Información

¿Cómo regulamos la producción de proteínas al diseñar plásmidos?

¿Cómo regulamos la producción de proteínas al diseñar plásmidos?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Creo que no debería sorprenderme que yo, como muchos otros, esté interesado en las nuevas vacunas COVID-19 que se están desarrollando. En mi región del mundo hay dos candidatos a alcalde. Uno está basado en ARNm y el otro, hasta donde tengo entendido, está basado en plásmidos.

Tengo un conocimiento aceptable de la vacuna basada en ARNm. También sé qué es un plásmido y cómo se transfiere entre células, pero mi comprensión es limitada.

Por lo que tengo entendido, queremos que el plásmido se "desenrolle" y se injerte en el ADN de nuestras células diana. Esto, por lo que creo, debería permitir a la célula producir cualquier proteína codificada por el plásmido. En las vacunas esto nos permite diseñar anti-medidas (vagas por mi desconocimiento) contra el virus… Pero, ¿cómo regulamos la producción de estas anti-medidas? ¿Podemos incluir un "regulador" para la producción en el plásmido, de modo que las células modificadas solo produzcan las proteínas cuando el virus está presente? ¿O simplemente dejamos que las células produzcan continuamente las proteínas anti-medida, independientemente de su necesidad?

Mi principal interés aquí radica en dónde radica la permanencia de los cambios inducidos por las vacunas. Con la vacuna de ARNm, entiendo que la permanencia radica en el sistema inmunológico regulado, y que otras células permanecen sin cambios después de que el ARNm se descompone. Con respecto a la vacuna de ADN / plásmido, todavía soy imprudente.

Gracias por su tiempo y felices fiestas.


El Instituto de Investigación de la Creación

El artículo de marzo de 1998 sobre el impacto "Clonación: ¿qué es y adónde nos lleva?"discutió el procedimiento de clonación por transferencia de células somáticas. En ese procedimiento, el núcleo de una célula derivada de un embrión, un feto o tejido de un adulto se inserta en un óvulo del que se ha extraído el núcleo. Después de que se desarrolla el óvulo En la etapa apropiada, el embrión se inserta en el útero de una hembra debidamente preparada y se deja que se desarrolle hasta el término. Esto produce una descendencia esencialmente genéticamente idéntica al animal que proporcionó el núcleo que se insertó en el óvulo. Este artículo discutirá el transferencia de genes de una especie a otra para dotar a la especie receptora de propiedades beneficiosas, o para permitir que el receptor produzca proteínas humanas para inyectarlas en pacientes humanos que carecen de una proteína de vital importancia.

Producción de proteínas terapéuticas por transferencia de genes

Hay muchas proteínas esenciales para la buena salud que algunas personas no pueden producir debido a defectos genéticos. Estas proteínas incluyen varios factores de coagulación de la sangre que causan hemofilia, insulina (que produce diabetes), hormona del crecimiento (que provoca la falta de un crecimiento adecuado) y otras proteínas, cuya administración corrige afecciones patológicas o produce otros beneficios terapéuticos. Los primeros trabajos en este campo emplearon bacterias. Algunas bacterias en un cultivo bacteriano pueden contener pequeñas moléculas circulares de ADN llamadas plásmidos. Estos plásmidos no forman parte del ADN cromosómico que poseen todas las bacterias del cultivo. A medida que estas células bacterianas excepcionales se reproducen por fisión binaria o división celular, los plásmidos se transmiten a las células hijas. También se pueden transmitir a otras células por conjugación. Los científicos han aprendido a utilizar plásmidos para transferir genes humanos a células bacterianas. Si el gen insertado en el plásmido de una bacteria es el gen humano de la insulina, por ejemplo, la bacteria en la que se inserta este gen produce insulina humana.

Inserción de una sección de ADN en un plásmido

Los científicos han identificado y aislado enzimas (llamadas enzimas de restricción o endonucleasas de restricción), cada una de las cuales corta genes en lugares muy específicos. Se han aislado más de 100 de estas enzimas. Una vez que se ha localizado en el cromosoma la posición del gen humano que codifica la proteína terapéutica deseada, se corta el gen utilizando las enzimas de restricción apropiadas y se aísla el gen. Las mismas enzimas de restricción se utilizan para cortar un trozo del plásmido circular de ADN. Por lo tanto, los dos extremos del gen humano serán los que se unirán con los extremos abiertos del plásmido. Se usa una enzima llamada ADN ligasa para acoplar cada extremo del gen a los extremos abiertos del plásmido, restaurando una molécula de ADN circular con el gen humano reemplazando la pieza cortada del plásmido. Estos plásmidos, que ahora incluyen el gen humano, se reinsertan en bacterias. Estas bacterias se cultivan y producen grandes cantidades de bacterias idénticas que portan el gen humano que se reproduce junto con el ADN bacteriano. Además, estas bacterias producen la proteína humana codificada por el gen humano empalmado. La proteína se aísla del cultivo bacteriano, se purifica y se inyecta en aquellos pacientes que padecen afecciones patológicas porque sus cuerpos no pueden producir cantidades suficientes de la proteína.

Antes de la ingeniería genética, estas proteínas tenían que aislarse minuciosamente de los tejidos o la sangre, pero como se producen en cantidades tan diminutas, el aislamiento de cantidades significativas requería el procesamiento de grandes cantidades de material. Como resultado, eran muy caros. Se obtuvieron cantidades relativamente mucho mayores a partir de cultivos bacterianos alterados genéticamente, pero el costo, aunque menor, seguía siendo elevado. Los biorreactores (es decir, la maquinaria necesaria para cultivar grandes cantidades de bacterias que contienen el gen humano) son enormemente costosos y deben ser operados por varios científicos y asistentes técnicos. Además, el correcto funcionamiento del biorreactor es sensible a pequeños cambios de temperatura y composición del caldo de cultivo.

Afortunadamente, se ha desarrollado un método alternativo que promete ser mucho menos costoso y mucho más eficiente. Este método utiliza un animal, como un cerdo, como biorreactor. Los científicos tardaron años en diseñar, desarrollar y construir el biorreactor muy caro y difícil de operar ideado por el hombre. Dios ya había ideado un biorreactor mucho más eficiente y mucho más barato. Los científicos finalmente se dieron cuenta de que sería posible mediante manipulación genética inducir a una cerda, vaca u otro animal a producir las proteínas humanas deseadas en su leche.

Ingeniería genética de una proteína de la leche.

Este procedimiento ahora ha tenido éxito tanto en cerdos como en vacas. Entre los animales, el cerdo tiene una serie de ventajas. Su período de gestación es de solo cuatro meses. A los 12 meses de edad, el cerdo es fértil y produce camadas de gran tamaño (generalmente de 10 a 12 lechones). Un cerdo lactante produce 300 litros (aproximadamente 315 cuartos de galón) de leche en un año. El procedimiento se lleva a cabo de la siguiente manera:

  1. Se aísla el fragmento de ADN (gen) que codifica la proteína humana necesaria.
  2. El fragmento de ADN que promueve la producción de proteínas en las glándulas mamarias se aísla y se une o se combina con el gen humano.
  3. Se obtienen óvulos fertilizados de un cerdo donante.
  4. El ADN humano se inyecta en un óvulo en la región del pronúcleo masculino (ADN del esperma antes de que se una al ADN del óvulo) usando una micro pipeta muy delgada. El ADN humano se incorpora así al ADN nuclear del cerdo.
  5. El óvulo se implanta en el útero de otro cerdo y se convierte en una lechona recién nacida.
  6. La proteína deseada se aísla de la leche de la lechona una vez que ha crecido.

Este procedimiento fue llevado a cabo con éxito por científicos estadounidenses y los resultados fueron publicados en 1994. 1 El gen humano que utilizaron codifica la Proteína C que actúa para controlar la coagulación sanguínea. Obtuvieron un gramo de Proteína C de cada litro de leche producido por el cerdo. Esta es 200 veces la concentración que se encuentra en el plasma sanguíneo humano. Solo alrededor de un tercio de la proteína C obtenida era biológicamente activa. La razón de esto es que se deben realizar muchas modificaciones de una proteína en una célula después de que se haya formado la cadena proteica. Por ejemplo, se cortan secciones del complejo de proteínas, se pueden unir grupos de azúcar en ciertos lugares de la cadena de proteínas y se pueden agregar grupos de anclaje a la pared celular. Los científicos descubrieron que una enzima de procesamiento clave, llamada furina, estaba presente en cantidades insuficientes, por lo que agregaron a su complejo genético el gen que codifica la furina. Esto aumentó el rendimiento de la proteína C activa. Las proteínas humanas producidas de esta manera deben probarse para determinar su seguridad y eficacia. En el momento de escribir este artículo, se está probando en ensayos clínicos una proteína anticoagulante llamada antitrombina.

La comparación de este procedimiento con el uso de máquinas de biorreactores ilustra el hecho de que una generación de ingenieros bioquímicos no logró igualar las habilidades de una herramienta para fabricar proteínas (el cerdo) que Dios había preparado. La glándula mamaria está optimizada para mantener una alta densidad de células para entregarles un amplio suministro de nutrientes y canalizar las proteínas que se producen en una forma que se puede aislar y purificar fácilmente. Este procedimiento ha demostrado ser exitoso y promete proporcionar un método para producir proteínas terapéuticas valiosas a un costo mucho menor.


Aplicaciones de péptidos sintéticos

La invención de la síntesis de péptidos en los años cincuenta y sesenta impulsó el desarrollo de diferentes áreas de aplicación en las que ahora se utilizan péptidos sintéticos, incluido el desarrollo de anticuerpos específicos de epítopo contra proteínas patógenas, el estudio de las funciones de las proteínas y la identificación y caracterización de proteínas. Además, los péptidos sintéticos se utilizan para estudiar las interacciones enzima-sustrato dentro de importantes clases de enzimas, como quinasas y proteasas, que desempeñan un papel crucial en la señalización celular.

En biología celular, la unión al receptor o la especificidad de reconocimiento del sustrato de enzimas recién descubiertas a menudo se pueden estudiar utilizando conjuntos de péptidos sintéticos homólogos. Los péptidos sintéticos pueden parecerse a los péptidos naturales y actuar como fármacos contra el cáncer y otras enfermedades importantes. Finalmente, los péptidos sintéticos se utilizan como estándares y reactivos en aplicaciones basadas en espectrometría de masas (MS). Los péptidos sintéticos juegan un papel central en el descubrimiento, caracterización y cuantificación de proteínas basados ​​en la EM, especialmente aquellas que sirven como biomarcadores tempranos de enfermedades.

Aprende más

Seleccionar productos


Resultados y discusión

Ingeniería de biosíntesis de LPS en E. coli

Comenzamos nuestra construcción de LPS-free E. coli K-12 utilizando la cepa KPM22 L11 empobrecida en Kdo [12]. Esta cepa contiene deleciones de kdsD y gutQ, que codifican d -arabinosa 5-fosfato isomerasas esenciales para la biosíntesis de Kdo [13,14], y una transición C: G a T: A en la posición 52 de msbA, que actúa como supresor del fenotipo ∆Kdo, normalmente letal [12]. Para producir una cepa que contenga lípidos IVA como el único componente de la membrana externa de LPS y que no puede revertir para sintetizar derivados endotóxicos, generamos secuencialmente cepas mutantes con deleciones no marcadas de los genes lpxL, lpxM, pagP, lpxP y eptA. Estos genes codifican enzimas que actúan aguas abajo de la incorporación de Kdo en el lípido IV.A, y son parte de la vía constitutiva de Kdo2-hexaacil lípido A biosíntesis (el Kdo2lípido IVA lauroil-ACP aciltransferasa LpxL y la Kdo2-lauroil-lípido IVA miristoil-ACP aciltransferasa LpxM), modificar el lípido A con cadenas de acilo adicionales (el fosfolípido: lípido A palmitoil transferasa PagP y el Kdo2lípido IVA palmitoleoil-ACP aciltransferasa LpxP), o añadir fosfoetanolamina (P-EtN) en determinadas condiciones (la lípido A P-EtN transferasa EptA) [15] (Figura 1). El análisis del LPS aislado de esta cepa, denominada KPM318, usando espectrometría de masas de ciclotrón iónico transformado de Fourier con ionización por electropulverización (ESI FT-ICR) reveló un solo pico primario a 1404,85 u, consistente con la estructura del tetraacil-1,4 sin modificar. ′ -Bisfosfato LPS precursor lípido IVA (Figura 2A).

Reacciones biosintéticas dirigidas durante la construcción de E. coli cepas KPM318 y KPM404. Las aciltransferasas tardías LpxL y LpxM de la vía constitutiva transfieren laurato y miristato, respectivamente, a Kdo2lípido IVA para formar las unidades aciloxiacilo características de Kdo hexaacilado2-lípido A. Por el contrario, LpxP, PagP y EptA se regulan en respuesta a ciertos estímulos como la incorporación de palmitoleato en lugar de laurato por LpxP a bajas temperaturas de crecimiento o palmitoilación catalizada por PagP del lípido A tras la translocación de fosfolípidos a la hoja exterior de la membrana externa, por ejemplo, en cepas defectuosas en la biosíntesis de LPS. La proteína portadora acil-acilo (ACP) sirve como donante de acilo preferido para diversas lípido A-aciltransferasas.

