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19.3: Evolución adaptativa - Biología

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19.3: Evolución adaptativa

La especiación y la evolución adaptativa remodelan la diversidad del sistema enzimático antioxidante en todo el filo Nematoda

Los nematodos han evolucionado para sobrevivir en diversos nichos ecológicos y pueden ser una carga grave para la economía agrícola, la medicina veterinaria y la salud pública. Las enzimas antioxidantes de los nematodos parásitos desempeñan un papel fundamental en la defensa contra el estrés oxidativo del huésped. Sin embargo, las características de la evolución de las enzimas antioxidantes en el filo Nematoda siguen siendo esquivas.

Resultados

Aquí, investigamos sistemáticamente la evolución y expresión génica de enzimas antioxidantes en los genomas de 59 nematodos y transcriptomas de 20 nematodos. La catalasa se ha perdido de forma independiente en varios órdenes, lo que sugiere que es innecesaria para algunos nematodos. A diferencia de los mamíferos, el hidroperóxido de fosfolípidos glutatión peroxidasa se distribuye ampliamente en los nematodos, entre los cuales ha evolucionado de forma independiente. Descubrimos que la superóxido dismutasa (SOD) ha estado presente durante todo el proceso evolutivo de los nematodos, y la isoforma extracelular (SOD3) se separa de la enzima correspondiente en los mamíferos y se ha duplicado y diferenciado en varios nematodos. Además, la evolución de las isoformas de la SOD intracelular y extracelular en filaria indica claramente que la SOD3 extracelular se originó a partir de la SOD1 intracelular y experimentó una rápida evolución para formar la diversidad de la SOD3 extracelular. Identificamos una nueva SOD extracelular supuestamente independiente del metal que se presenta de forma independiente en Steinernema y linaje Strongyloididae que presentaba un alto nivel de expresión en Strongyloides larvas. Divergencia de secuencia de SOD3 entre nematodos parásitos y su nematodo de vida libre más cercano, la expresión específicamente alta en la etapa femenina parasitaria y la presencia en el proteoma excretor-secretor de Strongyloides sugieren que la SOD3 puede estar relacionada con el parasitismo.

Conclusiones

Este estudio avanza nuestra comprensión de la compleja evolución de las enzimas antioxidantes en Nematoda y proporciona objetivos para controlar las enfermedades parasitarias de los nematodos.


Introducción

En diciembre de 2019, un brote de casos de neumonía en la ciudad de Wuhan, China, se relacionó con un nuevo coronavirus. El análisis evolutivo identificó este nuevo virus en humanos como un virus relacionado con el síndrome respiratorio agudo severo [1], en el Sarbecovirus subgénero del Betacoronavirus género, linaje hermano del virus del SARS original posteriormente denominado Coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) para reflejar esta relación con el SARS-CoV [2]. Este nuevo linaje representa el séptimo miembro conocido infectante de seres humanos de la Coronaviridae. El brote inicial de casos humanos del virus se relacionó con el mercado mayorista de mariscos de Huanan en Wuhan [3], y aunque se han encontrado virus relacionados en murciélagos de herradura [4] y pangolines [5], su divergencia representa décadas de evolución [6 ] dejando el origen directo de la pandemia desconocido. Además de dilucidar la ruta de transmisión de los animales a los humanos, las preguntas clave para evaluar el riesgo futuro de emergencia son: (i) cuál es el grado de evolución, si es que se requiere, para que un virus de murciélago se transmita a los humanos, y (ii) qué ¿ocurrirá la evolución posterior una vez que el virus se establezca dentro de la población humana?

