Información

CD4 + como receptores de superficie celular de monocitos

CD4 + como receptores de superficie celular de monocitos


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Hoy en clase, nuestra maestra estaba discutiendo sobre la patogenicidad del virus del VIH.

Dijo que la unión entre el virus del VIH y los macrófagos se realiza mediante la interacción entre la GP120 del virus y Receptores CD4, receptores de quimiocinas (CCR-5 y CXCR-4) y receptor de fusina presentes en Macrófagos.

Mi duda es que creo que los receptores CD4 están presentes solo en las células T colaboradoras. ¿Están presentes también en los macrófagos? ¿Tengo una noción errónea sobre los receptores CD4? Si no es así, ¿existen otros receptores responsables de la transferencia de partículas virales dentro de los monocitos y células dendríticas?

Se agradece cualquier información adicional.


Los macrófagos y las células monocíticas pueden expresar CD4, CD8 o incluso coexpresarlos. Las moléculas CD4 y CD8 interactúan con los complejos MHC en las células vecinas y, como puede imaginar, provocan un efecto variable de una manera dependiente del tipo de célula.

Claramente, Zhen et al. demostraron que la unión de CD4 monocíticos a moléculas de MHC-II en otras células, como el endotelio activado, inducía un patrón de expresión conducente a la diferenciación de macrófagos (1). Gibbings y col. también demostró que CD8 se asocia con FcyR en la superficie de los monocitos de manera similar a las asociaciones CD8 / TCR, y estimula la secreción de citocinas (2).

Intentaré encontrar una fuente modelo, pero CD8a en células dendríticas puede asociarse con moléculas MHC-II en células T como HLA-DR y ayudar en el cebado cruzado de las células T.

Ahora, lo que hace el CD4 con los macrófagos diferenciados funcionales es menos claro para mí, y necesito revisar la literatura al respecto un poco más. Podría simplemente estar impresa en expresión porque son células derivadas de monocitos, o también podría provocar un efecto como CD8 / FcryR anterior. Yo no sé.

Hay más casos, por lo que estos sirven como ejemplos seleccionados.


Biología: CD4

En biología molecular, CD4 (grupo de diferenciación 4) es una glicoproteína que se encuentra en la superficie de las células inmunitarias, como las células T auxiliares, los monocitos, los macrófagos y las células dendríticas. Fue descubierto a fines de la década de 1970 y originalmente se conocía como leu-3 y T4 (después del anticuerpo monoclonal OKT4 que reaccionó con él) antes de ser nombrado CD4 en 1984. & # 911 & # 93 En humanos, la proteína CD4 está codificada por el CD4 gene. & # 912 & # 93 & # 913 & # 93

Las células auxiliares T CD4 + son glóbulos blancos que son una parte esencial del sistema inmunológico humano. A menudo se les conoce como células CD4, células T auxiliares o células T4. Se denominan células auxiliares porque una de sus funciones principales es enviar señales a otros tipos de células inmunitarias, incluidas las células asesinas CD8, que luego destruyen la partícula infecciosa. Si las células CD4 se agotan, por ejemplo, en una infección por VIH no tratada, o después de la inmunosupresión antes de un trasplante, el cuerpo queda vulnerable a una amplia gama de infecciones que de otro modo habría podido combatir.


Regulación del segundo mensajero de la asociación del receptor con fosas recubiertas de clatrina: un mecanismo novedoso y selectivo en el control de la endocitosis de CD4.

CD4, un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas, no solo se expresa en los linfocitos auxiliares T4 sino también en las células mieloides. La endocitosis mediada por receptores juega un papel crucial en la regulación de la expresión superficial de moléculas de adhesión como CD4. En los linfocitos T, p56lck, una tirosina quinasa asociada a CD4, previene la internalización de CD4, pero en las células mieloides, p56lck no se expresa y CD4 se internaliza constitutivamente. En este estudio, hemos investigado el papel del AMP cíclico (cAMP) en la regulación de la endocitosis de CD4 en la línea celular mieloide HL-60. Las elevaciones de cAMP celular fueron provocadas por 1) toxina del cólera, 2) toxina de tos ferina, 3) forskolina e IBMX, 4) NaF, o 5) el agonista del receptor fisiológico prostaglandina E1. Las cinco intervenciones condujeron a una inhibición de la internalización de CD4. El aumento de los niveles de AMPc no inhibió la endocitosis per se, porque la internalización de los receptores de insulina y los receptores de transferrina y la endocitosis en fase líquida no cambiaron o mejoraron ligeramente. El mecanismo de inhibición del AMPc se analizó adicionalmente a nivel ultraestructural. La internalización de CD4, seguida de autorradiografía cuantitativa por microscopía electrónica o de marcaje inmunológico con oro, mostró una asociación rápida y dependiente de la temperatura de CD4 con hoyos recubiertos de clatrina en las células de control. Esta asociación se inhibió notablemente en células con niveles elevados de AMPc. Por tanto, estos hallazgos sugieren una regulación del segundo mensajero de la internalización de CD4 a través de una inhibición de la asociación de CD4 con hoyos recubiertos de clatrina en células p56lck-negativas.


Características clínicas de la infección por VIH-1

El virus VIH-1 se transmite por intercambio de fluidos corporales. El modo de transmisión puede implicar la transferencia de viriones libres o células infectadas por VIH-1. La infección inicial (aguda) por VIH-1 produce síntomas clínicos en 1 a 3 semanas en al menos la mitad de los recién infectados. Estos síntomas son similares a los de la gripe o la mononucleosis junto con una erupción eritematosa macular no pruriginosa. 52 Poco después de la infección aguda, la mayoría de los pacientes se someten a seroconversión. A esto le sigue un período de latencia clínica, que puede durar de 3 a más de 15 años, antes de que se desarrolle el SIDA y el paciente finalmente muera de múltiples infecciones y / o neoplasias malignas. La progresión al SIDA se acompaña de la pérdida de linfocitos T CD4 +, y los síntomas se notan a niveles sanguíneos inferiores a 500 células / L. Aunque la gran mayoría de las personas infectadas con el VIH-1 desarrollarán el SIDA, existe una creciente evidencia de que algunas personas pueden vivir con el virus durante períodos prolongados sin desarrollar la enfermedad clínica. Estos individuos se denominan "no progresores a largo plazo", aunque solo el tiempo dirá si este grupo también sucumbirá a la enfermedad. 53 Los factores que afectan la tasa de progresión al SIDA (para una revisión, ver Levy 54) incluyen la edad (la mayoría de los bebés infectados por el VIH-1 progresan relativamente lentamente 55, 56), la salud general (la presencia de otras infecciones puede acelerar la progresión al SIDA 57) y estilo de vida (fumar, 58 el alcohol 59 y el consumo de drogas 60 pueden acelerar la progresión). Las diferencias en la cepa infectante del VIH-1 y la respuesta inmune del huésped probablemente también sean importantes en las tasas de progresión de la enfermedad.