Cargar espectros de masas deconvolucionados ESI FT-ICR en modo de iones negativos del lípido IVA aislado de mutantes derivados de BW30270. El lípido IVA (masa calculada 1404,854 u) se extrajo de E. coli (K-12) cepas KPM318 (A) y KPM335 (B). Los números de masa dados se refieren a las masas monoisotópicas de moléculas neutras. Los picos que representan moléculas con variaciones en la longitud de la cadena de acilo están marcados con asteriscos (∆metro = 14,02 u). El ion molecular a 1484,82 u en el panel B indica la presencia de una fracción menor de lípido 1-difosfato IVA. Las estructuras del lípido IVA y lípido 1-difosfato IVA se muestran como inserciones en paneles A y B, respectivamente.

La exitosa construcción de KPM318 demostró la viabilidad de E. coli que contiene solo lípidos IVA. Sin embargo, como otros E. coli Las cepas K-12 con membranas externas parcialmente defectuosas, como la cepa prototipo ∆Kdo KPM22 [11], KPM318 mostraron defectos de crecimiento a temperaturas superiores a 40 ° C. Para superar esto, aislamos una serie de derivados estables resistentes a la temperatura de KPM318 capaces de crecer exponencialmente a 42 ° C. KPM335 fue el más robusto de los mutantes espontáneos. La secuenciación del genoma completo de KPM335 identificó un solo de novo mutación en comparación con la cepa parental KPM318 sensible a la temperatura, una transversión G: C a T: A en la base número 181 del frr gene (archivo adicional 1: Tabla S1). los frr El gen codifica un factor esencial de reciclaje de ribosomas que, según se ha descrito, desempeña múltiples funciones celulares, como en el desmontaje del complejo posterior a la terminación [16], la prevención de errores de traducción [17], la promoción del acoplamiento de traducción [18] y el aumento de la viabilidad celular. mediante la estimulación con poliaminas de la fase estacionaria E. coli culturas [19]. La derivación de KPM335 aboga fuertemente por una correlación directa entre el desarrollo de la frr181 alelo y la capacidad de la cepa para tolerar el fenotipo ∆Kdo a 42 ° C. Sin embargo, el esclarecimiento del mecanismo subyacente debe esperar más investigaciones.

El análisis ESI FT-ICR del LPS aislado de KPM335 no reveló cambios significativos en la composición del LPS, con lípido IVA quedando la molécula predominante relacionada con LPS como en la cepa parental KPM318 (Figura 2B). Sin embargo, a diferencia de KPM318, los espectros de KPM335 mostraron un pico menor con una masa molecular de 1484,82 u, consistente con la estructura del lípido 1-difosfato IVA. Touzé y sus colaboradores han demostrado previamente que la transferencia de un segundo grupo fosfato a la posición 1 del lípido A es catalizada por LpxT, una proteína de la membrana interna de la familia undecaprenil-pirofosfato fosfatasa, que es capaz de fosforilar Kdo2lípido IVA in vitro, pero no aceptores de lípidos que carecen de Kdo [20]. Así, la presencia de un menor tris-Lípido IV fosforiladoA fracción en KPM335 argumenta en contra de un requisito absoluto de LpxT para los aceptores de lípido A Kdo-glicosilado bajo en vivo condiciones. Sin embargo, no está claro por qué la fosforilación del lípido IVA, aunque con una eficiencia muy baja, puede ocurrir en KPM335, pero aparentemente no en su cepa parental KPM318.

Aparte de la frr181 mutación en KPM335, un total de 12 mutaciones fueron específicas tanto para KPM318 como para KPM335, incluyendo ∆kdsD, ∆gutQ, ∆lpxL, ∆lpxM, ∆pagP, ∆lpxP, ∆eptA y msbA52 como requisito previo para la síntesis de lípidos IVA como el componente predominante de la membrana externa relacionado con LPS. Para otras cuatro mutaciones, creemos que surgieron espontáneamente durante la generación de cepas mutantes, es decir, una mutación silenciosa ubicada en yqiI, dos mutaciones sin sentido en gor y waaY, y una mutación puntual en la región no codificante aguas arriba del borrado eptA gene. Es muy probable que la última mutación sea el resultado de la construcción de KPM274 como una cepa donante de ΔeptA :: kan casete. La mutación se encuentra dentro de la secuencia de la región de homología del cebador ECOeptAH1 (archivo adicional 2: Tabla S2) y sugiere un error en la amplificación por PCR del casete de resistencia a la kanamicina dirigido al eptA gen y finalmente la integración en el genoma de KPM318. Comparado con la secuencia del genoma de referencia del común E. coli Progenitor de MG1655, las cepas BW30270, KPM318 y KPM335 comparten variaciones de secuencia en seis ubicaciones. De estos, tanto una sustitución silenciosa de nucleótidos en la posición 114 como una inserción de un solo nucleótido en la base número 253 de ylbE, y deleción del nucleótido 151 dentro del glpR gen se han descrito recientemente como variaciones genéticas en común E. coli Cultivos madre MG1655 [21]. Además, mientras E. coli Se ha demostrado que MG1655 expresa una ribonucleasa PH defectuosa debido a un desplazamiento del marco de lectura por deleción del primer nucleótido del codón 223 del pseudogén. rph-1 [22], inserción de un solo nucleótido como la primera base del codón 224 de rph-1 predice la reconstitución de la función RNasa PH y la eliminación del efecto polar de la rph-1 mutación en el río abajo pira gen en BW30270, KPM318 y KPM335.

A continuación, decidimos replicar el conjunto único de deleciones genómicas no marcadas en el trasfondo genético del popular E. coli cepa de expresión BL21 (DE3). Como primer paso hacia la construcción de un LPS E. coli Derivado BL21 (DE3), reemplazamos el tipo salvaje msbA gen con el msbA148 alelo supresor de la cepa KPM22 L1 [12]. Esto permitió que la cepa resultante, MWB03, tolerara mutaciones nulas en genes por lo demás esenciales de la ruta de biosíntesis de LPS. Luego, eliminamos secuencialmente los mismos genes que se habían eliminado durante la creación de KPM318. La secuenciación del genoma completo de la cepa final, KPM404, confirmó la presencia del msbA148 mutación supresora (archivo adicional 3: Tabla S3), y verificó la ausencia de la kdsD, gutQ, lpxL, lpxM, pagP, lpxP y eptA genes. En comparación con la secuencia del genoma de E. coli BL21 (DE3), identificamos además una mutación silenciosa en yceJ, tres cambios de sentido erróneo dentro de las secuencias de codificación de YadG, ECD_00513 y RstA, y una mutación puntual en la región intergénica entre nudc y dobladillo. Finalmente, se contaron un total de cinco sustituciones de un solo nucleótido en la región entre los nucleótidos 46 y 222 del basR gen aguas abajo de ∆eptA. Estas sustituciones coincidían perfectamente con los sitios de basR variaciones de secuencia en E. coli B y K-12, lo que indica que aproximadamente un tercio del gen que codifica BasR de KPM404 fue reemplazado por el correspondiente basR secuencia de E. coli K-12. Al igual que para la construcción de KPM318, el E. coli La cepa K-12 KPM274 sirvió como donante para la transferencia de ΔeptA :: kan casete a través de P1vir transducción para producir la cepa KPM403, que explica bien la generación de una basR secuencia híbrida por cotransducción del ΔeptA :: kan casete y adyacente basR secuencias. De hecho, como se describió anteriormente, el uso de KPM274 como un ΔeptA :: kan cepa donante también explica por qué KPM404 lleva una mutación puntual en la misma posición corriente arriba del borrado eptA gen como en KPM318.

Los análisis espectrométricos de masas de los perfiles de LPS de mutantes establecidos en el trasfondo genético de BL21 (DE3) subrayaron la necesidad de una modificación radical de la biosíntesis de LPS para lograr la síntesis de solo lípido IVA en KPM404 (Figuras 3 y 4). Mientras que la interrupción del gutQ, kdsD y lpxL genes en la cepa mutante intermedia KPM396 dieron como resultado la síntesis de lípido IV no glicosiladoA precursores que carecen de las cadenas secundarias de lauroílo y miristoílo, la espectrometría de masas reveló una mezcla bastante heterogénea de lípidos IV modificados de manera diferenteA especies. Los espectros mostraron cuatro picos prominentes con masas moleculares de lípido IVA sustituido con un grupo P-EtN (1527,86 u), lípido IVA modificado con dos restos P-EtN (1650,87 u) y lípido IV palmitoiladoA moléculas que llevan uno (1766.09 u) o dos (1889.10 u) residuos de P-EtN. Dado que la palmitoilación del lípido A parece ser una indicación de una respuesta adaptativa a la translocación aberrante de los fosfolípidos a la valva externa de la membrana externa [23], sospechamos que la transferencia de palmitato al lípido IV mediada por PagPA se desencadena por perturbaciones de la asimetría lipídica de la membrana externa en cepas de la serie KPM empobrecidas en Kdo. Como se muestra para la muestra de LPS de KPM400, pérdida completa del lípido intravenoso palmitoiladoA fracción se logró mediante la eliminación de la pagP gen, dejando lípido IVA moléculas modificadas con uno o dos grupos P-EtN no afectadas.

Cargue los espectros de masas deconvolucionados ESI FT-ICR en modo de iones negativos de LPS aislado de mutantes derivados de BL21 (DE3). Los números de masa dados se refieren a las masas monoisotópicas de moléculas neutras. Los picos que representan moléculas con variaciones en la longitud de la cadena de acilo están marcados con asteriscos (∆metro = 14,02 u). Los espectros de masas representan el progreso en la eliminación de lípidos IVA heterogeneidad por deleción secuencial de genes que codifican la adición de cadenas de acilo y P-EtN al precursor del lípido A.

Estructuras y masas moleculares del lípido IVA moléculas identificadas por espectrometría de masas ESI FT-ICR en mutantes KPM derivados de BL21 (DE3). Los espectros de masas ESI FT-ICR se muestran en la Figura 3. Modificaciones del lípido IVA con palmitato (verde) y P-EtN (magenta) son catalizados por PagP y EptA, respectivamente.

Debido al bloqueo en la biosíntesis de Kdo y la falta de LpxL, Kdo2lípido IVA y Kdo2- (lauroil) -lipid IVA, los sustratos preferidos para LpxP y LpxM, respectivamente [24-26], no pueden sintetizarse en cepas derivadas de KPM396. Además, trabajos anteriores han demostrado que la expresión de LpxP se induce en condiciones de choque frío (12 ° C) para incorporar una cadena de acilo C16: 1 insaturada a expensas de un laurato (C12: 0), tal vez reflejando la demanda de ajustar fluidez de la membrana en el frío [25,27]. Por lo tanto, no fue sorprendente que la supresión de la lpxP y lpxM los genes no mostraron un efecto obvio sobre los lípidos IVA composición de KPM400 y KPM402, respectivamente. No hay datos que indiquen que LpxP y LpxM sean capaces de utilizar lípidos IVA como sustrato aceptor. Sin embargo, parece bastante posible que ambas enzimas muestren bajos niveles de actividad en condiciones específicas. Contrariamente al papel fisiológico propuesto de LpxP en la adaptación de E. coli células a bajas temperaturas de crecimiento, la inducción limitada de la expresión de LpxP se ha demostrado como un mecanismo compensatorio potencial incluso a 30 ° C en lpxL y lpxL lpxM mutantes de E. coli W3110 [28]. Asimismo, LpxM pudo transferir una cadena de miristoilo directamente a Kdo2lípido IVA en E. coli Falta de cepas W3110 lpxL y lpxL lpxP [28].

Al igual que PagP y LpxP, la modificación dependiente de EptA del lípido A con P-EtN es parte de la compleja red reguladora asociada con el rediseño estructural de LPS tras la exposición a condiciones ambientales cambiantes o factores de estrés de la envoltura. Como se muestra para E. coli K-12, la modificación del lípido A con P-EtN se produce en determinadas condiciones, como en respuesta a estímulos externos como el metavanadato de amonio [29] o el pH ácido leve [30]. Aunque el P-EtN parece transferirse predominantemente al grupo 1-fosfato del lípido A [31], las sustituciones dobles de P-EtN en las posiciones 1- y 4'-fosfato fueron evidentes en el lípido A de E. coli K-12 sin actividad LpxT [32] y lípido IVA de una cepa mutante defectuosa en la translocación de LPS dependiente de MsbA a través de la membrana interna [12]. Basado en el análisis ESI FT-ICR presentado aquí, la eliminación del eptA El gen era claramente necesario y suficiente para prevenir los lípidos IVA de KPM404 se sustituya con uno o dos residuos de P-EtN. Por lo tanto, nuestros datos no solo corroboran hallazgos previos sobre la capacidad de EptA para transferir P-EtN tanto al grupo 1- como al 4′-fosfato del lípido A [32], sino que también proporcionan evidencia experimental de su capacidad para usar lípidos IVA como sustrato para modificaciones simples y dobles de P-EtN.

