISPRoff para aplicaciones prácticas, los científicos probaron el método en células madre pluripotentes inducidas. Estas son células que pueden convertirse en innumerables tipos de células en el cuerpo dependiendo del cóctel de moléculas a las que estén expuestas y, por lo tanto, son modelos poderosos para estudiar el desarrollo y la función de tipos de células particulares.

Los investigadores eligieron un gen para silenciar en las células madre y luego las indujeron a convertirse en células nerviosas llamadas neuronas. Cuando buscaron el mismo gen en las neuronas, descubrieron que había permanecido silenciado en el 90 por ciento de las células, revelando que las células conservan un recuerdo de las modificaciones epigenéticas realizadas por el sistema CRISPRoff incluso cuando cambian de tipo celular.

También seleccionaron un gen para usarlo como ejemplo de cómo CRISPRoff podría aplicarse a la terapéutica: el gen que codifica la proteína Tau, que está implicada en la enfermedad de Alzheimer. Después de probar el método en neuronas, pudieron demostrar que el uso de CRISPRoff podría usarse para reducir la expresión de Tau, aunque no del todo. "Lo que mostramos es que esta es una estrategia viable para silenciar a Tau y evitar que esa proteína se exprese", dice Weissman. “La pregunta es, entonces, ¿cómo le entregas esto a un adulto? ¿Y realmente sería suficiente para impactar en el Alzheimer? Esas son grandes preguntas abiertas, especialmente la última ”.

Incluso si CRISPRoff no conduce a terapias para el Alzheimer, existen muchas otras afecciones a las que podría aplicarse. Y aunque la entrega a tejidos específicos sigue siendo un desafío para las tecnologías de edición de genes como CRISPRoff, "demostramos que se puede entregar transitoriamente como ADN o como ARN, la misma tecnología que es la base de la vacuna contra el coronavirus Moderna y BioNTech", Weissman. dice.

Weissman, Gilbert y sus colaboradores también están entusiasmados con el potencial de CRISPRoff para la investigación. "Dado que ahora podemos silenciar cualquier parte del genoma que queramos, es una gran herramienta para explorar la función del genoma", dice Weissman.

Además, tener un sistema confiable para alterar la epigenética de una célula podría ayudar a los investigadores a aprender los mecanismos por los cuales las modificaciones epigenéticas se transmiten a través de las divisiones celulares. “Creo que nuestra herramienta realmente nos permite comenzar a estudiar el mecanismo de heredabilidad, especialmente la heredabilidad epigenética, que es una gran pregunta en las ciencias biomédicas”, dice Nuñez.


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