LOS TIPOS DE CÉLULAS QUE EXPRESAN CD8 Y CD4 VARÍAN ENTRE LAS ESPECIES DE MAMÍFEROS

CD8 y CD4 son expresados ​​por varios tipos de células que no expresan TCR, aunque esta afirmación debe ser advertida por la demostración de TCR reordenado en neutrófilos [21] y la presencia de genes TCR reorganizados en países en desarrollo [4] y células NK [22] . Las especies de ratones y humanos tienen diferencias significativas en sus sistemas inmunológicos [23]. Una de estas diferencias está en los tipos de células, que expresan CD4 y CD8. Aunque el CD8 se encuentra en las células DC y T en todas las especies [24, 25, 26], sólo en ratas y seres humanos se encuentra CD8 en una variedad de otras células inmunes. La evidencia actual sugiere que la proteína CD8α es expresada por células NK en ratas [27] y humanas [28] pero no en ratones [29] (Tabla 1 y referencias en el mismo). De manera similar, los monocitos de rata [42, 44] y humanos [31] y los macrófagos [35] expresan CD8α, y las mismas células en el ratón carecen de CD8α [33]. Curiosamente, los macrófagos de rata y los mastocitos también expresan CD8β [35, 36]. De forma análoga a la situación de CD8, CD4 en ratas y seres humanos se expresa en una variedad más amplia de tipos de células inmunitarias innatas que en el ratón (Tabla 1 y referencias en la misma). Curiosamente, las CD también divergen entre las especies en su patrón de expresión de CD4: las CD de ratón expresan niveles altos de CD4, pero las CD de humanos y ratas expresan CD4 en niveles bajos [26].

Mecanismos de activación de la señalización intracelular de CD4 y CD8

En diferentes etapas temporales de la señalización de TCR, CD4 y CD8 pueden funcionar dentro o fuera de las balsas de lípidos para afectar la señalización intracelular a través de lck o LAT. En uno de los primeros pasos de la activación de TCR, CD45, ubicado fuera de las balsas lipídicas, desfosforila lck. CD4 y CD8 inmunoprecipitan con CD45 [45, 46] y pueden estar involucrados en la desfosforilación temprana de lck independiente de la balsa lipídica. El lck desfosforilado luego se mueve hacia balsas de lípidos para fosforilar dos sitios en CD3ζ. La palmitoilación dinámica de lck y / o CD4 y CD8 puede regular la transición de lck en balsas lipídicas. Posteriormente, ZAP-70 puede ser reclutado por CD3ζ fosforilado. ZAP-70 puede entonces fosforilar LAT, que está potencialmente asociado con CD4 y CD8 [12]. Este LAT asociado a la balsa lipídica puede centrar una red de andamiaje de complejos de señalización intracelular, reclutando indirectamente SLP-76 a complejos TCR. SLP-76 recluta la región no catalítica de la tirosina quinasa (NCK) y permite la activación de Itk reclutada, contribuyendo a la fosforilación y activación de PLCγ [47]. La unión posterior de PLCγ a LAT junto con Grb2 juntos influirá fuertemente en el flujo de calcio, la reorganización citoesquelética, la proliferación y la transcripción de genes [48].

Además de activar la señalización intracelular a través de lck o LAT, CD8 puede afectar la activación de células T mediada por TCR a través de su unión extracelular al MHC de clase I. El TCR se une al péptido MHC con una tasa de asociación lenta (10 3-10 5 / Ms -1) , típico de unión de ajuste inducido [9], mientras que CD8 tiene una tasa de asociación más rápida típica de unión de cuerpo rígido (1,4 × 10 5 / Ms -1) [49]. El CD8, estadísticamente, debería contactar con el MHC de clase I en una celda adyacente antes del TCR, como confirman los datos experimentales [50]. La cinética de unión de CD4 para MHC clase I es menos clara, pero se parece a la de CD8 en general [9], lo que sugiere que también se le pueden aplicar modelos similares. Curiosamente, la cristalografía bidimensional de MHC de clase I en balsas lipídicas sugiere que el MHC de clase I puede adoptar una orientación supina en la membrana plasmática con el sitio de unión de CD8 expuesto y el sitio de unión de TCR parcialmente oscurecido [51]. Por lo tanto, las tasas de asociación y las consideraciones espaciales sugieren que CD8 puede establecer las primeras interacciones con el MHC de clase I y aumentar la probabilidad de que el TCR busque y se doble para involucrar productivamente al MHC de clase I en un momento posterior.


Conclusiones

En este estudio, las mediciones de MRM MS y SEM se utilizan para evaluar dos preparaciones de células sanguíneas humanas en busca de materiales de referencia de células óptimos para la citometría de flujo cuantitativa que sean más estables y fáciles de mantener que la sangre entera fresca. Debido al proceso de liofilización, el valor de la densidad de CD4 en los linfocitos CD4 + de las células Cyto-Trol es menor que el valor de las PBMC criopreservadas, lo que probablemente se explica por el truncamiento de las proteínas del receptor CD4 y las microvellosidades dañadas o rotas donde residen los receptores CD4. Por otro lado, el impedimento estérico de la unión de anticuerpos y la asociación de receptores CD4 con otras biomoléculas probablemente contribuyan significativamente al valor de densidad del receptor CD4 cercano al 50% más bajo para PBMC criopreservadas determinado por citometría de flujo que el valor obtenido de MRM MS.

La expresión constante de CD4 en las células T en PBMC de donantes normales, que sirve como control biológico, mejora la confiabilidad de los diagnósticos clínicos y las inmunoterapias. Esta proteína receptora CD4 también juega un papel crucial en la progresión de la infección viral por VIH-1, ya que la proteína viral gp120 se une al receptor CD4 en las células T, lo que lleva a la entrada viral y la desintegración celular [15]. Aunque se han realizado numerosos esfuerzos en el desarrollo de vacunas contra la infección, el éxito es limitado en gran parte debido a la complejidad del proceso de infección viral y las técnicas de medición sólidas limitadas que respaldan la comprensión de los mecanismos subyacentes de las vacunas de prueba. Las tres potentes técnicas utilizadas en este estudio, citometría de flujo, MRM MS y microscopía electrónica de barrido, nos permitieron comprender mejor los cambios provocados por el proceso de liofilización de los linfocitos CD4 +. Estas técnicas permitirían medir la densidad del receptor CD4 y el número de anticuerpos monoclonales anti-CD4, por ejemplo, ibalizumab [16] e ibalizumab biespecífico [17], unidos a células portadoras de receptores CD4. Estas mediciones ayudarían enormemente a arrojar luz sobre los mecanismos subyacentes de dos vacunas de prueba para el tratamiento y la prevención del VIH-1. Además, la expresión de la superficie de las células CD4 modulada por disminución y la localización subcelular [18], y el agotamiento de la proteína CD4 de la superficie [19] se han informado en la literatura en algunos casos de infección por VIH. Sin duda, sería más difícil aplicar estas técnicas para medir las proteínas CD4 internalizadas en diferentes compartimentos celulares.


RESULTADOS

Coinmunoprecipitación específica de CD4 y CCR5 de líneas celulares.

Se encontró previamente que el fragmento soluble D1D2, pero no toda la porción extracelular de CD4, interfiere con la quimiocina MIP-1α para unirse a CCR5, lo que indica posibles interacciones entre CD4 y CCR5 (11). Aunque las diferencias entre los fragmentos de dos y cuatro dominios de CD4 podrían atribuirse a una mejor exposición de los epítopos conformacionales en el fragmento de CD4 de dos dominios, una posibilidad alternativa es que la interacción CD4D1D2-CCR5 no refleje las propiedades de la unión de CD4 de tipo salvaje (asociada a la membrana) a CCR5. Por lo tanto, utilizamos un ensayo de inmunoprecipitación, optimizado para una alta eficiencia y reproducibilidad, para detectar directamente las interacciones entre el CD4 nativo asociado a la membrana y el CCR5.