El primer brote del virus del SRAS en 2002/2003, que provocó aproximadamente 8.000 infecciones, y su resurgimiento a finales de 2003, provocando 4 infecciones, se relacionaron con civetas de palma del Himalaya y perros mapaches en los mercados de la provincia de Guangdong [7,8]. Más tarde, quedó claro que si bien estos animales pueden haber sido conductos de propagación a los humanos, no eran verdaderos reservorios virales [9]. Posteriormente, un extenso trabajo de vigilancia identificó virus relacionados que circulan en murciélagos en herradura en China, algunos de los cuales pueden replicarse en células humanas [10, 11]. Los virus de murciélago más estrechamente relacionados con el SARS-CoV (en lo sucesivo, SARS-CoV-1 para mayor claridad) pueden unirse a la enzima convertidora de angiotensina humana (hACE2, el receptor del SARS-CoV-2 que también se utiliza para la entrada celular), mientras que se requiere la adición de una proteasa del huésped para escindir la proteína Spike antes de que pueda unirse a hACE2 para los virus de murciélago más divergentes probados (Fig. S1) [12]. Dos de los cambios clave que parecen haber sido necesarios para generar este patógeno altamente capaz, la secuencia del dominio de unión al receptor específico y el sitio de escisión de la furina insertado, se pueden rastrear hasta los coronavirus de murciélago [6,13-15]. En conjunto, estos resultados demuestran que, a diferencia de la mayoría de los otros virus de ARN que adquieren adaptaciones después de cambiar a una nueva especie hospedadora [16,17] para una replicación eficiente y una propagación tan exitosa como lo muestra el SARS-CoV-2, el Sarbecovirus—Que ya se transmite con frecuencia entre las especies de murciélagos [18] —puede explotar las propiedades generalistas de su capacidad de unión a ACE2, lo que facilita la infección exitosa de especies distintas de murciélagos, incluidos los humanos. Una diferencia principal entre el SARS-CoV-1 y el SARS-CoV-2 es la mayor afinidad de unión por hACE2 en este último [19], lo que permite un uso más eficiente de las células humanas y el tracto respiratorio superior, y en promedio una gravedad más baja pero, paradójicamente: debido al mayor número de infecciones, mayor carga de morbilidad.

Existe un gran interés en las mutaciones que emergen en la pandemia del SARS-CoV-2 [20-22]. Aunque se espera que la gran mayoría de los cambios genómicos observados sean “neutrales” [23, 24], es probable que surjan mutaciones con importancia funcional para el virus, como ha ocurrido en muchas otras epidemias y pandemias virales [25]. En el SARS-CoV-2, los reemplazos de aminoácidos en la proteína Spike pueden reducir la eficacia de las vacunas, los reemplazos en proteasas y polimerasas darán como resultado una resistencia adquirida a los medicamentos y otras mutaciones podrían cambiar la biología del virus, por ejemplo, mejorando su transmisibilidad como demostrado para el reemplazo D614G [26], contribuyendo a la adaptación a los seres humanos, una nueva especie huésped.

Una forma principal de comenzar a comprender el impacto funcional de las mutaciones es caracterizar el régimen selectivo al que se encuentran. Las mutaciones que se encuentran bajo selección positiva son de particular interés ya que es más probable que reflejen un cambio funcional. Sin embargo, la identificación de mutaciones bajo selección positiva a partir de datos de frecuencia solamente puede ser engañosa, ya que las frecuencias alélicas en pandemias virales son impulsadas significativamente por muestreo sesgado, efectos fundadores y eventos de superpropagación [22]. Las poblaciones en crecimiento exponencial pueden aumentar su aptitud promedio [27], sin embargo, también se espera que exhiban una deriva genética elevada, con mutaciones deletéreas "surfeando" ondas de expansión [28].

Aquí, investigamos la historia evolutiva del murciélago. Sarbecovirus que dio forma al surgimiento y la rápida propagación del SARS-CoV-2 al contrastar los resultados de las búsquedas exhaustivas de firmas de selección positiva (una medida de adaptación molecular) en el virus que circula en humanos desde que comenzó el brote de la enfermedad del coronavirus 2019 (COVID-19), a firmas de selección histórica que actúan sobre virus de murciélagos relacionados. Utilizamos una serie de métodos de detección de selección (resumidos en la figura S2) en un conjunto de (i) 133,741 genomas de SARS-CoV-2 muestreados desde diciembre de 2019 hasta octubre de 2020 y en (ii) 69 Sarbecovirus genomas (incluido un representante de las secuencias de SARS-CoV-1 y SARS-CoV-2) separados en regiones filogenéticamente congruentes según los patrones de recombinación detectados [6]. Finalmente, detectamos un cambio en la representación de CpG en el Sarbecovirus árbol, asociado con el clado filogenético SARS-CoV-2 se encuentra en.