En contraste con el E. coli Cepa K-12 KPM318, integración de lípido IVA en la membrana externa de KPM404 no dio como resultado un fenotipo sensible a la temperatura del mutante derivado de BL21 (DE3) (datos no mostrados). Aunque están estrechamente relacionados a nivel genómico [33], el análisis combinado de los genomas, transcriptomas, proteomas y fenomas de E. coli K-12 y BL21 (DE3) revelaron diferencias significativas en su fisiología celular y metabolismo [34], lo que puede explicar las diferencias en la capacidad de KPM318 y KPM404 para mantener la integridad de la membrana externa en presencia de lípidos IVA a temperaturas superiores a 40 ° C.

Actividad biológica de ingeniería E. coli células y LPS

Para probar el potencial endotóxico de la ingeniería E. coli Cepas K-12 y B, realizamos ensayos de activación TLR4 / MD-2 utilizando células HEK-Blue hTLR4. La estimulación de estas células, que expresan TLR4, MD-2 y CD14 humanos en sus superficies, induce la producción de la fosfatasa alcalina embrionaria secretada dependiente de NF-κB y de la proteína activadora-1 (AP-1), secretada por el informador (SEAP). Los niveles de fosfatasa se pueden determinar leyendo la absorbancia a 655 nm usando un sustrato colorimétrico. Para abordar la cuestión de si NF-κB se induce específicamente a través de la vía de señalización hTLR4 / MD-2, las células HEK-Blue Null2, la línea celular parental de las células HEK-Blue hTLR4 que carecen del complejo receptor hTLR4 / MD-2, se utilizaron como control en todos los ensayos de activación de hTLR4 / MD-2. Las cepas KPM318, KPM335 y KPM404 analizadas desafiando las células HEK-Blue hTLR4 con un número creciente de unidades formadoras de colonias (ufc) de hasta 106 ufc / ml estaban prácticamente libres de actividad estimulante de hTLR4 / MD-2, mientras que su las cepas parentales BW30270 y BL21 (DE3) provocaron una activación sustancial de hTLR4 / MD-2 ya a 103 ufc / ml (Figuras 5A, B, 6A y B). Cuando el LPS extraído de las cepas se sometió al ensayo específico de TLR4, pudimos confirmar la falta de actividad endotóxica de las muestras aisladas de KPM318, KPM335 y KPM404 (Figuras 5C, D, 6C y D). Los datos también demostraron que la palmitoilación de lípidos IVA (cuando se expresó PagP) y / o modificación del lípido IVA con uno o dos grupos P-EtN (cuando se expresó EptA) en KPM396, KPM400 y KPM402 son capaces de conferir cierta actividad estimuladora de hTLR4 / MD-2 sobre el precursor del lípido A tetraacilado, por lo demás endotóxicamente inactivo (Figura 6). Nuestros resultados nos permiten sacar la principal conclusión de que la inactivación de lípidos IV reguladosA modificaciones como se demuestra en este documento que están presentes en cepas mutantes intermedias basadas en BL21 (DE3) es un requisito previo crucial para producir consistentemente sin endotoxinas E. coli son.

Curvas de dosis-respuesta de la inducción de NF-κB por células bacterianas completas y LPS de E. coli Cepas K-12. Las muestras se analizaron con células HEK-Blue hTLR4 para la inducción de NF-κB mediada por hTLR4 / MD-2 mediante determinación colorimétrica de la actividad SEAP dependiente de NF-κB (A y C). Las células HEK-Blue Null2, la línea celular parental de las células HEK-Blue hTLR4 que carecen del complejo receptor hTLR4 / MD-2, se utilizaron como control. (B y D). Las células HEK-Blue hTLR4 y Null2 se estimularon con diluciones en serie diez veces mayores de células bacterianas completas. (A y B) y extractos de LPS (C y D) de KPM318 y KPM335 en comparación con su cepa parental BW30270, respectivamente. Los valores representan las medias y las desviaciones estándar de tres experimentos individuales. En todos los experimentos, las muestras analizadas mostraron una estimulación de bajo nivel de células HEK-Blue Null2, lo que indica que la expresión de SEAP dependiente de NF-κB se indujo específicamente a través de la vía de señalización hTLR4 / MD-2 en células HEK-Blue hTLR4.

Curvas de dosis-respuesta de la inducción de NF-κB por células bacterianas completas y LPS de E. coli Cepas BL21 (DE3). Las muestras se analizaron con HEK-Blue hTLR4 (A y C) y Null2 (B y D) células para la inducción relativa de NF-κB mediante determinación colorimétrica de la actividad SEAP dependiente de NF-κB. Se midió la inducción relativa de NF-κB después de la estimulación de células HEK-Blue hTLR4 y Null2 con diluciones en serie diez veces mayores de células bacterianas completas. (A y B) y extractos de LPS (C y D) de E. coli Mutantes KPM derivados de BL21 (DE3) y BL21 (DE3), respectivamente. Los valores representan las medias y las desviaciones estándar de tres experimentos individuales. En todos los experimentos, las muestras ensayadas mostraron una activación insignificante de las células HEK-Blue Null2 parentales, lo que sugiere una inducción específica de la expresión SEAP dependiente de NF-κB a través de la vía de señalización hTLR4 / MD-2 en células HEK-Blue hTLR4.

Como uno de los mediadores críticos inducidos en respuesta a la endotoxina, analizamos la liberación de TNF-α tras la estimulación de macrófagos humanos por lípido IVA muestras de KPM318, KPM335 y KPM404. Las muestras exhibieron una actividad biológica muy baja como lo demuestra su baja capacidad para provocar la producción de TNF-α en macrófagos humanos incluso a concentraciones de 0,1-1 µg / ml (Figura 7A). En comparación con el LPS de las cepas parentales, que indujeron la liberación máxima de TNF-α a 0,01 µg / ml, la inducción de TNF-α se redujo en aproximadamente un 80-95% incluso a niveles 100 veces más altos de extractos mutantes. La capacidad bien documentada del lípido IVA actuar como un antagonista de la vía de señalización de hTLR4 / MD-2 [35,36] nos llevó a examinar la inhibición de la actividad agonista de LPS en forma S de Salmonella enterica subespecie enterica serovar Abortusequi (S. Abortusequi) por lípido IVA muestras de KPM318, KPM335 y KPM404. Como se muestra en la Figura 7B, la preexposición de macrófagos a 0,1 μg / ml y 1 μg / ml del lípido IVA extractos resultaron en 72.0 ± 11.2% y 75.9 ± 2.0% (porcentaje medio de inhibición ± DE) inhibición de la producción de TNF-α inducida por LPS de S. Abortusequi, respectivamente. Por lo tanto, lípido IVA de KPM318, KPM335 y KPM404 mostraron una potente actividad antagonista contra LPS de tipo salvaje biológicamente activo.

Actividad biológica de LPS de mutantes KPM en macrófagos humanos. Los macrófagos se diferenciaron de los monocitos de sangre humana de donantes sanos. En el día siete de diferenciación, se sembraron macrófagos a 1 x 105 células / pocillo y se estimularon con LPS en las cantidades indicadas (LPS de S. Abortusequi, BW30270 y BL21 (DE3) a 0,01 μg / ml de LPS de las cepas KPM318, KPM335 y KPM404 a 0,1 μg / ml y 1 μg / ml, respectivamente) durante 4 ha 37 ° C (A). Para determinar la actividad antagonista de LPS de cepas KPM, se incubaron macrófagos con muestras de LPS de KPM318, KPM335 o KPM404 a 0,1 μg / ml o 1 μg / ml durante 30 min a 37 ° C, seguido de la estimulación de las células con 0,01 μg. / ml de LPS de S. Abortusequi por 4 h (B). Los sobrenadantes libres de células se analizaron para determinar el contenido de TNF-α mediante ELISA. Los valores representan las medias y las desviaciones estándar de tres experimentos independientes que utilizan células de diferentes donantes.

Expresión libre de endotoxinas de ApoA-1 y Hsp70

Estudios anteriores han demostrado que un BL21 (DE3) ∆lpxM :: gato El mutante que sintetiza un LPS no miristoilado se puede utilizar para expresar proteínas heterólogas con actividad estimuladora reducida en células que responden al LPS humano [37]. Para probar la capacidad de KPM318, KPM335 y KPM404 para servir como huéspedes para la producción de proteínas recombinantes sin endotoxina, seleccionamos las proteínas humanas ApoA-1 y Hsp70 expresadas heterólogamente como sistemas modelo. ApoA-1, un componente principal de las lipoproteínas de alta densidad y mediador importante en el mantenimiento de la homeostasis del colesterol [38], es particularmente desafiante porque se sabe que la proteína de 28 kDa está directamente involucrada en la neutralización de la toxicidad del LPS y, por lo tanto, es difícil de separar de la actividad endotóxica [39,40]. Sin embargo, otra proteína desafiante capaz de asociarse con LPS es Hsp70 [41]. Además, se ha sugerido que la chaperona molecular de 70 kDa funciona como una proteína de patrón molecular asociada al daño endógeno para la activación de la vía de señalización de TLR4 tras una lesión tisular [42]. Dado que la estimulación inducida por Hsp70 de las células del sistema inmunitario innato se asemeja en muchos aspectos a los efectos del LPS, la eliminación de la contaminación por endotoxinas, que se encuentra frecuentemente en las preparaciones de Hsp recombinante [43], sigue siendo una cuestión clave para discriminar entre los efectos inducidos por LPS y Hsp.

Para la producción de ApoA-1, usamos el plásmido pApo404 basado en el promotor T5 en E. coli cepas BW30270, KPM318 y KPM335, mientras que Hsp70 se expresó a partir de pHsp70His bajo el control de un promotor T7 en BL21 (DE3) y KPM404. El análisis SDS-PAGE de las muestras de proteína después de una purificación mínima de cada extracto de proteína soluble, mediante cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC), reveló que las cepas libres de endotoxinas KPM318 / pApo404, KPM335 / pApo404 y KPM404 / pHsp70His producían ApoA-1 recombinante y Hsp70 en cantidades aproximadamente iguales y tenían perfiles de impurezas similares a sus cepas parentales, respectivamente (Figura 8). Dado que se ha descrito que ApoA-1 también se asocia con proteínas de la célula huésped [44], no fue sorprendente detectar niveles relativamente altos de contaminantes proteicos en las muestras de ApoA-1 purificadas con IMAC. Independientemente, no realizamos ninguna purificación de proteínas o pasos de eliminación de endotoxinas adicionales para investigar la actividad biológica de las muestras de ApoA-1 y Hsp70.

Geles SDS-PAGE de ApoA-1 y Hsp70. Las proteínas se expresaron en derivados libres de endotoxinas de E. coli cepas BW30270 (A) y BL21 (DE3) (B), respectivamente, y mínimamente purificado usando IMAC en columnas HisTrap HP (1 ml). Las muestras recombinantes de ApoA-1 y Hsp70 (6 µg cada una) se resolvieron en condiciones de desnaturalización utilizando geles de poliacrilamida al 12% y al 10%, respectivamente. Se corrieron marcadores de proteína de masa molecular (kDa) en las calles M. Las flechas indican las posiciones de ApoA-1 y Hsp70.

La primera prueba de actividad biológica empleada fue la Limulus ensayo de lisado de amebocitos (LAL), un método aprobado por la FDA que se basa en la activación de una cascada de coagulación en el LAL por trazas de endotoxina [45]. En este ensayo, los equivalentes de unidades de endotoxina determinados en muestras de ApoA-1 de KPM318 / pApo404 y KPM335 / pApo404 se redujeron significativamente en 92,7 ± 1,3% y 82,2 ± 3,9% (porcentaje medio de inhibición ± DE) en comparación con los encontrados en ApoA- 1 muestra de BW30270 / pApo404, respectivamente (Figura 9). Además, cuando se utilizó KPM404 / pHsp70His como hospedador para la producción de Hsp70, la respuesta de LAL a la proteína disminuyó en un 97,2 ± 0,5% en comparación con la respuesta provocada por Hsp70 obtenida de BL21 (DE3) / pHsp70His. El ensayo LAL, aunque ampliamente utilizado para la detección y cuantificación de endotoxinas, es un método inapropiado para discriminar entre LPS hexaacilado endotóxicamente activo y lípido IV tetraacilado endotóxicamente inactivo.A debido a la presencia de la columna vertebral de 4'-monofosforil-diglucosamina que activa LAL en ambas estructuras lipídicas [46,47]. Como tal, la cascada de coagulación de LAL es activada por un espectro más amplio de variantes de LPS / lípido A que las células del sistema inmunológico humano que responden a LPS. La reactividad LAL residual de las proteínas del lípido IVA Las cepas hospedadoras reflejan muy probablemente la naturaleza no específica del ensayo, lo que da lugar a resultados endotóxicos falsos positivos.

Reactividad de ApoA-1 y Hsp70 en el Limulus ensayo de lisado de amebocitos (LAL). ApoA-1 se produjo en E. coli cepa BW30270 / pApo404 y sus derivados libres de endotoxinas KPM318 / pApo404 y KPM335 / pApo404, mientras que Hsp70 se obtuvo a partir de KPM404 / pHsp70His y su cepa parental BL21 (DE3) / pHsp70His. Las proteínas se purificaron mínimamente por IMAC y se analizaron con la prueba LAL. Las medidas representan las medias y las desviaciones estándar de tres experimentos individuales.