Para demostrar la coinmunoprecipitación de CD4 y CCR5 asociados a la superficie celular, utilizamos líneas celulares 3T3 transfectadas para expresar CD4 (3T3.CD4), CD4 y CXCR4 (3T3.CD4.CXCR4) o CD4 y CCR5 (3T3.CD4.CCR5). Las concentraciones de CD4 en las superficies de estas células fueron muy similares: sus proporciones fueron 1,26: 1,2: 1, respectivamente, medidas mediante citometría de flujo (los datos no se muestran, ver también la Fig.1A, carril II). Las concentraciones de superficie de CCR5 y CXCR4 también fueron muy similares (no se muestran los datos de citometría de flujo). Debido a que CD4 es más fácil de detectar mediante transferencia Western y biotinilación que CCR5, en la mayoría de los casos utilizamos anticuerpos anti-CCR5 para coinmunoprecipitar CD4. Encontramos que el mAb 5C7 (29) específico del extremo N era el anticuerpo más eficaz para inmunoprecipitar CCR5 en comparación con una batería de otros anticuerpos anti-CCR5 (datos no mostrados). Este mAb coinmunoprecipitó CD4 asociado a la superficie en líneas celulares 3T3 que coexpresan CD4 y CCR5 (Fig.1A, carril IV). La banda era CD4 porque se alinea con la banda CD4 obtenida por inmunoprecipitación directa usando un mAb anti-CD4 (OKT4) (Fig.1A, carril II), tiene el peso molecular esperado (55 kDa) y reacciona específicamente en el ensayo de transferencia Western (Fig.1A, carril V). El CD4 se enriqueció alta y específicamente en los coinmunoprecipitados, como se observó al comparar los lisados ​​biotinilados de la superficie celular que no se sometieron a inmunoprecipitación (Fig.1A, carril I) con los coinmunoprecipitados (Fig.1A, carril IV). En estos experimentos, CCR5 no se detectó debido a la baja eficiencia de la biotinilación, sin embargo, se observó mediante el uso de Western Blot (Fig.1A, carril VI). Se obtuvieron resultados similares para varias líneas celulares, incluidos los transfectantes PM1 y L1.2, que coexpresan CCR5 y CD4 (datos no mostrados).

Coinmunoprecipitación específica de CD4 y CCR5 asociados a la superficie celular de células 3T3 que coexpresan estas dos moléculas. (A) Se biotinilaron cantidades iguales de células 3T3 que expresan CD4 y CCR5 (+) o solo CD4 (-), procesadas como se describe en Materiales y métodos, y se utiliza como un lisado de células completas (0,25% del total, gel I) o inmunoprecipitado con un mAb anti-CD4 (OKT4) (gel II), mAb anti-CXCR4 (4G10) (gel III) o anti- CCR5 mAb 5C7 (geles IV-VI). Las proteínas biotiniladas se detectaron mediante el uso de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (geles I-IV). CD4 y CCR5 se detectaron en una alícuota de las mismas muestras que en el gel IV mediante transferencia Western con un anticuerpo policlonal anti-CD4 (T4-4) (gel V) o un anticuerpo policlonal anti-CCR5 [CKR5 (C20)] ( gel VI). (M denota marcadores moleculares y los números están en kDa). (B) Coinmunoprecipitación de CD4 por los mAbs anti-CCR5 m180 (carril 1) y m181 (carril 2). El CD4 coinmunoprecipitado y el CCR5 inmunoprecipitado se detectaron mediante transferencia Western sing como en A. (C) Coinmunoprecipitación de CCR5 de células 3T3.CD4.CCR5 con anticuerpos anti-CD4. Se usaron células 3T3.CD4.CCR5 (carriles 1, 2 y 4) o células 3T3.CD4 (carril 3) para la inmunoprecipitación por OKT4 (carriles 2 y 3) o por un anticuerpo de control (CG10) (carril 4). El carril 1 muestra para comparación la inmunoprecipitación con el mAb anti-CCR5 5C7. CD4 y CCR5 se detectaron mediante Western blot como en A. (D) Los lisados ​​celulares se inmunoprecipitaron con el mAb 5C7 anti-CCR5, el producto de inmunoprecipitación se analizó utilizando un kit de tinción de plata (carriles 1 y 2) y se comparó con proteínas detectadas por estreptavidina-peroxidasa de rábano picante en lisados ​​biotinilados (carriles 3 y 4). M denota marcador de peso molecular, y + y - denotan células 3T3.CD4.CCR5 o 3T3.CD4, respectivamente. ∗, bandas causadas por CD4 y CCR5. Las dos bandas por encima y por debajo de CD4 están causadas por la cadena pesada y ligera del mAb 5C7, respectivamente. El carril 2 representa el carril 1 con mayor sensibilidad, donde se ve claramente CCR5. (mi) La coinmunoprecipitación de CD4-CCR5 no se ve afectada significativamente por la depleción del colesterol. Las células 3T3.CD4.CCR5 se trataron con metil-β-ciclodextrina 10 mM durante 1 hora a 37 ° C (que causó una citotoxicidad significativa) y se usaron para la inmunoprecipitación por el anticuerpo anti-CCR5 5C7 (carril 2), y se compararon con células no tratadas (carril 1) y células 3T3.CD4 (carril 3). CD4 y CCR5 se detectaron mediante Western blot como en A. Fondo muestra la transferencia Western de CD4 de lisados ​​de células completas.

La especificidad de la coinmunoprecipitación de CD4 se demostró mediante varios experimentos de control. El mAb anti-CCR5 5C7 no coinmunoprecipitó CD4 de células 3T3.CD4 que no expresan CCR5 (Fig.1A, carriles IV y V). En otro experimento, se usó un anticuerpo (4G10) contra un receptor de quimiocina relacionado (CXCR4). Este anticuerpo es capaz de inmunoprecipitar eficazmente CXCR4 y coinmunoprecipitar CD4 y CXCR4 en células que expresan estas dos moléculas (Fig.3A) pero no coinmunoprecipitó CD4 en células que expresan CD4 y CCR5 (Fig.1A, carril III). Además, la cantidad de CD4 coinmunoprecipitado fue proporcional a la cantidad de CCR5 inmunoprecipitado, demostrado mediante el uso de dos mAb anti-CCR5 con diferentes actividades de inmunoprecipitación (Fig.1B), lo que sugiere además una interacción CD4-CCR5 específica. Coinmunoprecipitamos CCR5 con un anticuerpo anti-CD4 (OKT4) (Fig.1C, carril 2), pero no con un anticuerpo de control (CG10), que no se une a CD4 (carril 4), en células que coexpresan estas dos moléculas (carril 2), pero no en células CCR5 negativas (carril 3).