Introducción

Las proyecciones actuales del cambio climático sugieren que la temperatura global promedio en 2100 será más alta que la media de 1986-2005 en 0.3 ° C – 4.8 ° C [1], junto con un aumento en las fluctuaciones de temperatura en ciertas áreas [2]. Por lo tanto, ahora es más importante que nunca comprender cómo los cambios de temperatura afectan los sistemas biológicos, desde los individuos hasta los ecosistemas completos. A nivel de organismos individuales, la temperatura afecta los rasgos funcionales en forma de curva de rendimiento térmico (TPC). Normalmente, este TPC, especialmente cuando el rasgo es una tasa (por ejemplo, tasa de respiración, fotosíntesis, crecimiento), toma la forma de una curva unimodal sesgada negativamente (Fig. 1) [3, 4]. La curva aumenta (aproximadamente) exponencialmente hasta un máximo (Tpaquete) y luego también disminuye exponencialmente, siendo la caída más pronunciada que la subida. Comprender cómo se adaptan varios aspectos de la forma de este TPC a un entorno térmico cambiante es crucial para predecir la rapidez con la que los organismos pueden responder al cambio climático.

(A) Tpaquete (K) es la temperatura a la que la curva alcanza su punto máximo, alcanzando una altura máxima que es igual a Bpaquete (en unidades de desempeño de rasgos). mi y miD (eV) controlan qué tan abruptamente sube y baja el TPC, respectivamente. B0 (en unidades de desempeño del rasgo) es el desempeño del rasgo normalizado a una temperatura de referencia (Tárbitro) debajo del pico. Además, Wop (K), el ancho del nicho operativo del TPC, también se puede calcular a posteriori como la diferencia entre Tpaquete y la temperatura en el aumento del TPC donde B(T) = 0.5 ⋅ Bpaquete. Notamos que usamos Wop en lugar de una métrica que captura todo el ancho de TPC porque estudios previos han demostrado que las especies generalmente experimentan temperaturas por debajo de Tpaquete [6, 7]. Por lo tanto, Wop es una medida de la sensibilidad térmica del rasgo cerca de las temperaturas típicamente experimentadas. (B) TPC de rasgos a nivel individual y poblacional (como rmax) suelen estar bien descritos por el modelo de Sharpe-Schoolfield. Los datos sin procesar del panel B están disponibles en https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12816140.v1. TPC, curva de rendimiento térmico.

De acuerdo con la Teoría Metabólica de la Ecología (MTE), así como con un gran cuerpo de investigación fisiológica, se espera que la forma del TPC refleje los efectos de la temperatura en la cinética de una única enzima limitante de la velocidad involucrada en reacciones metabólicas clave [5 , 8-11]. Bajo este supuesto, el aumento en los valores de los rasgos hasta Tpaquete se puede describir mecánicamente usando la ecuación de Boltzmann-Arrhenius: (1)

Aquí, B es el valor de un rasgo biológico, B0 es una constante de normalización, que incluye el efecto del tamaño de la célula o del cuerpo, que da el valor del rasgo a una temperatura de referencia (Tárbitro), T es la temperatura (en K), k es la constante de Boltzmann (8.617⋅10 −5 eV ⋅ K −1) y mi (eV) es la sensibilidad térmica del rasgo en el componente ascendente del TPC hasta Tpaquete. Porque Tpaquete tiende a ser más alta que la temperatura ambiental media [6, 7, 12], mi representa la sensibilidad térmica dentro del rango térmico típicamente experimentado por el organismo.