Para abordar específicamente la actividad endotóxica de las muestras de ApoA-1 y Hsp70, utilizamos el ensayo de activación celular HEK-Blue hTLR4 / MD-2. Las muestras de ApoA-1 y Hsp70 derivadas de las cepas sin endotoxina no desencadenaron una respuesta endotóxica en las células HEK-Blue hTLR4, incluso cuando estaban presentes en el ensayo a 10 μg / ml, mientras que las proteínas producidas en las cepas parentales mostraron NF sustancial Activación de -κB ya en concentraciones en el rango entre 0.1 μg / ml y 1 μg / ml (Figura 10). Estos resultados estuvieron en excelente acuerdo con la incapacidad de las células KPM318, KPM335 y KPM404 y LPS para estimular la vía de señalización de hTLR4 / MD-2 (Figuras 5 y 6).

Estimulación de hTLR4 / MD-2 por ApoA-1 y Hsp70 producida en endotoxinas E. coli son. Las proteínas se purificaron mínimamente por IMAC y se analizaron con células HEK-Blue hTLR4 para determinar su capacidad para activar la expresión de SEAP dependiente de NF-κB. (A y C). Las células HEK-Blue Null2 sirvieron como control (B y D). Se midió la inducción relativa de NF-κB después de la estimulación de células HEK-Blue hTLR4 y Null2 con diluciones en serie diez veces mayores de ApoA-1 (A y B) y Hsp70 (C y D) muestras obtenidas por expresión heteróloga en BW30270 / pApo404, KPM318 / pApo404 y KPM335 / pApo404, y BL21 (DE3) / pHsp70His y KPM404 / pHsp70His, respectivamente. Los valores representan las medias y las desviaciones estándar de tres experimentos individuales. En todos los experimentos, las muestras de ApoA-1 y Hsp70 no activaron la expresión SEAP dependiente de NF-κB en células HEK-Blue Null2, lo que sugiere que la expresión SEAP dependiente de NF-κB se debió a la activación específica de la señalización de hTLR4 / MD-2 vía en células HEK-Blue hTLR4.

Como se ejemplifica en el presente documento mediante la expresión heteróloga de ApoA-1 y Hsp70, las proteínas preparadas a partir de E. coli Las cepas están libres de actividad endotóxica de forma innata en las células sensibles a LPS humanas, lo que coincide con las observaciones anteriores de que KPM335 también es un huésped adecuado para la producción de cuerpos de inclusión funcionales libres de endotoxinas de la proteína de fusión fluorescente propensa a la agregación VP1GFP [48]. Sin embargo, hay que tener en cuenta que el lípido IVA puede actuar agonísticamente en otros hospedadores mamíferos como el ratón [49], el hámster chino [50] o las células equinas [36], lo que refleja el lípido IV específico de la especieA detección por el complejo TLR4 / MD-2 [51,52]. Por lo tanto, la aplicación de proteínas en células distintas de las humanas también puede requerir lípidos IVA agotamiento. Debido a la falta de especificidad, el ensayo LAL no se puede utilizar para evaluar la actividad endotóxica, pero es ideal para detectar lípidos IV residuales.A en proteínas recombinantes preparadas a partir de LPS sin E. coli son. Somos conscientes de que actualmente no podemos responder a la pregunta de si una mayor purificación de ApoA1 y Hsp70 resultaría en una pérdida completa de lípidos IVA. Sin embargo, nuestros datos sobre las reactividades LAL significativamente disminuidas de las proteínas ApoA1 y Hsp70 mínimamente purificadas de bacterias libres de endotoxinas dan razón para suponer que el lípido IVA, al ser homogéneo, es mucho más fácil de eliminar de los productos posteriores que los LPS maduros. A pesar de una estructura principal común, el LPS se sintetiza como una mezcla heterogénea de moléculas estructuralmente relacionadas que están decoradas con varios sustituyentes, generalmente presentes en cantidades no estequiométricas [53]. Estas sustituciones, que pueden variar significativamente según las condiciones de crecimiento, contribuyen a una considerable heterogeneidad físico-química de las moléculas de LPS, lo que plantea un desafío importante para el desarrollo de un método de aplicación general para la eliminación de endotoxinas de proteínas producidas en común. E. coli cepas de expresión [5].


Estabilidad del ARN y microARN

Además de las RBP que se unen y controlan (aumentan o disminuyen) la estabilidad del ARN, otros elementos llamados microARN pueden unirse a la molécula de ARN. Estas microARN, o miARN, son moléculas cortas de ARN que tienen sólo 21-24 nucleótidos de longitud. Los miARN se producen en el núcleo como pre-miARN más largos. Estos pre-miARN se cortan en miARN maduros por una proteína llamada jugador. Al igual que los factores de transcripción y las RBP, los miARN maduros reconocen una secuencia específica y se unen al ARN; sin embargo, los miARN también se asocian con un complejo de ribonucleoproteína llamado Complejo silenciador inducido por ARN (RISC). RISC se une junto con el miRNA para degradar el mRNA objetivo. Juntos, los miARN y el complejo RISC destruyen rápidamente la molécula de ARN.

Preguntas de práctica

¿Cuáles de los siguientes están involucrados en el control postranscripcional?

  1. control del empalme de ARN
  2. control del transporte de ARN
  3. control de la estabilidad del ARN
  4. Todas las anteriores

La unión de una proteína de unión a ARN __________ la estabilidad de la molécula de ARN.

  1. incrementar
  2. disminución
  3. ni aumentar ni disminuir
  4. ya sea aumentar o disminuir

Describe cómo las RBP pueden evitar que los miARN degraden una molécula de ARN.

¿Cómo pueden los estímulos externos alterar el control postranscripcional de la expresión génica?

En resumen: regulación génica epigenética eucariota

En las células eucariotas, la primera etapa del control de la expresión génica se produce a nivel epigenético. Los mecanismos epigenéticos controlan el acceso a la región cromosómica para permitir que los genes se activen o desactiven. Estos mecanismos controlan la forma en que el ADN se empaqueta en el núcleo al regular la fuerza con la que el ADN se enrolla alrededor de las proteínas histonas. La adición o eliminación de modificaciones químicas (o indicadores) a las proteínas histonas o señales de ADN a la célula para abrir o cerrar una región cromosómica. Por lo tanto, las células eucariotas pueden controlar si un gen se expresa controlando la accesibilidad a los factores de transcripción y la unión de la ARN polimerasa para iniciar la transcripción.

Para iniciar la transcripción, los factores de transcripción generales, como TFIID, TFIIH y otros, primero deben unirse a la caja TATA y reclutar ARN polimerasa en esa ubicación. La unión de factores de transcripción reguladores adicionales a cis-los elementos que actúan aumentarán o evitarán la transcripción. Además de las secuencias promotoras, las regiones potenciadoras ayudan a aumentar la transcripción. Los potenciadores pueden estar aguas arriba, aguas abajo, dentro de un gen mismo o en otros cromosomas. Los factores de transcripción se unen a regiones potenciadoras para aumentar o prevenir la transcripción.

El control postranscripcional puede ocurrir en cualquier etapa después de la transcripción, incluido el empalme de ARN, el transporte nuclear y la estabilidad del ARN. Una vez que se transcribe el ARN, debe procesarse para crear un ARN maduro que esté listo para ser traducido. Esto implica la eliminación de intrones que no codifican proteínas. Los empaliceosomas se unen a las señales que marcan el borde exón / intrón para eliminar los intrones y ligar los exones. Una vez que esto ocurre, el ARN está maduro y se puede traducir. El ARN se crea y se empalma en el núcleo, pero necesita ser transportado al citoplasma para su traducción. El ARN se transporta al citoplasma a través del complejo de poros nucleares. Una vez que el ARN está en el citoplasma, el período de tiempo que reside allí antes de degradarse, lo que se denomina estabilidad del ARN, también se puede alterar para controlar la cantidad total de proteína que se sintetiza. La estabilidad del ARN puede incrementarse, lo que lleva a un tiempo de residencia más prolongado en el citoplasma, o puede disminuir, lo que reduce el tiempo y reduce la síntesis de proteínas. La estabilidad del ARN está controlada por proteínas de unión a ARN (RPB) y microARN (miARN). Estos RPB y miARN se unen a la UTR 5 'o la UTR 3' del ARN para aumentar o disminuir la estabilidad del ARN. Dependiendo del RBP, la estabilidad se puede aumentar o disminuir significativamente; sin embargo, los miARN siempre disminuyen la estabilidad y promueven la descomposición.


Protocolo de transfección general

Preparación de células para la transfección

Eliminación de células adherentes con tripsina

La tripsinización de las células antes del subcultivo o el recuento celular es una técnica importante para el éxito del cultivo celular. La siguiente técnica funciona consistentemente bien al pasar células.

Materiales necesarios:

  • Solución de tripsina-EDTA 1X
  • 1X PBS o 1X HBSS
  • células adherentes para ser subcultivadas
  • medio de crecimiento apropiado (por ejemplo, DMEM) con suero o factores de crecimiento o ambos agregados
  • Placas de cultivo, matraces o placas de pocillos múltiples, según sea necesario
  • hemocitómetro
  1. Prepare una solución estéril de tripsina-EDTA en una solución salina libre de calcio y magnesio, como 1X PBS o 1X HBSS. La solución 1X se puede congelar y descongelar para uso futuro, pero la actividad de la tripsina disminuirá con cada ciclo de congelación-descongelación. La solución de tripsina-EDTA puede almacenarse hasta 1 mes a 4 ° C.
  2. Retire el medio del plato de cultivo de tejidos. Agregue suficiente PBS o HBSS para cubrir la monocapa celular: 2 ml para un matraz de 150 mm, 1 ml para una placa de 100 mm. Mueva las placas para distribuir la solución de manera uniforme. Retirar y repetir el lavado. Retirar el lavado final. Agregue suficiente solución de tripsina para cubrir la monocapa celular.
  3. Coloque las placas en una incubadora a 37 ° C hasta que las células comiencen a desprenderse (generalmente 1 y 2 minutos).
  4. Retire el matraz de la incubadora. Golpee fuertemente el fondo y los lados del recipiente de cultivo con la palma de su mano para ayudar a desalojar las células adherentes restantes. Observe las células con un microscopio para comprobar si todas las células se han desprendido de la superficie de crecimiento. Si es necesario, las células pueden devolverse a la incubadora durante 1 & ndash2 minutos adicionales.
  5. Cuando todas las células se hayan desprendido, agregue medio que contenga suero a las células para inactivar la tripsina. Pipetee suavemente las células para romper los grupos de células. Las células pueden contarse usando un hemocitómetro, distribuirse en placas frescas para el subcultivo, o ambos.

Normalmente, las células se subcultivan para prepararlas para la transfección al día siguiente. El subcultivo debe llevar las células de interés a la confluencia deseada para la transfección. Como pauta general, coloque en placa 5 y veces 10⁴ células por pocillo en una placa de 24 pocillos o 5,5 y veces 10⁵ células para una placa de cultivo de 60 mm para

Confluencia del 80% el día de la transfección. Cambie los números de celda proporcionalmente para placas de diferentes tamaños (consulte la Tabla 3).

Tabla 3. Área de las placas de cultivo para el crecimiento celular.

Tamaño de la placa Área de crecimiento a (cm y sup2) Área relativa b
24 pocillos 1.88 1X
96 pocillos 0.32 0,2 veces
12 pocillos 3.83 2X
6 pocillos 9.4 5X
35 mm 8.0 4,2 veces
60 mm 21 11X
100 mm 55 29X

a Esta información se calculó para platos de cultivo Corning & reg.
b El área relativa se expresa como un factor del área de crecimiento total de la placa de 24 pocillos recomendada para los estudios de optimización. Para determinar la densidad de enchapado adecuada, multiplique 5 y 10⁴ las celdas por este factor.

Preparación de ADN para transfección

El ADN de alta calidad libre de nucleasas, ARN y productos químicos es tan importante para una transfección exitosa como el reactivo de transfección elegido. Consulte el capítulo de la Guía de protocolos y aplicaciones sobre purificación de ADN para obtener información sobre la purificación de ADN con calidad de transfección.

Ejemplo de protocolo con ViaFect & trade Reagent

Recomendamos encarecidamente que optimice las condiciones de transfección para cada línea celular. Si ha optimizado los parámetros de transfección, utilice las condiciones determinadas empíricamente para sus transfecciones experimentales.

Si elige no optimizar los parámetros de transfección, utilice las condiciones generales recomendadas a continuación.

Materiales necesarios:

  • medio de cultivo celular con suero apropiado para el tipo de célula que se transfecta
  • medio de cultivo celular sin suero para la formación de complejos (como el medio de suero reducido Opti-MEM & reg I)
  • Placas de cultivo de 96 pocillos u otras
  • Placas de dilución con fondo en U o en V o tubos de microcentrífuga

El volumen total de complejo de transfección (medio, ADN y reactivo de transfección ViaFect & trade) a añadir por pocillo de una placa de 96 pocillos es 5 & ndash10 & mul. El siguiente protocolo es una guía para transfectar aproximadamente 10 & ndash20 pozos, dependiendo del volumen de ViaFect & trade Transfection Reagent: mezcla de ADN utilizada. Para pozos adicionales, escale los volúmenes en consecuencia.