Para evaluar más a fondo la especificidad de la interacción CD4-CCR5 y abordar la cuestión de si otras proteínas interactúan con CCR5 e influyen potencialmente en la asociación CD4-CCR5, utilizamos tinción con plata de proteínas inmunoprecipitadas por el mAb 5C7 anti-CCR5 en paralelo con biotinilación. (Algunas proteínas, en particular los receptores de quimiocinas, están mal marcadas por la biotina y es posible que no se detecten en concentraciones bajas). Aparte de las bandas correspondientes a CCR5 y CD4, las únicas otras bandas principales son las que representan las cadenas pesada y ligera del mAb 5C7 precipitante y las bandas que aparentemente no son específicas de CCR5, porque fueron inmunoprecipitadas en células CCR5 negativas (Fig. 1D). Estos datos no solo implican que la interacción entre CD4 y CCR5 no está mediada por otra molécula, sino que también indican que es poco probable que la coinmunoprecipitación de CD4 y CCR5 se deba a la compartimentación de estas dos moléculas dentro de microdominios de membrana definidos, lo que conduciría a la coinmunoprecipitación de un mayor número de proteínas. Otro experimento que apoya esta noción muestra que la lisis celular con dos detergentes diferentes (Brij97 y NP40) no interrumpió la interacción CD4-CCR5 (datos no mostrados). Además, el agotamiento del colesterol de la membrana celular con metil-β-ciclodextrina, un procedimiento que se demostró que altera la estructura del microdominio (ver, por ejemplo, ref.30), no bloqueó la coinmunoprecipitación de CD4 y CCR5 (Fig.1mi).

Coinmunoprecipitación de CD4 y CCR5 en linfocitos T CD4 + primarios, macrófagos y monocitos.

También se obtuvieron resultados similares a los descritos anteriormente para líneas celulares con células humanas primarias susceptibles a la entrada del VIH-1. Nuestros intentos iniciales de coinmunoprecipitar CD4 y CCR5 de la superficie de los linfocitos T primarios dieron como resultado bandas muy débiles que estaban en el límite de la sensibilidad del ensayo, debido al bajo nivel de expresión de CCR5 en la superficie de estas células y al porcentaje relativamente pequeño de células. expresándolo según lo evaluado por citometría de flujo (datos no mostrados). Mediante el uso de dos procedimientos alternativos para activar las células T CD4 +, como se describe en Materiales y métodos, la expresión de CCR5 aumentó significativamente a niveles altos (+) y muy altos (++), correspondientes en promedio a ≈2–4 × 10 3 y 3–5 × 10 4 moléculas, respectivamente, según lo estimado mediante citometría de flujo cuantitativa . En estas células, los niveles de CD4 fueron similares y la cantidad de CD4 coinmunoprecipitada con el mAb 5C7 anti-CCR5 se correlacionó con su eficiencia de fusión celular (Fig.2A). La cantidad de CD4 coinmunoprecipitado en macrófagos y monocitos humanos también se correlacionó con la eficiencia de su fusión con células que expresan la Env JRFL de VIH-1 (Fig.2B) pero no con la concentración superficial de CD4. De hecho, los monocitos expresaron niveles similares o más altos de CD4, pero la cantidad de CD4 coinmunoprecipitado fue indetectable o apenas detectable en nuestro ensayo (Fig.2B). Es probable que la mayor cantidad de CD4 coinmunoprecipitado en los macrófagos esté relacionada con los niveles más altos de CCR5 en comparación con los monocitos, en promedio ≈5-10 × 10 3 frente a & lt2 × 10 3 moléculas por célula según se estima mediante citometría de flujo cuantitativa. Sin embargo, los niveles de CCR5 en macrófagos fueron más bajos en comparación con las células T ++ CD4 +, y no pudimos detectar el CCR5 inmunoprecipitado por transferencia Western (datos no mostrados).

Coinmunoprecipitación de CD4 y CCR5 en células primarias. (A) Se usaron células T CD4 humanas que expresan cantidades altas (+) y muy altas (++) de CCR5 para la inmunoprecipitación con el mAb anti-CCR5 5C7 (Centrar) o fusión con células HeLa que expresan la Env JRFL del VIH-1 (Izquierda y Derecha). El CD4 coinmunoprecipitado (Parte superior central) y CCR5 inmunoprecipitado (Centro Medio) se detectaron mediante Western blot como en la Fig.1A. Se muestra la transferencia Western CD4 de lisados ​​de células completas (Fondo) como medida del nivel de CD4. El número medio de sincitios para las células ++ fue 92 ± 10,5, para las células + fue 29 ± 7, y para las células HeLa de control fue 6 ± 3. El diámetro medio de sincitios de las células ++ fue aproximadamente 4 veces mayor que el para las celdas +. (B) Macrófagos humanos (Izquierda, carril 1) y monocitos (Izquierda, carril 2) se utilizaron para la inmunoprecipitación de CCR5. La coinmunoprecipitación de CD4 se detectó como en A. Se muestra el Western blot de CD4 de lisados ​​de células completas (Fondo) como medida del nivel de CD4. (Derecha) Fusión de estas células con células HeLa que expresan la Env JRFL de VIH-1 cuantificada mediante el ensayo de β-galactosidasa. El control representa células HeLa que no expresan Env de VIH-1.

La interacción de CD4 con CCR5 es más fuerte que con CXCR4 y no aumenta en presencia de gp120.

Anteriormente encontramos que CD4 podría asociarse débilmente con CXCR4 incluso en ausencia de gp120 (10). Sin embargo, los resultados variaron de una manera dependiente de la línea celular y la condición del ensayo. Para evaluar la fuerza de la asociación CD4-CCR5 en relación con la interacción CD4-CXCR4, se utilizaron líneas celulares 3T3 que expresan CD4 y CCR5 o CXCR4 en aproximadamente las mismas concentraciones de superficie. En las células 3T3.CD4.CXCR4, CD4 se asoció débilmente con CXCR4, pero la asociación aumentó drásticamente con la adición de X4 HIV-1 Env gp120 (IIIB) (Fig.3A). En contraste, la cantidad de CD4 coinmunoprecipitado por el mAb anti-CCR5 5C7 en las células 3T3.CD4.CCR5 fue alta incluso en ausencia de gp120, y la adición de X4R5 (89.6) o R5 (JRFL) HIV-1 Env gp120 no aumentó significativamente la coinmunoprecipitación CD4-CCR5 (Fig.3 B y C). La cantidad de CD4 coinmunoprecipitada por mAb anti-CCR5 en ausencia de gp120 fue aproximadamente la misma que la cantidad de CD4 coinmunoprecipitada por mAb anti-CXCR4 en presencia de gp120. Estos resultados indican que la asociación CD4-CXCR4 es más débil que la interacción CD4-CCR5 y que los complejos preformados entre CD4 y CCR5 están cerca de un nivel de saturación, donde la adición de gp120 no puede incrementar más su formación de complejos.

El efecto de gp120 en la asociación CCR5 – CD4 y CXCR4 – CD4. (A) Se incubaron células 3T3.CD4.CXCR4 con el mAb 4G10 anti-CXCR4 en ausencia (-) o presencia (+) (5 μg / ml) de gp120 de VIH-1 IIIB. El CD4 y CXCR4 se detectaron mediante Western blot con el policlonal anti-CD4 Ab T4–4 o 4G10. (B) Se incubaron células 3T3.CD4.CCR5 con el mAb anti-CCR5 5C7 en ausencia o presencia (5 µg / ml) de 89,6 gp120 de VIH-1. El CD4 y CCR5 se detectaron mediante el uso de Western blot como se describe en la Fig.1A. (C) Lo mismo que en B pero se usó gp120 del R5 HIV-1 JRFL en lugar del trópico dual 89.6.

Los dos primeros dominios de CD4 y el segundo bucle extracelular de CCR5 probablemente estén implicados en la formación del complejo CD4-CCR5.