Los primeros estudios de MTE argumentaron que, debido a fuertes restricciones termodinámicas, la adaptación resultará predominantemente en cambios en B0, mientras que mi permanecerá casi constante en todos los rasgos (por ejemplo, frecuencia respiratoria, rmax), especies y entornos en un rango de 0,6-0,7 eV [8-10]. Este último supuesto se conoce en la literatura como dependencia de la temperatura universal (UTD). Este rango restringido de valores que mi puede tomar se centra en la energía de activación media putativa de la respiración (≈ 0,65 eV). Una excepción notable a la UTD es la tasa de fotosíntesis, que se espera que tenga una menor mi valor de ≈ 0,32 eV, que refleja la energía de activación de los pasos de la fotosíntesis que limitan la velocidad [13].

La existencia de un UTD ha sido fuertemente debatida. Desde un punto de vista teórico, los críticos de la UTD han argumentado que el modelo de Boltzmann-Arrhenius es demasiado simple para describir mecánicamente los complejos mecanismos fisiológicos de diversos organismos [3, 14-16] y es inadecuado para describir los TPC que surgen de la interacción de múltiples factores. y no solo los efectos de la temperatura sobre la cinética enzimática. Eso es el mi calculado ajustando el modelo de Boltzmann-Arrhenius a los rasgos biológicos es una propiedad emergente que no refleja directamente la energía de activación de una sola enzima limitante de la velocidad. Por ejemplo, una sensibilidad térmica fija para la tasa de fotosíntesis neta no es realista porque depende de la tasa de fotosíntesis bruta y de la fotorrespiración, que a su vez está determinada no solo por la temperatura sino también por la disponibilidad de CO.2 en relación a O2 [17].

De hecho, ahora existe una abrumadora evidencia empírica de variación en mi (sensibilidad térmica) excediendo con creces el estrecho rango de 0,6-0,7 eV, con tal variación, hasta cierto punto, estructurada taxonómicamente [12, 18-23]. Además, la distribución de mi Los valores entre especies no suelen ser gaussianos, sino sesgados a la derecha. Si asumimos que mi es casi constante en todas las especies y, por lo tanto, esa variación en mi se debe principalmente a un error de medición; tal asimetría podría ser el resultado de la proximidad del mi distribución a su límite inferior (0 eV). En ese caso, sin embargo, esperaríamos una alta densidad de mi valores cercanos a 0 eV, pero tal patrón no se ha observado [18]. Ambas desviaciones de la expectativa de MTE de un rango muy restringido para mi y se ha argumentado que la forma de su distribución se debe en parte a la adaptación a los factores ambientales locales mediante múltiples estudios. Estos incluyen la selección de presas para que tengan una sensibilidad térmica más baja que los depredadores (el "principio de cena de vida térmica") [18], la adaptación a las fluctuaciones de temperatura dentro y / o entre generaciones [3, 21, 24-26] y aumentos adaptativos en Asignación de carbono o eficiencia de uso debido al calentamiento [27-30].

Entonces, en general, se espera que los cambios adaptativos en los TPC de rasgos subyacentes (relacionados con la aptitud) influyan en los TPC de rasgos de orden superior como rmax, lo que resulta en desviaciones de un UTD. Por lo tanto, comprender cómo la sensibilidad térmica de rmax y su distribución evoluciona es particularmente importante, ya que también puede proporcionar información útil sobre la evolución de los TPC de los rasgos fisiológicos subyacentes (por ejemplo, tasa de respiración, tasa de fotosíntesis y eficiencia de asignación de carbono). De hecho, se han documentado cambios sistemáticos en la sensibilidad térmica de los rasgos fisiológicos fundamentales [27, 31-33], aunque no a través de análisis comparativos de grandes conjuntos de datos.