  1. A un tubo estéril o una placa con fondo en U o en V, agregue 90 & ndash99 & mul de medio sin suero precalentado a temperatura ambiente para que el volumen final después de agregar el ADN sea 100 & mul. Agregue 1 & taza de ADN plasmídico al medio y mezcle. Para obtener una relación de reactivo de transfección ViaFect & trade: ADN de 3: 1, agregue 3 & mul de reactivo de transfección ViaFect & trade y mezcle inmediatamente.
  2. Incube el reactivo de transfección ViaFect & trade: mezcla de ADN durante 5 y 20 minutos a temperatura ambiente.
    Opcional: Agregue la mezcla a las células sin un período de incubación.
    Nota: Las incubaciones más largas pueden afectar negativamente a las transfecciones.
  3. Agregue 5 & ndash10 & mul del reactivo de transfección ViaFect & trade: mezcla de ADN por pocillo a una placa de 96 pocillos que contiene 100 & mul de células en medio de crecimiento. Sugerimos 10 & mul de mezcla como punto de partida. Mezcle suavemente pipeteando o usando un agitador de placas durante 10 y 30 segundos. Devuelva las células a la incubadora durante 24 y 48 horas.
    Nota: El volumen total del medio de cultivo puede variar según el formato del pozo y las prácticas habituales de su laboratorio y rsquos.
  4. Mida la eficacia de la transfección utilizando un ensayo apropiado para el gen indicador. Para la transfección transitoria, las células se analizan típicamente 24 y 48 horas después de la transfección.

Optimización de la transfección con reactivos lipídicos

En secciones anteriores, discutimos los factores que influyen en el éxito de la transfección. Aquí presentamos un método para optimizar la transfección de una línea celular particular con un solo reactivo de transfección. Para reactivos basados ​​en lípidos más modernos, como el reactivo de transfección ViaFect & trade, recomendamos analizar inicialmente 50 & ndash100ng de ADN por pocillo de una placa de 96 pocillos con relaciones reactivo: ADN de 3: 1 o 4: 1 para líneas celulares adherentes o 2: 1 para líneas celulares en suspensión. La Figura 4 describe una matriz de optimización típica. Al preparar el reactivo de transfección ViaFect & trade: complejo de ADN, el tiempo de incubación puede requerir una optimización, recomendamos 5 y 20 minutos.

Figura 4. Optimización de la transfección con el reactivo de transfección ViaFect & trade. Las células TF-1 se sembraron en medio de crecimiento sin antibióticos a 30.000 células por pocillo en una placa de ensayo blanca de 96 pocillos y se transfectaron con un CMV-luc2 plásmido usando varios lípidos (ViaFect & trade Transfection Reagent): proporciones de ADN. La concentración de ADN se mantuvo constante a 1 & mug por 100 & mul de medio de suero reducido Opti-MEM & reg I, y se varió la cantidad de reactivo de transfección ViaFect & trade para obtener las proporciones indicadas. A continuación, se añadieron 5 o 10 µl de complejo de transfección a las células de la placa de 96 pocillos. Veinticuatro horas después de la transfección, se realizó el ensayo de luciferasa ONE-Glo & trade + Tox. Tenga en cuenta que 0: 1 es el control negativo con ADN pero sin lípidos. Estos resultados muestran que, para esta línea celular en particular, una relación 2: 1 de reactivo de transfección ViaFect & trade: ADN dio resultados óptimos.

Para los reactivos lipídicos catiónicos tradicionales, recomendamos analizar varias cantidades de ADN transfectado (0,25, 0,5, 0,75 y 1 µg por pocillo en una placa de 24 pocillos) con dos proporciones de carga de reactivo lipídico a ADN (2: 1 y 4: 1, consulte la Figura 5). Esta breve optimización se puede realizar utilizando un intervalo de transfección de 1 hora en condiciones libres de suero. Se requiere una placa de cultivo de 24 pocillos por reactivo para la breve optimización con células adherentes (tres réplicas por cantidad de ADN).

Figura 5. Formato de placa sugerido para la optimización inicial de las condiciones de transfección de lípidos catiónicos.

Se puede realizar una optimización más completa para examinar las proporciones de carga adicionales, los puntos de tiempo y los efectos del medio que contiene suero en las cantidades de ADN que se consideren óptimas durante los estudios de optimización inicial. Una hora o dos horas para el intervalo de transfección es óptimo para muchas líneas celulares. En algunos casos, sin embargo, puede ser necesario probar las proporciones de carga y los intervalos de transfección fuera de estos rangos para lograr una transferencia genética óptima.

Algunos métodos de transfección requieren eliminar el medio con reactivo después de la incubación, otros no. Lea la literatura técnica que acompaña al reactivo de transfección seleccionado para saber qué método es apropiado para su sistema. Sin embargo, si hay una muerte celular excesiva durante la transfección, considere disminuir el tiempo de exposición al reactivo de transfección, disminuir las cantidades de ADN y reactivo agregadas a las células, sembrar células adicionales y retirar el reactivo después del período de incubación y agregar medio completo.

Ensayos de punto final

Muchos ensayos de expresión transitoria utilizan ensayos de indicador lítico como el sistema de ensayo Dual-Luciferase & reg Assay System (n.º de cat. E1910) y el sistema de ensayo Bright-Glo & trade (n.º de cat. E2610) 24 horas después de la transfección. El sistema de ensayo indicador Nano-Glo & reg Dual-Luciferase & reg Reporter (Cat. # N1610) permite la detección en tan solo unas horas después de la transfección. Sin embargo, el marco de tiempo para la mayoría de los ensayos puede variar (24 & ndash72 horas después de la transfección), dependiendo de los niveles de expresión de proteínas. Los ensayos de proteína informadora utilizan métodos colorimétricos, radiactivos o luminiscentes para medir la actividad enzimática presente en un lisado celular. Algunos ensayos (por ejemplo, Luciferase Assay System) requieren que las células se lisen en un tampón después de eliminar el medio y luego se mezclen con un reactivo de ensayo separado para determinar la actividad luciferasa. Otros son ensayos homogéneos (por ejemplo, Bright-Glo & trade Assay System) que incluyen el reactivo de lisis y el reactivo de ensayo en la misma solución y se pueden agregar directamente a las células en el medio. Examine los resultados del ensayo informador y determine dónde se produjo la mayor expresión (lectura más alta). Estas son las condiciones para usar con sus constructos de interés.

Los métodos de detección alternativos incluyen tinción histoquímica de células (determinando el porcentaje de células que se tiñen en presencia del sustrato del gen informador Figura 6), microscopía de fluorescencia (Figura 7) o clasificación celular si se usa un indicador fluorescente como Monster Green & reg Fluorescent Protein phMGFP Vector (Cat. # E6421).

Figura 6. Tinción histoquímica de células RAW 264.7 para y actividad beta-galactosidasa. Se transfectaron células RAW 264.7 usando 0,1 μg de ADN por pocillo y una relación de FuGENE + reg HD a ADN de 3: 1. Los complejos se formaron durante 5 minutos antes de aplicar 5 µl de la mezcla del complejo a 50.000 células / pocillo en una placa de 96 pocillos. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se tiñeron para la actividad de β-galactosidasa usando X-gal. Datos cortesía de Fugent, LLC.

Figura 7. Microscopía de fluorescencia de células transfectadas con reactivo de transfección ViaFect & trade. Se transfectaron células de tejido humano iCell & reg en placas de 96 pocillos con reactivo de transfección ViaFect & trade y un plásmido indicador de GFP en la relación reactivo: ADN especificada y se obtuvieron imágenes de la expresión de GFP después de la transfección. Panel A. Hepatocitos iCell & reg con una relación de reactivo: ADN de 6: 1 obtenida un día después de la transfección. Panel B. Cardiomiocitos iCell & reg con una relación reactivo: ADN de 2: 1 obtenida un día después de la transfección. Panel C. iCell & reg DopaNeurons con una relación reactivo: ADN de 4: 1 obtenida en imágenes tres días después de la transfección. Datos cortesía de Cellular Dynamics International.

Ensayos en tiempo real

Para algunos tipos de experimentos de transfección, especialmente aquellos que examinan los cambios en los niveles de expresión génica asociados con mecanismos patológicos, es deseable monitorizar la actividad informadora en células vivas. Estos ensayos en tiempo real pueden proporcionar información valiosa sobre la expresión de múltiples genes de forma dinámica. Las opciones de detección de células vivas Nano-Glo & reg (Cat. # N2011) están diseñadas para detectar la luminiscencia NanoLuc & reg de células vivas utilizando protocolos no líticos. Estos ensayos controlan la luminiscencia en un solo momento o de forma continua durante hasta 72 horas sin comprometer la viabilidad celular.


La señalización en las células puede ocurrir a través de interacciones proteína-proteína. Chen et al. describen el diseño de puertas lógicas que pueden regular la asociación de proteínas. Las puertas se construyeron a partir de proteínas pequeñas diseñadas que tienen una estructura similar, pero donde un módulo puede diseñarse para interactuar específicamente con otro módulo. El uso de monómeros y monómeros conectados covalentemente como entradas y la especificidad de codificación a través de redes de enlaces de hidrógeno diseñadas permitió la construcción de puertas de dos o tres entradas basadas en la unión competitiva. Los elementos de control modular se utilizaron para regular la asociación de elementos de la maquinaria de transcripción y enzimas de división in vitro y en células de levadura.

El diseño de la lógica de proteínas modular para regular la función de las proteínas a nivel postranscripcional es un desafío para la biología sintética. Aquí, describimos el diseño de puertas AND, OR, NAND, NOR, XNOR y NOT de dos entradas construidas a partir de proteínas diseñadas de novo. Estas puertas regulan la asociación de unidades proteicas arbitrarias que van desde enzimas divididas hasta maquinaria transcripcional in vitro, en levaduras y en células T humanas primarias, donde controlan la expresión de la TIM3 gen relacionado con el agotamiento de las células T. La cooperatividad de interacción de unión diseñada, confirmada por espectrometría de masas nativa, hace que las puertas sean en gran medida insensibles a los desequilibrios estequiométricos en las entradas, y la modularidad del enfoque permite la extensión inmediata a tres entradas OR, AND y compuertas de forma normal disyuntiva. La modularidad y la cooperatividad de los elementos de control, junto con la capacidad de diseñar de novo un número esencialmente ilimitado de componentes proteicos, deberían permitir el diseño de una lógica de control postraduccional sofisticada sobre una amplia gama de funciones biológicas.

Las interacciones proteína-proteína son omnipresentes en la toma de decisiones celulares y controlarlas será cada vez más importante en biología sintética (14). Aunque las interacciones de proteínas son fundamentales para los circuitos biológicos naturales, los esfuerzos para crear nuevos circuitos lógicos se han centrado en el control a nivel del ADN (5, 6), transcripción (718) o ARN (13, 1922). Recientemente, se han generado circuitos basados ​​en proteínas mediante el recableado de vías de señalización nativas (2328), uniendo proteínas con bobinas enrolladas (29), o creando cascadas de proteasas (30, 31) sin embargo, estos circuitos se construyeron a partir de un conjunto limitado de bloques de construcción, lo que dificulta su escalabilidad. La capacidad de diseñar de novo puertas lógicas basadas en proteínas que modulan las interacciones proteína-proteína arbitrarias podría abrir la puerta a nuevos sistemas de control basados ​​en proteínas dentro y fuera de las células.

En principio, debería ser posible diseñar una amplia gama de puertas lógicas de novo utilizando un conjunto de moléculas heterodiméricas. Por ejemplo, dados hipotéticos pares de heterodímeros AUTOMÓVIL CLUB BRITÁNICO', CAMA Y DESAYUNO', y C: C ′, una puerta AND que modula la asociación de A con C' puede construirse fusionando genéticamente A' y B, y B' y C: la asociación ocurre solo en presencia de ambos A′-B, y ANTES DE CRISTO (aquí y debajo ":"Denota interacción no covalente y"-”Una fusión genética a través de enlazadores flexibles). Varias propiedades de los bloques de construcción son deseables para construir tales puertas lógicas asociativas. Primero, debería haber muchos pares heterodiméricos mutuamente ortogonales para que la complejidad de la puerta no esté limitada por el número de elementos individuales. En segundo lugar, los bloques de construcción deben ser modulares y de estructura similar para que las diferencias en la forma de los bloques de construcción y otras propiedades no tengan que tenerse en cuenta al construir las puertas. En tercer lugar, los bloques de construcción únicos deben poder unirse a múltiples socios con afinidades diferentes y ajustables, lo que permite que las entradas realicen operaciones de negación al interrumpir las interacciones preexistentes de menor afinidad. En cuarto lugar, las interacciones deben ser cooperativas para que la activación de la puerta no sea sensible a los desequilibrios estequiométricos en las entradas. En la puerta AND anterior, por ejemplo, si las interacciones no son cooperativas, entonces un gran exceso de A′-B arrastrará el equilibrio hacia complejos parcialmente ensamblados (A′-B con cualquiera A o ANTES DE CRISTO pero no ambos), lo que limitará la activación de la puerta.