Para identificar posibles regiones de CD4 que son responsables de la interacción con CCR5, usamos una línea celular (A2.01.T4.T8) que expresa una molécula híbrida CD4-CD8 que contiene los dos primeros dominios de CD4, que previamente se demostró que apoya Fusión mediada por Env del VIH-1 (31) aunque a una tasa menor que la del CD4 de tipo salvaje (16). Se indujo a las células A2.01.T4.T8 a expresar CCR5 con un virus vaccinia recombinante que codifica el gen CCR5. Estas células, que coexpresan CCR5 y la molécula híbrida CD4-CD8, se fusionaron con células que expresan R5 HIV-1 Env Bal, aunque con una eficiencia algo menor en comparación con las células que expresan CD4 de tipo salvaje (datos no mostrados). Estos resultados son análogos a nuestras observaciones previamente informadas de la fusión entre las células A2.01.T4.T8 y las células que expresan el X4 HIV-1 Env IIIB (16). Las moléculas CD4-CD8 fueron coinmunoprecipitadas por un mAb anti-CCR5 de las células A2.01.T4.T8 que expresan CCR5, pero no de las infectadas con el virus vaccinia de tipo salvaje de control (Fig.4A). Los niveles de superficie de moléculas CD4-CD8 en las células infectadas con el CCR5 y los virus vaccinia de tipo salvaje no fueron significativamente diferentes según lo cuantificado por citometría de flujo (datos no mostrados) y Western blot (Fig.4B). Para establecer que la porción CD8 de la molécula híbrida CD4-CD8 no estaba involucrada en la interacción con CCR5, usamos células HeLa que expresan CD4 o CD8. CCR5 se expresó de nuevo en estas células mediante virus vaccinia recombinante. En esas células, solo CD4, pero no CD8, se coinmunoprecipitó con un mAb anti-CCR5 (5C7), lo que demuestra que es poco probable que la porción CD8 de la molécula híbrida CD4-CD8 esté involucrada en la interacción con CCR5 (datos no mostrados). Juntos, estos resultados sugieren que los dos primeros dominios de CD4 se asocian con CCR5.

Participación de los dos primeros dominios de CD4 y el segundo bucle extracelular de CCR5 en la asociación CD4-CCR5. (A) Coinmunoprecipitación de moléculas híbridas CD4-CD8 que contienen los dos primeros dominios de CD4 por un mAb anti-CCR5. Las células A2.01.T4.T8 que expresan la molécula híbrida CD4-CD8 se infectaron con un virus vaccinia recombinante (vvCCR5-1107) (carril 1), que codifica el gen para CCR5, y un virus vaccinia de control de tipo salvaje (WR). (carril 2). El mAb anti-CCR5 5C7 se usó para inmunoprecipitar CCR5 y T4-4 para la detección de CD4 mediante transferencia Western. (B) La cantidad de moléculas CD4-CD8 en las células A2.01.T4.T8 infectadas con el virus vaccinia CCR5 (carril 1) o WR (carril 2) no fue significativamente diferente, como lo demostró la transferencia Western con un anti-CD4 Ab (T4 –4). (C) La coinmunoprecipitación de CCR5 por un mAb anti-CD4 (OKT4) se inhibe en presencia de otro mAb anti-CD4 (CG7). A modo de comparación, el carril 1 muestra CCR5 inmunoprecipitado por 5C7. Los carriles 2, 3 y 4 representan la cantidad de CCR5 coinmunoprecipitado por una mezcla de OKT4 (líquido ascítico 3,5 μl / ml) y concentraciones crecientes del mAb CG7 anti-CD4 (0, 5 y 10 μg / ml, respectivamente). (D) La coinmunoprecipitación de CD4 por 5C7 se inhibe en presencia de otro mAb anti-CCR5 (2D7) (29) dirigido al segundo bucle extracelular. Se mezclaron cantidades iguales (3 μg / ml) de 5C7, que no afecta la entrada del VIH, con cantidades crecientes (0, 3 y 6 μg / ml) (carriles 1, 2 y 3, respectivamente) del VIH-1. -bloqueante mAb 2D7 y utilizado para inmunoprecipitación. La muestra obtenida de 9 × 10 6 células 3T3.CD4.CCR5 se dividió en dos porciones, y la más pequeña (1/6 del total) se utilizó para Western blot de CD4 por T4-4, y el resto se utilizó para Western mancha de CCR5 por el CKR5 (C20). (mi) El mAb 5C7 (carril 2) específico del extremo CCR5 inmunoprecipita CCR5 mucho más eficazmente que el mAb 2D7 específico del CCR5 ecl-2 (carril 1). Se usaron cantidades iguales (4 µg / ml) de estos dos mAb para la inmunoprecipitación de CCR5 en células 3T3.CD4.CCR5. Los marcadores moleculares se muestran en el lado derecho (carril M). (F y GRAMO) Inhibición diferencial por dos mAb anti-CCR5, m182 y m183 (que no inmunoprecipitan CCR5 según lo medido por nuestro ensayo) de la coinmunoprecipitación de CCR5 por el mAb anti-CD4 OKT4. Los carriles 1, 2 y 3 representan 1, 2 y 4 μg / ml de m182 y m183, respectivamente. Se detectó CCR5 mediante transferencia Western con CKR5 (C20).

También confirmamos las observaciones anteriores de que un fragmento soluble de CD4 que consta de los dos primeros dominios (sCD4D1D2) compite con la proteína inflamatoria de macrófagos (MIP) 1-α por CCR5 (11). Curiosamente, encontramos que la infección por VIH-1 que inhibe mAb CG7 a 60 nM bloquea casi por completo la capacidad de sCD4D1D2 para desplazar la quimiocina MIP-1α (Tabla 1). El mismo anticuerpo inhibió significativamente la coinmunoprecipitación de CCR5 por el mAb anti-CD4 OKT4 (Fig.4C). A diferencia de CG7, un segundo mAb anti-CD4 (CG1) y un mAb de control (CG10) no fueron efectivos para prevenir el desplazamiento de MIP1-α por sCD4D1D2 (Tabla 1). Aunque no sabemos si sCD4D1D2 representa un buen modelo para CD4 nativo con respecto a la unión de CCR5, estos resultados sugieren que regiones específicas de CD4, potencialmente aquellas que se superponen al epítopo de CG7, probablemente ubicadas dentro del primer dominio CD4 (32), son involucrado en la asociación con CCR5.

Inhibición del desplazamiento CG7 de MIP-1α

Para localizar regiones de CCR5 que interactúan con CD4, utilizamos mezclas de mAbs que reconocen el extremo N y el primer (ecl-1) y segundo (ecl-2) bucles extracelulares de CCR5. El aumento de la concentración de un mAb contra el ecl-2 de CCR5 (2D7) en una mezcla con el 5C7 redujo la cantidad total de CD4 coinmunoprecipitado (Fig.4D), mientras que la cantidad de CCR5 inmunoprecipitado se incrementó ligeramente (Fig.4D), probablemente como resultado de la inmunoprecipitación adicional, aunque débil, de CCR5 con 2D7 (Fig.4mi). Another HIV-1-blocking mAb specific for the CCR5 ecl-2 (m182 R&D Systems) showed similar although weaker inhibitory effects (Fig. 4F) in contrast to the non-HIV-1-blocking anti-CCR5 mAb m183, which did not interfere with the CD4–CCR5 coimmunoprecipitation (Fig. 4GRAMO). Other mAbs to the N terminus and mAbs to ecl-1 of CCR5 did not decrease the amount of coimmunoprecipitated CD4 when used in combination with 5C7 (data not shown). These results suggest that the ecl-2 of CCR5 is involved in the interaction with CD4. However, even at the highest concentration of mAb (2D7) used (50 μg/ml), the inhibition of the CD4–CCR5 coimmunoprecipitation was not complete, indicating that regions additional to the second extracellular loop of CCR5 are probably involved in the interaction with CD4.

Membrane-Associated CD4 Colocalizes with CCR5.

We further examined whether the CD4 and CCR5 molecules associate by using confocal laser scanning microscopic analysis of fluorescently labeled molecules. Colocalization of the two molecules was observed as demonstrated by the yellow (red-green colocalization) staining, suggesting formation of large multimolecular complexes between these two molecules (Fig. 5). A correlation map was prepared by using software developed in this laboratory. The regions of true overlap of green and red staining were selected from the noncolocalized staining and the background fluorescence and represented as white dots. A relatively high degree of colocalization is evident from this analysis (Fig. 5 Más bajo). Less colocalization was observed between CD4 and CXCR4 (Fig. 5 Izquierda) than with CCR5. It was previously shown that addition of X4 HIV-1 Env gp120 increases the colocalization of CD4 and CXCR4 (13). The extent of this increase appears to be comparable with the colocalization between CD4 and CCR5 in the absence of gp120 in a manner reminiscent of the immunoprecipitation data shown in Fig. 3. No significant colocalization was observed between CD45 and CCR5 or HLA class I and CCR5, suggesting specificity in the interaction between CD4 and CCR5 (data not shown). These results suggest that CCR5 (and to a lesser extent CXCR4) not only associates with native membrane-associated CD4 but that the two molecules form large multimolecular complexes possibly because of their dimeric structures (ref. 33, and data not shown).

Colocalization of CD4 and CXCR4 (Izquierda) or CCR5 (Derecha). A CXCR4 (or CCR5)-myc tag-expressing HeLa cell, double stained for CD4 (green) and CXCR4 (or CCR5) (red) (Superior). Colocalization of the two molecules is demonstrated by the yellow (red-green colocalization) staining, suggesting their clusterization. Correlation maps of these images (Fondo) show the regions of true overlap of green and red staining selected from the noncolocalized staining and the background fluorescence, represented as white dots.

Inhibition of the CD4–CCR5 Interaction Correlates with the Inhibition of HIV-1 Env-Mediated Fusion.

It has been demonstrated that the anti-CCR5 mAb 2D7 inhibits entry of R5 and R5X4 HIV-1 into U87MG-CD4 cells expressing transfected CCR5 (24). To investigate the possibility of a relationship between inhibition of the CCR5–CD4 interaction and HIV-1 Env-mediated fusion, we used a recombinant vaccinia virus-based reporter gene assay for quantitation of cell–cell fusion (19). The mAb 2D7 inhibited fusion between 3T3.CD4.CCR5 cells and cells expressing R5 (Bal and JRFL) and R5X4 (89.6) HIV Envs. The inhibition was concentration-dependent, and cell–cell fusion was significantly decreased at concentrations in the range of 0.5–50 μg/ml, a concentration range similar to that observed for inhibition of the CD4–CCR5 interaction (data not shown). For several other anti-CCR5 mAbs, there was correlation (r = 0.98, PAG = 0.001) between inhibition of fusion and inhibition of the CD4–CCR5 interaction (Table 2). These results indicate that the CD4–CCR5 interaction may play a role in membrane fusion mediated by the HIV-1 Env. However, as was similar to the inhibition of the CD4–CCR5 interaction, even at the highest mAb concentration used (50 μg/ml), the inhibition of fusion was not complete. The lack of complete inhibition of fusion suggests that multiple interactions, possibly both CD4–CCR5 and gp120–CCR5, and multiple interaction sites involving other extracellular regions of CCR5, are involved in the initial steps of HIV-1 entry.

Correlation between inhibition of HIV-1 (Bal)-mediated fusion and CD4–CCR5 interactions by anti-CCR5 mAbs


Materiales y métodos

Cell-culture reagents

Cells were cultured in RPMI 1640 culture medium supplemented with 10% fetal calf serum (FCS Hyclone Laboratories, Logan, UT), 2 mM l -glutamine, 50 μg/mL gentamicin, 1 mM sodium pyruvate, and 1% nonessential amino acids (complete medium). DCs were stimulated with 1 μg/mL lipopolysaccharide (LPS Escherichia coli 0111:B4 Sigma Chemical, Saint Louis, MO) CD154-transfected J558L cells at a ratio of 4:1 and 5 μM cytosine phosphate guanosine (CpG) oligonucleotide 2216 type A or CpG oligonucleotide 2006 type B (InvivoGen, San Diego, CA). CD4 + T cells were stimulated with anti–human CD3 mAb (clone TR66). Crystalline 1,25(OH)2D3 was a gift of Milan Uskokovic (BioXell, Nutley, NJ), dexamethasone was purchased from Sigma Chemical, and recombinant human (rh) IL-10 from PharMingen (San Diego, CA).

Cell purification

Peripheral-blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from buffy coats by Ficoll gradient (Pharmacia Biotec AB, Uppsala, Sweden). Peripheral-blood myeloid DCs (M-DCs) and plasmacytoid DCs (P-DCs) were magnetically sorted with blood dendritic-cell antigen-1 (BDCA-1) and BDCA-4 cell-isolation kits (Miltenyi Biotec, Bergish Gladblach, Germany), respectively, as described, 27 to a purity of 95% to 98% in both cases. DC subsets were analyzed either immediately or after culture in complete medium in the presence of 10 ng/mL recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (rhGM-CSF) or 20 ng/mL IL-3 (Pharmingen), respectively. To generate immature monocyte-derived DCs, monocytes, obtained from PBMCs by positive selection with CD14 beads (Miltenyi Biotec), were grown for 6 to 7 days in complete medium plus 10 ng/mL rhGM-CSF and 10 ng/mL IL-4 (PharMingen). CD4 + T cells were purified from PBMCs by negative selection with CD4 T-cell-isolation kit (Miltenyi Biotec), and CD4 + CD25 + T cells were subsequently positively selected with CD25 beads (Miltenyi Biotec).

Flow cytometric analysis

Flow cytometric analysis was performed as previously described, 7 in the presence of 100 μg/mL mouse IgG, using the mAbs anti-CD1c (BDCA-1) fluoroscein isothiocyanate (FITC) or phycoerythrin (PE), anti–BDCA-2 FITC or PE (Miltenyi Biotec), anti-CD1a FITC/PE, and anti-CD83 FITC/PE, all from Pharmingen, or with mAbs specific for ILT1 (clone 135.1), ILT2 (clone GHI75), ILT3 (clone ZM3.1), ILT4 (clone 42D.1), and ILT5 (clone 7H5). Cells were analyzed with an LSR flow cytometer (Becton Dickinson, Mountain View, CA) using CellQuest software (Becton Dickinson).

Activación de células T

Peripheral-blood DC subsets were cultured for 5 days in complete medium and for an additional 7 days in the presence of CD4 + T cells with or without 20 μg/mL anti-ILT3 antibody. Intracellular cytokine production by CD4 T-cell lines was analyzed as described. 28 CD4 + T cells were cultured in 96-well flat-bottom plates with graded amounts of immature monocyte-derived DCs, which had been cultured for the last 48 hours with or without 10 nM 1,25(OH)2D3. The coculture of DCs and T cells was carried out in the presence or absence of anti-ILT3 mAb. After 5 days of culture, interferon-γ (IFN-γ) production was measured by 2-site enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Alternatively, CD4 + T cells were cultured in the presence of immature monocyte-derived DCs (ratio, 1:10) with or without anti-ILT3 and 7 to 10 days after primary stimulation, were restimulated under the same conditions. After 2 rounds of stimulation, CD4 + T cells were cultured in 96-well round-bottom plates precoated by overnight incubation with anti–human CD3 mAb. After 72 hours, cytokine production was quantified by 2-site ELISA. Paired mAbs specific for IFN-γ, IL-4, and IL-10 (Pharmingen), were used as described. 7 The detection limit for all cytokines was 15 pg/mL.