Aquí, exploramos la posibilidad de diseñar puertas lógicas que satisfagan los cuatro criterios anteriores utilizando heterodímeros de proteínas diseñados de novo con especificidad mediada por redes de enlaces de hidrógeno (32). Conjuntos de heterodímeros diseñados mutuamente ortogonales (DHD, en lo sucesivo denominados por números, p. Ej., 1 y 1′ forman una tabla de pares afines S1) con especificidad mediada por la red de enlaces de hidrógeno (por ejemplo, ver Fig. 1A, recuadro) están disponibles para la construcción de puertas lógicas, satisfaciendo la condición 1 (ortogonalidad). Todas las interfaces heterodiméricas comparten la misma topología de paquete de cuatro hélices (Fig. 1A), satisfaciendo la condición 2 (modularidad). La interfaz de interacción compartida permite una cantidad limitada de diálogo cruzado entre pares, lo que lleva a una jerarquía de afinidades de unión, satisfaciendo la condición 3 (múltiples especificidades de unión). Inspirado en los sistemas cooperativos de la naturaleza (33, 34), buscamos lograr la condición 4 (cooperatividad) construyendo las fusiones de monómeros (A′-B y ANTES DE CRISTO en el ejemplo anterior) de tal manera que la interacción emerge (con A y C') están enterrados dentro de las fusiones. La energía libre requerida para exponer estas interfaces enterradas se opondría a la activación de la puerta, y razonamos que el sistema podría ajustarse para que la suma de las energías vinculantes de los dos socios, pero no uno solo, sea suficiente para superar esta barrera. asegurando la activación cooperativa de la puerta. Si se cumple la condición 2 (modularidad), entonces un esquema único para garantizar la cooperatividad podría funcionar en principio para una amplia gama de configuraciones de puertas.

(A) Izquierda: Estructura de la columna vertebral de AUTOMÓVIL CLUB BRITÁNICO' bloque de construcción heterodímero, con su red de enlaces de hidrógeno que se muestra en el recuadro. Abajo: representaciones taquigráficas utilizadas en todas las figuras. (B) Ciclo termodinámico que describe el sistema de dimerización inducida. (C) Simulación del sistema de dimerización inducida en equilibrio termodinámico. A y B' Los monómeros se mantuvieron constantes a 10 μM cada uno mientras se titulaban en varias cantidades iniciales de la A′-B proteínas dimerizadoras. Si la unión no es cooperativa (pequeña C), entonces la cantidad final de complejos triméricos disminuye cuando la proteína dimerizadora está en exceso. (D) Experimentos de desnaturalización de equilibrio controlados por CD para diseños con enlazadores de 6 y 12 aminoácidos (AA). Los círculos representan datos experimentales y las líneas se ajustan al modelo de despliegue unimolecular de tres estados. (mi) Perfil SAXS experimental de 1′-2′ con un enlazador de seis residuos (en negro) ajustado al perfil calculado de 1:1′ heterodímero (en rojo). (F) Esquema de los resultados experimentales del sistema de dimerización inducida (con un enlazador de seis residuos) en (G) y (H). (GRAMO) titulación nMS de 2 contra 10 μM de 1′-2′ en presencia (rojo) o ausencia (azul) de 10 μM de 1. (H) Valoración nMS de 1′-2′ contra 10 μM cada uno de 1 y 2. Los dímeros 1 y 2 se refieren a complejos diméricos parciales que consisten en la unión del dimerizador a cualquiera de los monómeros. A modo de comparación, el resultado del modelo termodinámico con C = 991.000 se muestra en cian. (I) Esquema de la prueba del sistema de dimerización inducida en levadura, con resultados in vivo mostrados en (J). Pg, progesterona. (K) Esquema de puerta AND de dos entradas, con los resultados de titulación nMS mostrados en (L). Los trímeros 1 y 2 se refieren a complejos triméricos parciales de las dos proteínas dimerizadoras que se unen a cualquiera de los monómeros. (METRO) Una puerta AND de tres entradas, con los resultados de titulación nMS mostrados en (norte). El tetramero 1 y 2 se refieren a complejos tetraméricos parciales de las tres proteínas dimerizadoras que se unen a cualquiera de los monómeros. Todas las barras de error son desviaciones estándar de norte = 3 réplicas independientes.

Para explorar el diseño de bloques de construcción cooperativos, nos enfocamos en el sistema simple A + A′-B + B' (nos referimos a esto como dimerización inducida a continuación, A y B' como los monómeros, y A′-B como dimerizador). Si la unión no es cooperativa, entonces la cantidad de complejo trimérico disminuye cuando A′-B está en exceso estequiométrico en relación con A y B': la formación de especies diméricas intermedias del dimerizador que se une a cualquiera de los monómeros compite con la formación de complejos triméricos. Por el contrario, si la unión es cooperativa de modo que no se produce unión a ninguno de los monómeros en ausencia del otro, entonces la cantidad de complejo trimérico formado se vuelve insensible a un exceso del dimerizador. Un modelo termodinámico simple del efecto de la cooperatividad de unión sobre la dependencia estequiométrica de tales sistemas de dimerización inducida (Fig. 1B y ver la sección de modelado en los materiales suplementarios) muestra que, a medida que la cooperatividad de unión disminuye, hay una disminución correspondiente en la población de complejos triméricos completos a altas concentraciones de dimerizador (Fig. 1C).

Planteamos la hipótesis de que un estado similar a un paquete de cuatro hélices plegado del A′-B dimerizador podría oponerse a la unión a cualquiera A o B' porque las superficies de interacción relativamente hidrófobas probablemente quedarían secuestradas dentro de la estructura plegada (fig. S1A). Probamos diferentes longitudes de enlazador flexible conectando A' con B usando heterodímeros 1:1′ y 2:2′ como sistema modelo. En todas las longitudes de engarce probadas (entre 0 y 24 residuos), las construcciones se plegaron y fueron estables en experimentos de desnaturalización de clorhidrato de guanidina de dicroísmo circular (CD), con energías libres desplegadas & gt13 kcal / mol (Fig. 1D, Fig. S2 y tabla S3) . A pesar de que 1′-2′ Las construcciones dimerizadoras con enlazadores cortos de 0 y 2 residuos, o con un enlazador muy largo de 24 restos, podían purificarse como monómeros (fig. S1B), eran propensas a la agregación, quizás debido al intercambio de dominios. Por el contrario, los diseños con conectores de 6 y 12 residuos permanecieron en gran parte monoméricos (tabla S4). Experimentos de dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) (35) indicaron que sus radios hidrodinámicos son cercanos a los de los DHD de paquetes de cuatro hélices plegados (Fig. 1E y tabla S2). Los enlazadores en este rango de longitud probablemente permitan que los dos monómeros (1′ y 2′) para plegarse una sobre otra de modo que las superficies de interacción en gran parte hidrofóbicas queden enterradas una contra la otra, tal estructura tendría que desplegarse parcialmente para 1′-2′ para interactuar con cualquiera 1 o 2. La magnitud de la energía que se despliega (ΔGRAMOabierto en la Fig. 1B) determina el grado de cooperatividad para la puerta. Seleccionamos longitudes de conector de 6, 10 o 12 residuos para todos los siguientes experimentos.

Estudiamos la cooperatividad del sistema dimerizador inducido in vitro utilizando espectrometría de masas nativa (nMS, 36, 37), que puede medir directamente las poblaciones de diferentes especies oligoméricas en una muestra (tablas S5 a S8 para la curva de calibración, ver fig. S3). Primero medimos hasta qué punto 1 activa la unión de 2 para 1′-2′ (Figura 1F). 1, 2, y 1′-2′ fueron expresados ​​por separado en Escherichia coli y purificado. A 10 μM de 1′-2′ y 20 μM de 2, observamos un aumento de 33 veces en la unión entre 2 y 1′-2′ tras la adición de 10 μM de 1 (Fig. 1G), un aumento de veces comparable a los sistemas alostéricos naturales (33). Para evaluar la sensibilidad de la unión al desequilibrio estequiométrico, 10 μM 1 y 2 fueron titulados con concentraciones crecientes de 1′-2′ (Fig. 1H) y las especies formadas se determinaron mediante nMS. El heterotrimérico 1:1′-2′:2 complejo se observó en una amplia gama de 1′-2′ concentraciones (Fig. 1H). Incluso en presencia de un exceso de 6 veces 1′-2′, no hubo disminución en la cantidad de 1:1′-2′:2 formado, y ni 1:1′-2′ ni 1′-2′:2 se detectó (Fig. 1H). Definimos un parámetro de cooperatividad C como la relación de las afinidades en presencia y ausencia del otro monómero, que en nuestro modelo se relaciona directamente con la energía libre de apertura del dimerizador (c = e Δ G o p e n / RT ver materiales suplementarios). El estimado C El valor de los ajustes del modelo termodinámico a los datos de nMS (Fig. 1H, línea cian) es 991,000 ± 21 (como referencia, el C El valor del sistema N-Wasp de origen natural es 350, pero las diferencias del sistema complican las comparaciones cuantitativas). Este valor de C corresponde a ΔGRAMOabierto de 8.2 kcal / mol, que es aproximadamente la mitad de la energía libre de despliegue medida de 1′-2′ (tabla S3), lo que sugiere que la unión puede no requerir el despliegue completo del estado de haz de cuatro hélices del dimerizador.

Para investigar la cooperatividad del sistema dimerizador inducido en células vivas, usamos un ensayo similar a dos híbridos en levadura. 11′ se fusionó con el dominio de unión al ADN ZF43 (14), 7 al dominio de transactivación VP16, y el dimerizador 11-7′ fue puesto bajo el control de un elemento sensible a la progesterona. La asociación de los dominios de activación y unión al ADN da como resultado la transcripción de la proteína roja fluorescente (RFP) (Fig. 1I). El tratamiento de las células con una cantidad creciente de progesterona dio como resultado un aumento de hasta 4,5 veces en la señal de RFP, con solo una pequeña caída en las concentraciones de progesterona saturadas (Fig. 1J). Sobre la base de las curvas de calibración, en estas condiciones, 11-7′ se espera que tenga un exceso molar de & gt5 veces sobre 11′ y 7 (fig. S4), lo que sugiere que 11-7′ se une cooperativamente a 11′ y 7 en celdas. Por tanto, la cooperatividad del sistema dimerizador lo hace resistente a las estequiometrías de componentes fluctuantes en las células.

Con dimerizadores que muestran unión cooperativa, razonamos que la falta de dependencia de los excesos estequiométricos de uno de los componentes debería extenderse a puertas más complejas. Usando nMS, investigamos la cooperatividad de una puerta AND de dos entradas construida con los dos dimerizadores 1′-3′ y 3-2′ como insumos y monómeros 1 y 2 reunidos por las dos entradas (Fig. 1K). A medida que aumentaba la concentración de las 2 entradas, la cantidad de complejo heterotetramérico se estabilizaba en una estequiometría de 2: 1, y luego permanecía en gran parte constante con una pequeña caída en la relación molar de 6: 1. Solo se observaron cantidades muy pequeñas de complejos parciales (heterotrímeros y heterodímeros), lo que indica además una alta cooperatividad (Fig. 1L). Construimos una puerta AND de tres entradas desde 1′-4′, 4-3′, y 3-2′, que en conjunto controlan la asociación de 1 y 2 (Figura 1M). Similar a la puerta AND de dos entradas, la abundancia de complejos pentaméricos completos solo disminuyó ligeramente a concentraciones de entradas mayores que las estequiométricas sin complejos tetraméricos competidores detectables (Fig. 1N).

Exploramos la combinación modular de DHD (tabla S1) para generar un rango de puertas lógicas de heterodímero proteico inducible cooperativamente (CIPHR) de dos entradas. Los monómeros de los DHD individuales se vincularon a proteínas efectoras de interés mediante fusión genética, de modo que las entradas (subunidades heterodímeras unidas) controlan la colocalización o disociación de las proteínas efectoras. Aprovechando las matrices de especificidad de todos por todos medidas previamente para los DHD (32), exploramos la construcción de puertas a partir de dos modalidades de interacción: unión análoga entre pares de proteínas diseñados y unión competitiva que implica interacciones multiespecíficas (Fig. 2A).

(A) Las puertas CIPHR se construyen a partir de DHD (arriba) con monómeros o monómeros conectados covalentemente como entradas (izquierda) algunas puertas usan solo las interacciones afines diseñadas (lado izquierdo del panel central), mientras que otras aprovechan las jerarquías de afinidad de unión observadas (lado derecho de panel central). (B y C) Puertas lógicas CIPHR de dos entradas AND (B) y OR (C) basadas en interacciones DHD ortogonales. (D para GRAMO) Puertas lógicas CIPHR NOT (D), NOR (E), XNOR (F) y NAND (G) hechas de unión a proteínas multiespecífica y competitiva. Para cada puerta, los puntos negros representan la medición del crecimiento de Y2H individual corregida sobre el crecimiento de fondo, con sus valores promedio mostrados en barras verdes. Los componentes en recuadros grises indican los pares DHD utilizados. Los recuadros azules indican gradientes de afinidad. * No hay crecimiento de levadura sobre el fondo. “0” y “1” en los bloques central y derecho representan diferentes estados de entrada y salidas esperadas, respectivamente.