Suppression assay

The read-out system was composed of CD4 + CD25 – cells from donor A PBMCs labeled with Vybrant CFDA (carboxyfluorescein diacetate) succinimidyl ester (SE) cell tracer kit (Molecular Probes, Leiden, the Netherlands) and cultured in the presence of 1:10 LPS-matured monocyte-derived DCs from donor B. To evaluate the induction of regulatory T cells, graded amounts of CD4 + T cells from donor C were generated by 3 rounds of restimulation with allogeneic immature monocyte-derived DCs from donor D, which were cultured for the last 48 hours with or without 1,25(OH)2D3. The coculture was carried out with or without anti-ILT3 mAb (20 μg/mL). The suppression assay was performed in the presence of 1 μg/mL anti–human CD3 mAb. After 72 to 96 hours of culture, cells were recovered and analyzed with an LSR flow cytometer (Becton Dickinson) using CellQuest software.

Real-time quantitative RT-PCR

RNA was extracted using Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) according to the manufacturer's instruction, followed by a cleanup with the RNeasy Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Reverse transcription (RT) was performed, and real-time quantitative RT–polymerase chain reaction (PCR) of total cDNA using specific primers was carried out using an ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) and Taqman chemistry. The primers used are commercially available from Applied Biosystems as assays on demand. Relative quantification of target cDNA was determined by arbitrarily setting the control value to 1 and changes in cDNA content of a sample were expressed as a multiple thereof. Differences in cDNA input were corrected by normalizing to β actin or GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) signals. To exclude amplification of genomic DNA, RNA samples were treated with DNAse (Sigma Chemical).

Immunohistology

Skin biopsies were obtained from untreated psoriatic plaques or from psoriatic lesions of 5 patients treated topically for 30 days with 0.005% calcipotriol cream (Psorcutan Schering, Milan, Italy) twice daily, or for 20 days with 0.1% mometasone furoate cream (Elocon Schering-Plough, Milan, Italy) twice daily, and snap-frozen in liquid nitrogen. Immunohistology was performed on 5-μm-thick cryostat sections fixed in acetone and dried overnight, as described. 29 Before incubation with specific mAbs or control isotype mouse Ig's, sections were hydrated for 10 minutes with 0.05 M Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethane)–aminomethane saline buffer (TBS), pH 7.6, and incubated for 10 minutes with a mixture of normal human AB serum and normal rabbit serum (20% in TBS), to minimize nonspecific staining. Then, after washing in TBS, the sections were incubated for 30 minutes with specific mAbs, followed by polyclonal rabbit antimouse serum diluted 1/30 in TBS (Dako-Patt, Copenhagen, Denmark) and alkaline phosphatase anti–alkaline phosphatase complex diluted 1/50 in TBS (Dako-Patt). Finally, stainings were revealed using new fucsin (75 μL of a new fucsin–sodium-nitrite solution) in 10 mL of 0.05 M TBS, pH 8.7 5 mg naphthol AS-BI (7-bromo-3-hydroxy-2-naphtho- o -anisidine) sodium salt and 1 mM levamisole (Sigma Chemical). Sections were counterstained with Mayer haematoxylin, washed in water, and dried at room temperature before mounting. Slides were observed with a Leica light microscope (DMR Leica Microsystems, Milan, Italy) equipped with an HC Plans 10×/2.2 ocular and an N plan 20×/0.40 objective lens.

Immunofluorescent stainings were performed on 5-μm-thick frozen sections from skin biopsies of calcipotriol-treated psoriatic plaques. After fixing for 15 minutes in 4% paraformaldehyde and blocking with 0.1 M glycine for 10 minutes at room temperature, slides were incubated overnight at 4°C in blocking solution with affinity-purified rabbit anti–mouse CD11c (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA), washed 5 times with wash buffer (0.45 M NaCl, 0.24 M Na2HPO4, 0.24 M NaH2PO4, and 0.3% Triton X-100), and incubated for 60 minutes with polyclonal antirabbit FITC (Sigma Chemical). Alternatively, slides were incubated overnight at 4°C with biotinylated rat anti–mouse CD123 (Jackson Immunoresearch) followed by Rhodamine Red-X-streptavidin (Jackson Immunoresearch). Negative controls were performed by incubation with appropriate isotype-matched primary antibodies. The slides were then washed again and mounted with 90% glycerol/phosphate-buffered saline (PBS). Slides were analyzed with an MRC-1024 laser-scanning confocal microscope (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Images were acquired and processed with Laser Sharp 3.2 software (Bio-Rad).

1,25(OH)2D3 enhances ILT3 expression on DCs. Monocyte-derived human DCs were incubated for 48 hours with medium alone or containing 10 nM 1,25(OH)2D3 or 10 ng/mL IL-10, either when immature or during LPS-induced (100 ng/mL) maturation. Surface expression of the indicated ILT molecules was determined by cytofluorimetry. Histograms represented by broken lines show staining with an isotype control those with thick lines show staining with the indicated anti-ILT mAbs. Geometric mean fluorescence intensity (MFI) values are shown in the top right corner. A representative experiment out of 6 performed is shown.

1,25(OH)2D3 enhances ILT3 expression on DCs. Monocyte-derived human DCs were incubated for 48 hours with medium alone or containing 10 nM 1,25(OH)2D3 or 10 ng/mL IL-10, either when immature or during LPS-induced (100 ng/mL) maturation. Surface expression of the indicated ILT molecules was determined by cytofluorimetry. Histograms represented by broken lines show staining with an isotype control those with thick lines show staining with the indicated anti-ILT mAbs. Geometric mean fluorescence intensity (MFI) values are shown in the top right corner. A representative experiment out of 6 performed is shown.


Authorship

Contribution: J.M.M. designed and performed experiments, analyzed results, made figures, and wrote the manuscript B.R.L. designed experiments, participated in discussion of the results, and reviewed the paper J.E.S.-C. designed experiments and reviewed the paper A.J.C. performed experiments and reviewed the paper V.A.Y. performed experiments L.C.N., J.M., and D.F.N. participated in discussion of the results and reviewed the paper and L.L.L. participated in discussion of the results and edited the paper.

Conflict-of-interest disclosure: The authors declare no competing financial interests.


Discusión

A novel anti-TLR5 monoclonal antibody, ACT5, revealed the cell surface expression of TLR5 on immune cells. The recruitment of TLR5 to the cell surface was completely dependent on TLR-specific chaperone PRAT4A. In Ba/F3 cells, PRAT4A physically associated with TLR5. PRAT4A knock-down resulted in marked suppression of NF-κB activation in response to flagellin. In addition, in a macrophage cell line J774, PRAT4A silencing abolished cell surface expression of endogenous TLR5 and flagellin-dependent cytokine production. These results suggest that PRAT4A-dependent cell surface expression of TLR5 is required for flagellin-induced cytokine production. Previous studies report that PRAT4A associates with a general chaperone gp96 and restricts gp96 client to TLRs ( 21). Taken together with the requirement of gp96 for flagellin response ( 20), the present results demonstrate that TLR5 is another client of the chaperone complex PRAT4A–gp96.

It is well established that TLR5 activates MyD88-dependent signaling pathways to induce cytokine production and DC maturation ( 4, 12). While cell surface TLR2/4-signaling requires a ‘sorting adaptor’, TIRAP, to recruit MyD88 to the cell surface TLR ( 17), a previous report demonstrated that TLR5 does not need TIRAP for cytokine production ( 16). Here, we confirm that TLR5 is another cell surface TLR, suggesting that MyD88 pathway from cell surface does not necessarily require TIRAP. TIRAP-independent MyD88 signaling from cell surface TLR5 may be a reason why flagellin, in contrast to LPS, is poor inflammatory and less relation to severe organ failure ( 37).

ACT5 revealed highly restricted expression of TLR5 on en vivo immune cells. Cell surface TLR5 was mainly detected on neutrophils, Ly6C hi classical monocytes, splenic CD8 − CD4 + /CD8 − CD4 − cDCs, splenic pDCs and CD11b hi CD11c hi lamina propria DCs. In acute inflammatory lesion, neutrophils and monocytes are swiftly recruited from the circulation and have a role in primary defense against microbial organisms. Neutrophils, Ly6C hi and Ly6C low monocytes infiltrated into the peritoneal cavity 12h after thioglycollate injection. Cell surface expression of TLR5 was detected on neutrophils and Ly6C hi classical monocytes, but not on Ly6C low monocytes. At 72h after thioglycollate injection, almost all exudate cells were TLR5 − Ly6C low monocytes. These findings indicate that cell surface TLR5 is one of the hallmarks of innate immune cells that are recruited early in inflammation.

All TLRs except TLR3 are expressed in human neutrophils and induce cytokine release, superoxide generation and CD62L shedding ( 38). However, neutrophils from mouse BM or an inflammatory lesion did not produce cytokines in response to flagellin despite the expression of TLR5 on the cell surface. Given a role for TLR5 in phagocytosis and ROS production ( 39), cell surface TLR5 in neutrophils may principally contribute to direct pathogen clearance rather than to cytokine production.

Based on cell surface markers, mice monocytes are subcategorized into two major subsets ( 40). The Ly6C hi CCR2 hi CX3CR1 low subset is called classical monocytes, which are recruited to a site of tissue injury or infection via CCR2-signaling and differentiate into macrophages or DCs. The other Ly6C low CCR2 low CX3CR1 hi subset, nonclassical monocytes, has a remarkable patrolling activity and gives rise to resident macrophages after entering tissues. This study showed that TLR5 is expressed on Ly6C hi , but not on Ly6C low monocytes in the BM, circulation and inflammatory lesions. Flagellin is able to induce IL-6 and MCP-1 production via cell surface TLR5 from Ly6C hi monocytes, suggesting that classical monocytes are one of the main sources of flagellin-induced cytokines in acute inflammation. Considering that Ly6C hi classical monocytes contributes to the gut immune system and have a role in protection against an enteric bacterium ( 41), flagellin-induced cytokines from classical monocytes have an important role in augmenting acute inflammation at mucosa.

In addition to neutrophils and classical monocytes, very restricted expression of cell surface TLR5 was also found in DCs. First, cell surface TLR5 was detected on CD8α − cDCs, but not on CD8α + cDCs, in the spleen. CD8α − cDCs are more potent in activating CD4 + helper T cells than CD8α + cDCs, and associate with induction of Th2-type response ( 42). Considering that flagellin has been shown to have the potent adjuvant activity with a tendency to induce Th2 response ( 12, 28), CD8α – cDCs, but not CD8α + cDCs, are likely to be required for the adjuvant activity of flagellin. Unexpectedly, splenic plasmacytoid DCs (pDCs), which is specialized to secrete large amounts of type I interferon, also express cell surface TLR5. As one report suggests that flagellin can induce IFN-β from BM-macrophages ( 43), flagellin may induce or augment the production of type I interferon in pDCs.

Against oral infection with a flagellated pathogen, TLR5 has a role in mounting adaptive immune responses ( 10, 36). CD11b hi CD11c hi DCs in the lamina propria express TLR5 mRNA and have a key role in activating flagellin-dependent adaptive immune responses. Consistent with these previous reports, our results showed that only CD11b hi CD11c hi DCs expressed TLR5 on the cell surface. In contrast to these en vivo DCs, TLR5 is barely detectable on BM-DCs. Similarly, TLR5 is detectable on Ly6C hi monocytes en vivo but not on BM-macrophages. These results reveal that BM-derived DCs/macrophages are distinct from en vivo DCs/macrophages. Unlike TLR2 and TLR4/MD-2, in vitro maturation induced by GM-CSF or M-CSF does not accompany cell surface expression of TLR5, implying that a signal is missing in in vitro maturation that induces cell surface TLR5.

In summary, our results show that TLR5 is expressed on the cell surface of neutrophils, classical monocytes and specific subpopulations of DCs, in a PRAT4A-dependent manner. The present result, however, does not necessarily exclude the possibility that intracellular TLR5 is functional. Although BM-DCs did not express cell surface TLR5, BM-DCs could respond to flagellin and induce DC maturation ( 12, 35). In the case of TLR4/MD-2, intracellular TLR4/MD-2 in BM-macrophages is responsible for upregulation of costimulatory molecules and certain chemokine production ( 22). Future studies need to focus on TLR5 inside the cells.

Japanese-Korean Cooperative Programme on Basic Medical Research Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology for Program of Japan Initiative for Global Research Network on Infectious Diseases Grant-in-Aid for Scientific Research (B), grant reference 21117001 Grant-in-Aid for Exploratory Research Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas, grant reference 23790526.

Classical monocytes, but not neutrophils, are the predominant source of flagellin-induced cytokines. (A) Gating strategies to sort neutrophils and classical monocytes from BM cells by Gr-1 and Ly6G staining. Red dots mean total CD11b + BM cells. Overlaid blue and green dots on red dots mean Ly6C int Ly6G + neutrophils and Ly6C hi Ly6G - classical monocytes, respectively (left dot plots). Since neutrophils and classical monocytes matched to Gr-1 hi Ly6G + and Gr-1 hi Ly6G – population (right dot plots), respectively, these populations were sorted and used for cytokine assay. (B and C) Sorted classical monocytes (B) and neutrophils (C) from BM cells were stimulated by 100ng ml –1 flagellin and cytokine production was analyzed by ELISA. Asterisks mean no signals were detected.

Classical monocytes, but not neutrophils, are the predominant source of flagellin-induced cytokines. (A) Gating strategies to sort neutrophils and classical monocytes from BM cells by Gr-1 and Ly6G staining. Red dots mean total CD11b + BM cells. Overlaid blue and green dots on red dots mean Ly6C int Ly6G + neutrophils and Ly6C hi Ly6G - classical monocytes, respectively (left dot plots). Since neutrophils and classical monocytes matched to Gr-1 hi Ly6G + and Gr-1 hi Ly6G – population (right dot plots), respectively, these populations were sorted and used for cytokine assay. (B and C) Sorted classical monocytes (B) and neutrophils (C) from BM cells were stimulated by 100ng ml –1 flagellin and cytokine production was analyzed by ELISA. Asterisks mean no signals were detected.