Comenzamos construyendo puertas AND y OR, leyendo la función de la puerta usando una configuración de levadura-dos-híbrido (Y2H) similar a los sistemas de levadura-cuatro-híbridos previamente descritos (38, 39). Para construir una puerta AND, fusionamos 2 al dominio de activación Gal4 (AD) y 1 al dominio de unión al ADN de Gal4 (DBD). En este esquema, la colocalización de AD y DBD, y la activación transcripcional resultante de la His3 gen, debería requerir la expresión de ambas proteínas de entrada (1′-5, 5′-2′). De hecho, el crecimiento en medio que carece de histidina requirió la expresión de ambas entradas (Fig. 2B). Una puerta OR se construyó de manera similar uniendo el 1-6 fusión a la AD y 7′ al DBD. Expresión de cualquiera de las entradas, 1′-7 o 6′-7, dio como resultado un crecimiento impulsando la asociación de AD con DBD (Fig. 2C).

Exploramos la construcción de puertas lógicas booleanas adicionales mediante la explotación de las jerarquías de afinidad de unión identificadas en todos los experimentos Y2H (32). 8 solo formó un homodímero, pero en presencia de 8′ se disocia para formar el 8:8′ heterodímero (fig. S5A). Construimos una puerta NO fusionando 8 tanto para AD como para DBD 8:8 el homodímero apoyó el crecimiento de la levadura pero en presencia de coexpresión 8′ proteína de entrada, la interacción se rompió y el crecimiento se ralentizó (Fig. 2D). Sobre la base de la jerarquía de afinidad 9:9′10:10′ & gt 9:10′ (fig. S5B), construimos una puerta NOR en la que 9 se fusionó con el AD y 10′ al DBD, con 9′ y 10 como las dos entradas. Una o ambas entradas superaron a la 9:10′ interacción y crecimiento obstaculizado de la levadura (Fig. 2E). Sobre la base de la jerarquía de afinidad 9′:1′ & gt 9:9′1:1′ & gt 9:1 (fig. S5B), se construyó una puerta XNOR fusionando 9 sapo, 1 a DBD, y usando 9′ y 1′ como las dos entradas: la presencia de cualquiera de ellos superó al 9:1 unión y crecimiento bloqueado, pero cuando ambos se expresaron, en su lugar, interactuaron entre sí y se observó crecimiento (Fig. 2F). De manera similar, se diseñó una puerta NAND basada en la jerarquía de interacción 1′:10′ & gt 1:1′10:10′ (figura S5B). Ninguno 1 ni 10 solo podría superar al 1′:10′ la interacción y por lo tanto el crecimiento ocurrió, pero cuando ambos se expresaron, la energía libre de formación de ambos 1:1′ y 10:10′ superado el de 1′:10′ y se bloqueó el crecimiento (Fig. 2G).

A continuación, investigamos las puertas lógicas CIPHR de tres entradas. Primero usamos nMS para caracterizar una puerta AND de tres entradas (Fig.1M) en la que los monómeros 1 y 2 son acercados por las tres entradas 1′-4′, 4-3′, y 3-2′. Probamos experimentalmente las ocho posibles combinaciones de entrada (Fig. 3A) con ambas 1 y 2 presente, cuantificando todos los complejos utilizando nMS. De acuerdo con la función de puerta AND de tres entradas, 1 y 2 solo mostró un ensamblaje significativo cuando las tres entradas estaban presentes (Fig. 3B).

(A) Esquema de una puerta AND de tres entradas. (B) Los resultados de nMS indican la activación adecuada de la puerta AND de tres entradas solo en presencia de las tres entradas. (C) Esquema de una puerta OR de tres entradas. (D) Resultados Y2H que confirman la activación de la puerta OR de tres entradas con cualquiera de las entradas. (mi) Esquema de una puerta DNF. (F) Resultados de Y2H que confirman la activación adecuada de la puerta. Para cada puerta, los puntos negros representan medidas individuales con sus valores promedio mostrados en barras verdes. Para las mediciones basadas en Y2H [(D) y (F)], las mediciones de crecimiento se corrigen sobre el crecimiento de fondo. Los componentes en recuadros grises indican los pares DHD utilizados.

Para probar la función de la puerta CIPHR de tres entradas en las células, diseñamos dos puertas adicionales utilizando los mismos cuatro pares de DHD y las probamos con Y2H. Para hacer una puerta OR de tres entradas, 1′-6-7 se fusionó con AD y 11′ a DBD. Cualquiera de las tres entradas (11-1, 11-6′, o 11-7′) conecta el AD al DBD a través de 1′, 6, o 7, respectivamente (Fig. 3C).Los resultados de Y2H confirmaron el comportamiento esperado de esta puerta lógica en las células: cualquiera de las proteínas de entrada indujo el crecimiento celular (Fig. 3D). Además, construimos una forma normal disyuntiva CIPHR [DNF (A Y B) O C] puerta fusionando 1′-6 a AD y 11′ a DBD con entradas 11-7′, 7-1, o 11-6′ (Figura 3E). En los experimentos de Y2H, la puerta DNF funcionó como se diseñó, con bajos niveles de crecimiento de levadura cuando no hubo entrada o solo una de las 11-7′ y 7-1 las proteínas de entrada estaban presentes y altos niveles de crecimiento de levadura en caso contrario (Fig. 3F).

Para probar la transferibilidad de las puertas lógicas CIPHR, exploramos la capacidad de las puertas lógicas CIPHR para reconstituir la actividad enzimática dividida controlando la asociación de las dos mitades del sistema de luciferasa dividida NanoBiT (4042). Monómeros de 1:1′, 2:2′, 4:4′, y 9:9′ (Fig. 4A) se fusionaron en pares con los dos dominios divididos (smBiT e lgBiT) y se produjeron mediante transcripción y traducción in vitro, lo que facilitó un ciclo de prueba rápido que permitió determinar la jerarquía de afinidad de interacción 4 × 4 completa mediante el seguimiento de la actividad de luciferasa después de mezclar (fig. S6A). Sobre la base de esta jerarquía, construimos y verificamos experimentalmente un circuito de dimerización inducida con 4-smBiT, 1-lgBiT y 1′-4′ como entrada (Fig. 4B y Fig. S6, C y D), la caracterización de la dependencia del tiempo de la respuesta reveló un aumento de 7 veces en la señal 5 min después de agregar entradas (Fig. S6D). También construimos una puerta AND con 4-smBiT, 1-lgBiT y 1′-2 y 2′-4′ como las entradas (Fig. 4C) y una puerta NOR con 1′-smBiT, 2′-lgBiT y 1 y 2 como las entradas (Fig. 4D), las cuales tenían la dependencia diseñada de la función de puerta (es decir, la actividad luciferasa) de las entradas. Investigamos la respuesta de la puerta NOR a concentraciones variables de las entradas contra los componentes NanoBiT mantenidos a 5 nM y encontramos una fuerte caída en la señal alrededor de 5 nM para ambas entradas, consistente con la lógica NOR (Fig. 4E y Fig. S6E).

(A) Se combinaron modularmente cuatro pares de DHD para construir puertas lógicas CIPHR que se pueden usar para controlar diferentes funciones: actividad catalítica de la luciferasa dividida (B para mi) y expresión génica en células T humanas primarias (F y GRAMO). (B) el sistema de dimerización inducida, (C) la puerta AND y (D) la puerta NOR acoplada al sistema de luciferasa dividida NanoBiT, probado mediante traducción in vitro y monitorización de la luminiscencia. (E) Titulación in vitro de las dos entradas de la puerta NOR en D mientras se mantiene 1′-smBiT y 2′-lgBiT fijo a 5 nM. NOT gate (F) y OR gate (G) usando un sistema de represión dividido TALE-KRAB para controlar la expresión de proteínas TIM3 en células T humanas primarias, probado por citometría de flujo.

Las terapias con células T diseñadas son modalidades terapéuticas prometedoras (4345) pero su eficacia para tratar tumores sólidos está limitada al menos en parte por el agotamiento de las células T (46, 47). Genes de puntos de control inmunológico que incluyen TIM3 se cree que desempeñan un papel fundamental en la modulación del agotamiento de las células T (4850). Para poner la transcripción de tales proteínas bajo el control de las puertas lógicas CIPHR, aprovechamos los represores transcripcionales potentes y selectivos de genes de puntos de control inmunitarios en células T primarias que combinan dominios de unión al ADN del efector similar al activador de la transcripción específico de secuencia (TALE). con el dominio represor de la caja asociada a Krüppel (KRAB) (51). La actividad de represión se conserva en sistemas divididos que emparejan un dominio de reconocimiento de ADN fusionado a un monómero DHD con un dominio represor fusionado al monómero DHD complementario (51). Razonamos que este sistema podría explotarse para diseñar dispositivos terapéuticos programables haciendo que la unión de las funcionalidades de reconocimiento de ADN y represión transcripcional dependa de las puertas CIPHR. El uso de un dominio represivo invierte efectivamente la lógica de las puertas CIPHR cuando el nivel de expresión del gen diana se mide como salida.

Para probar la viabilidad de este concepto, utilizamos una fusión TALE-KRAB diseñada para reprimir el gen del punto de control inmunológico. TIM3 (51). Diseñamos una puerta NOT con 1 fusionado con el dominio de reconocimiento de ADN de TALE, 9′ fusionado a KRAB, y el 1′-9 proteína dimerizadora como entrada (véase la figura S7A para la matriz de especificidad de DHD de células T). En este esquema, 1′-9 lleva KRAB a la región promotora unida por el TALE, lo que desencadena la represión de TIM3 (Figura 4F). Aprovechando la interacción entre 9 y 1′, construimos una puerta de quirófano con 9-TALE y 1′-Fusiones de KRAB TIM3 fue reprimido en ausencia de insumos, pero al agregar cualquiera de 9′ o 1, el más débil 9:1′ la interacción fue superada en favor de los más fuertes 9:9′ y 1:1′ interacciones, restaurando TIM3 expresión (Fig. 4G). Estos resultados sugieren que la combinación de los sistemas CIPHR y TALE-KRAB podría aplicarse directamente para agregar capacidades de procesamiento de señales a la terapia de células T adoptivas.

El diseño sistemático de puertas lógicas descrito en este documento aprovecha las ventajas del diseño de proteínas de novo. Debido a que los heterodímeros de bloques de construcción están diseñados de novo, se pueden generar muchos más componentes para la construcción de puertas con una topología general casi idéntica de los que están disponibles mediante la reutilización de motivos biológicos. La codificación de la especificidad utilizando redes de enlaces de hidrógeno diseñadas permite una amplia gama de afinidades de unión entre monómeros con estructuras similares, lo que a su vez permite la construcción de puertas más complejas que se basan en la unión competitiva. Desde la perspectiva de la biofísica de proteínas, nuestros resultados destacan la fuerte sinergia entre el diseño de novo de complejos de proteínas y nMS y, de manera más general, la capacidad del diseño de proteínas de novo para generar conjuntos cooperativos complejos. Por ejemplo, la detección y cuantificación de 33 veces la activación de la unión en la Fig. 1G dependía críticamente de la capacidad para resolver todas las especies formadas en solución por nMS. El análisis de las puertas lógicas de tres entradas en la Fig. 3B requirió distinguir los ensamblajes heteropentaméricos diseñados, que están compuestos por cinco cadenas de proteínas distintas, del gran número de posibles complejos alternativos heterotetraméricos, triméricos y diméricos. La capacidad de generar ensamblajes altamente cooperativos y bien definidos compuestos por cinco cadenas polipeptídicas distintas demuestra que el diseño de proteínas de novo está comenzando a acercarse a la complejidad de los ensamblajes de proteínas de origen natural, que son responsables de gran parte de la función biológica.

A diferencia de las puertas lógicas basadas en ácidos nucleicos, las puertas CIPHR se pueden acoplar directamente a dominios de actuación de proteínas arbitrarios, lo que ofrece una mayor diversidad en los tipos de salidas funcionales. Aquí ilustramos el acoplamiento a la activación y represión transcripcional y la reconstitución enzimática dividida en principio, cualquier función que pueda ser modulada por la asociación proteína-proteína se puede poner bajo el control de las puertas CIPHR. Debido a que los componentes diseñados son proteínas hiperestables y no se requiere maquinaria celular adicional, las puertas deben funcionar en una amplia gama de condiciones dentro y fuera de las células (aquí, hemos demostrado la función con componentes purificados en extractos libres de células, células de levadura y Células T). El pequeño tamaño de los DHD y, por lo tanto, su carga útil genética los hace atractivos para la ingeniería de células de mamíferos. La sofisticación de los circuitos podría incrementarse aún más mediante la activación proteolítica, como en estudios recientes y elegantes que utilizan circuitos de proteínas basados ​​en proteasas (30, 31) nuestros circuitos puramente basados ​​en interacciones de proteínas tienen ventajas en bioortogonalidad, escalabilidad demostrada a tres entradas, componibilidad (la salida, como la entrada y la maquinaria de computación, consiste en interacciones entre bloques de construcción con características de diseño comunes) y extensibilidad debido a una capacidad esencialmente ilimitada. Se puede crear un repertorio de bloques de construcción heterodiméricos utilizando un diseño de novo.


Enzimas

En la definición más básica, las enzimas son proteínas especializadas que inician cambios en el cuerpo. En los billones de reacciones bioquímicas que ocurren en nuestras células cada minuto, las enzimas juegan el papel clave de catalizar esas reacciones. Esto no quiere decir que esas reacciones no ocurrirían normalmente, pero las enzimas aceleran la velocidad de esos procesos. Las enzimas son proteínas reutilizables que se adaptan a un tipo específico de reacción dentro de una serie o ciclo de reacciones. Un sustrato se convierte en un producto a través de su interacción con una enzima. Ese producto a menudo se convertirá en el sustrato para la siguiente reacción en un ciclo o vía metabólica, que requerirá un tipo diferente de enzima.

La delicada interacción de las enzimas y las elaboradas vías metabólicas es lo que sustenta los procesos críticos que necesitamos para sobrevivir, desde la generación de energía utilizable hasta la replicación del ADN. Hay aproximadamente 3,000 enzimas diferentes que se encuentran dentro del cuerpo, ¡cada una de las cuales tiene un propósito único y valioso para nuestras células, tejidos y órganos!


La investigación podría permitir avances biotecnológicos: medicina, equipos de protección, sensores

Crédito: Laboratorio de Investigación del Ejército

Una nueva investigación en biología sintética financiada por el Ejército manipuló microcompartimentos en las células, lo que potencialmente permitió avances en la biotecnología para la medicina, los equipos de protección y las aplicaciones de ingeniería.

Las bacterias malas pueden sobrevivir en entornos extremadamente hostiles, incluido el interior del estómago humano altamente ácido, gracias a su capacidad para secuestrar toxinas en compartimentos diminutos.

En un nuevo estudio, publicado en Ciencia Central ACS, Los investigadores de la Universidad Northwestern controlaron el ensamblaje de proteínas y construyeron estos microcompartimentos en diferentes formas y tamaños, incluidos tubos largos y poliedros. Debido a que este trabajo ilumina cómo se desarrollan las unidades biológicas, como los virus y los orgánulos, también podría informar nuevas formas de diseñar medicamentos, células sintéticas y nano-reactores que son esenciales para la nanotecnología.

"Estos resultados son un emocionante paso adelante en nuestra capacidad para diseñar compartimentos complejos basados ​​en proteínas", dijo la Dra. Stephanie McElhinny, directora de programa del Comando de Desarrollo de Capacidades de Combate del Ejército de EE. UU., Conocido como DEVCOM, Laboratorio de Investigación del Ejército. "Ser capaz de controlar el tamaño y la forma de estos compartimentos podría permitir esquemas de biofabricación sofisticados que se personalizan para respaldar la producción eficiente de moléculas complejas y materiales multifuncionales que podrían proporcionar al futuro Ejército uniformes mejorados, equipos de protección y sensores ambientales. "

Más adelante, estos conocimientos podrían conducir a nuevos antibióticos que se dirijan a los microcompartimentos de patógenos y eviten las bacterias buenas.

Los investigadores controlan el ensamblaje de proteínas y construyen microcompartimentos celulares en diferentes formas y tamaños que podrían conducir a bloques de construcción bioinspirados para diversas aplicaciones de ingeniería.

"Al diseñar cuidadosamente proteínas para que tuvieran mutaciones específicas, pudimos controlar el ensamblaje de las proteínas que forman microcompartimentos bacterianos", dijo la Dra. Mónica Olvera de la Cruz, profesora de ciencia de materiales e ingeniería y química en Northwestern, quien dirigió la teoría cálculo. "Usamos esto también para predecir otras posibles formaciones que aún no se han observado en la naturaleza".

Los investigadores controlan el ensamblaje de proteínas y construyen microcompartimentos celulares en diferentes formas y tamaños que podrían conducir a bloques de construcción bioinspirados para diversas aplicaciones de ingeniería Crédito: Monica Olvera de la Cruz, Northwestern University

Muchas células utilizan la compartimentación para garantizar que varios procesos bioquímicos puedan ocurrir simultáneamente sin interferir entre sí. Hechos de proteínas, estos microcompartimentos son la clave para la supervivencia de una amplia variedad de especies bacterianas.

"Basándonos en observaciones anteriores, hemos sabido que la geometría de los microcompartimentos se puede alterar", dijo la Dra. Danielle Tullman-Ercek, profesora asociada de ingeniería química y biológica en Northwestern, quien dirigió el trabajo experimental. "Pero nuestro trabajo proporciona las primeras pistas sobre cómo modificarlos para lograr formas y tamaños específicos".

Para estudiar estos compartimentos cruciales, el equipo de Northwestern recurrió a Salmonella enterica, que se basa en microcompartimentos para descomponer los productos de desecho de las bacterias buenas en el intestino. Cuando los investigadores manipularon genéticamente una proteína aislada de Salmonella, notaron que los microcompartimentos formaban tubos largos.

"Vimos estas estructuras extrañas y extendidas", dijo Tullman-Ercek. "Parecía que usaban los diferentes bloques de construcción para formar diferentes formas con diferentes propiedades".

Al acoplar las propiedades mecánicas del compartimento con los productos químicos dentro del compartimento, Olvera de la Cruz y su equipo utilizaron cálculos teóricos para predecir cómo diferentes mutaciones conducían a diferentes formas y tamaños. Cuando las proteínas de seis lados se ensamblaron, formaron tubos largos. Cuando las proteínas de cinco lados se ensamblaron, formaron icosaedros con forma de balón de fútbol. El equipo también predijo que las proteínas podrían ensamblarse en una forma triangular de samosa, parecida al bocadillo frito del sur de Asia.

Comprender este proceso podría conducir a la creación de bloques de construcción bioinspirados para diversas aplicaciones de ingeniería que requieren componentes de diferentes formas y tamaños.

"Es como construir con Legos", dijo Tullman-Ercek. "No es deseable usar el mismo bloque de forma una y otra vez, necesitamos formas diferentes. Aprender de las bacterias puede ayudarnos a construir nuevas y mejores estructuras a esta escala microscópica".


El Instituto de Investigación de la Creación

El artículo de marzo de 1998 sobre el impacto "Clonación: ¿qué es y adónde nos lleva?"discutió el procedimiento de clonación por transferencia de células somáticas. En ese procedimiento, el núcleo de una célula derivada de un embrión, un feto o tejido de un adulto se inserta en un óvulo del que se ha extraído el núcleo. Después de que se desarrolla el óvulo En la etapa apropiada, el embrión se inserta en el útero de una hembra debidamente preparada y se deja que se desarrolle hasta el término. Esto produce una descendencia esencialmente genéticamente idéntica al animal que proporcionó el núcleo que se insertó en el óvulo. Este artículo discutirá el transferencia de genes de una especie a otra para dotar a la especie receptora de propiedades beneficiosas, o para permitir que el receptor produzca proteínas humanas para inyectarlas en pacientes humanos que carecen de una proteína de vital importancia.

Producción de proteínas terapéuticas por transferencia de genes

Hay muchas proteínas esenciales para la buena salud que algunas personas no pueden producir debido a defectos genéticos. Estas proteínas incluyen varios factores de coagulación de la sangre que causan hemofilia, insulina (que produce diabetes), hormona del crecimiento (que provoca la falta de un crecimiento adecuado) y otras proteínas, cuya administración corrige afecciones patológicas o produce otros beneficios terapéuticos. Los primeros trabajos en este campo emplearon bacterias. Algunas bacterias en un cultivo bacteriano pueden contener pequeñas moléculas circulares de ADN llamadas plásmidos. Estos plásmidos no forman parte del ADN cromosómico que poseen todas las bacterias del cultivo. A medida que estas células bacterianas excepcionales se reproducen por fisión binaria o división celular, los plásmidos se transmiten a las células hijas. También se pueden transmitir a otras células por conjugación. Los científicos han aprendido a utilizar plásmidos para transferir genes humanos a células bacterianas. Si el gen insertado en el plásmido de una bacteria es el gen humano de la insulina, por ejemplo, la bacteria en la que se inserta este gen produce insulina humana.

Inserción de una sección de ADN en un plásmido

Los científicos han identificado y aislado enzimas (llamadas enzimas de restricción o endonucleasas de restricción), cada una de las cuales corta genes en lugares muy específicos. Se han aislado más de 100 de estas enzimas. Una vez que se ha localizado en el cromosoma la posición del gen humano que codifica la proteína terapéutica deseada, se corta el gen utilizando las enzimas de restricción apropiadas y se aísla el gen. Las mismas enzimas de restricción se utilizan para cortar un trozo del plásmido circular de ADN. Por lo tanto, los dos extremos del gen humano serán los que se unirán con los extremos abiertos del plásmido. Se usa una enzima llamada ADN ligasa para acoplar cada extremo del gen a los extremos abiertos del plásmido, restaurando una molécula de ADN circular con el gen humano reemplazando la pieza cortada del plásmido. Estos plásmidos, que ahora incluyen el gen humano, se reinsertan en bacterias. Estas bacterias se cultivan y producen grandes cantidades de bacterias idénticas que portan el gen humano que se reproduce junto con el ADN bacteriano. Además, estas bacterias producen la proteína humana codificada por el gen humano empalmado. La proteína se aísla del cultivo bacteriano, se purifica y se inyecta en aquellos pacientes que padecen afecciones patológicas porque sus cuerpos no pueden producir cantidades suficientes de la proteína.

Antes de la ingeniería genética, estas proteínas tenían que aislarse minuciosamente de los tejidos o la sangre, pero como se producen en cantidades tan diminutas, el aislamiento de cantidades significativas requería el procesamiento de grandes cantidades de material. Como resultado, eran muy caros. Se obtuvieron cantidades relativamente mucho mayores a partir de cultivos bacterianos alterados genéticamente, pero el costo, aunque menor, seguía siendo elevado. Los biorreactores (es decir, la maquinaria necesaria para cultivar grandes cantidades de bacterias que contienen el gen humano) son enormemente costosos y deben ser operados por varios científicos y asistentes técnicos. Además, el correcto funcionamiento del biorreactor es sensible a pequeños cambios de temperatura y composición del caldo de cultivo.

Afortunadamente, se ha desarrollado un método alternativo que promete ser mucho menos costoso y mucho más eficiente. Este método utiliza un animal, como un cerdo, como biorreactor. Los científicos tardaron años en diseñar, desarrollar y construir el biorreactor muy caro y difícil de operar ideado por el hombre. Dios ya había ideado un biorreactor mucho más eficiente y mucho más barato. Los científicos finalmente se dieron cuenta de que sería posible mediante manipulación genética inducir a una cerda, vaca u otro animal a producir las proteínas humanas deseadas en su leche.

Ingeniería genética de una proteína de la leche.

Este procedimiento ahora ha tenido éxito tanto en cerdos como en vacas. Entre los animales, el cerdo tiene una serie de ventajas. Su período de gestación es de solo cuatro meses. A los 12 meses de edad, el cerdo es fértil y produce camadas de gran tamaño (generalmente de 10 a 12 lechones). Un cerdo lactante produce 300 litros (aproximadamente 315 cuartos de galón) de leche en un año. El procedimiento se lleva a cabo de la siguiente manera:

  1. Se aísla el fragmento de ADN (gen) que codifica la proteína humana necesaria.
  2. El fragmento de ADN que promueve la producción de proteínas en las glándulas mamarias se aísla y se une o se combina con el gen humano.
  3. Se obtienen óvulos fertilizados de un cerdo donante.
  4. El ADN humano se inyecta en un óvulo en la región del pronúcleo masculino (ADN del esperma antes de que se una al ADN del óvulo) usando una micro pipeta muy delgada. El ADN humano se incorpora así al ADN nuclear del cerdo.
  5. El óvulo se implanta en el útero de otro cerdo y se convierte en una lechona recién nacida.
  6. La proteína deseada se aísla de la leche de la lechona una vez que ha crecido.

Este procedimiento fue llevado a cabo con éxito por científicos estadounidenses y los resultados fueron publicados en 1994. 1 El gen humano que utilizaron codifica la Proteína C que actúa para controlar la coagulación sanguínea.Obtuvieron un gramo de Proteína C de cada litro de leche producido por el cerdo. Esta es 200 veces la concentración que se encuentra en el plasma sanguíneo humano. Solo alrededor de un tercio de la proteína C obtenida era biológicamente activa. La razón de esto es que se deben realizar muchas modificaciones de una proteína en una célula después de que se haya formado la cadena proteica. Por ejemplo, se cortan secciones del complejo de proteínas, se pueden unir grupos de azúcar en ciertos lugares de la cadena de proteínas y se pueden agregar grupos de anclaje a la pared celular. Los científicos descubrieron que una enzima de procesamiento clave, llamada furina, estaba presente en cantidades insuficientes, por lo que agregaron a su complejo genético el gen que codifica la furina. Esto aumentó el rendimiento de la proteína C activa. Las proteínas humanas producidas de esta manera deben probarse para determinar su seguridad y eficacia. En el momento de escribir este artículo, se está probando en ensayos clínicos una proteína anticoagulante llamada antitrombina.

La comparación de este procedimiento con el uso de máquinas de biorreactores ilustra el hecho de que una generación de ingenieros bioquímicos no logró igualar las habilidades de una herramienta para fabricar proteínas (el cerdo) que Dios había preparado. La glándula mamaria está optimizada para mantener una alta densidad de células para entregarles un amplio suministro de nutrientes y canalizar las proteínas que se producen en una forma que se puede aislar y purificar fácilmente. Este procedimiento ha demostrado ser exitoso y promete proporcionar un método para producir proteínas terapéuticas valiosas a un costo mucho menor.