En particular, la heredabilidad filogenética, la medida en que las especies estrechamente relacionadas tienen valores de rasgos más similares que las especies elegidas al azar, puede proporcionar información clave sobre la evolución de la sensibilidad térmica. Una heredabilidad filogenética de 1 indica que la evolución del rasgo a través del árbol filogenético es indistinguible de una caminata aleatoria (movimiento browniano) en el espacio de parámetros. Tenga en cuenta que esto no indica necesariamente que el rasgo evolucione de manera neutral, ya que puede estar bajo selección hacia un óptimo no estacionario que por sí mismo realiza una caminata aleatoria [34]. Por el contrario, una heredabilidad filogenética de 0 indica que los valores de los rasgos son independientes de la filogenia. Este es el caso ya sea porque (i) el rasgo es prácticamente invariante entre especies y cualquier variación se debe a un error de medición, o (ii) la evolución del rasgo es muy rápida y con convergencia frecuente (es decir, evolución independiente de valores de rasgos similares por diferentes linajes). Vale la pena aclarar que la evolución rápida de los rasgos que no da como resultado la convergencia (por ejemplo, cuando los clados principales están extremadamente separados en el espacio de parámetros) no conducirá a una ausencia completa de heredabilidad filogenética. Las heredabilidades filogenéticas entre 0 y 1 reflejan desviaciones del movimiento browniano (por ejemplo, debido a patrones ocasionales de convergencia evolutiva). Entre el fitoplancton, las medidas de sensibilidad térmica de rmax (mi y Wop) han demostrado previamente que exhiben una heredabilidad filogenética intermedia [35]. Esto indica que, entre el fitoplancton, la sensibilidad térmica no es constante, sino que evoluciona a lo largo de la filogenia, aunque no como un paseo puramente aleatorio en el espacio de rasgos, lo que refleja una evolución termodinámicamente limitada o una evolución rápida en respuesta a la selección.

Para comprender (i) cómo se acumula la variación en la sensibilidad térmica a través de múltiples grupos autótrofos y heterótrofos y (ii) si su distribución está determinada por la selección ambiental, aquí llevamos a cabo una investigación exhaustiva de los patrones evolutivos de la sensibilidad térmica, enfocándonos particularmente en rmax. Utilizando un enfoque comparativo filogenético, probamos las siguientes hipótesis:

1. La sensibilidad térmica no evoluciona entre especies y cualquier variación es similar a un ruido.

En este escenario, las restricciones termodinámicas obligarían mi distribuirse alrededor de una media de 0,65 eV (o 0,32 eV en el caso de la fotosíntesis), y las desviaciones de la media se deben principalmente a errores de medición. Dependiendo de la magnitud del error, el mi La distribución sería aproximadamente gaussiana (pequeño error de medición) o no gaussiana con una alta densidad cercana a 0 eV (error de medición sustancial). Esta hipótesis concuerda con el concepto UTD de los primeros estudios de MTE. Si esta hipótesis se mantiene, la sensibilidad térmica tendría 0 heredabilidad filogenética y no variaría sistemáticamente entre diferentes entornos.

2. La sensibilidad térmica evoluciona gradualmente entre las especies, pero tiende a volver a un valor central clave, sin alejarse mucho de él.

Esta hipótesis también es consistente con la suposición de UTD, ya que es una variante relajada de la hipótesis 1. Aquí, son posibles pequeñas desviaciones de la tendencia central de 0.65 eV (o 0.32 eV), ya que reflejarían la adaptación de las enzimas de las especies a ciertos estilos de vida ecológicos o nichos. Por lo tanto, la sensibilidad térmica sería débilmente hereditaria filogenéticamente. Las restricciones termodinámicas evitarían grandes desviaciones de la tendencia central.

3. La sensibilidad térmica evoluciona de otras formas

Esta es una hipótesis "paraguas" que abarca múltiples subhipótesis que no invocan la suposición de UTD. Por ejemplo, es posible que todavía exista una tendencia central clave (restricción termodinámica), pero su influencia sería muy débil, lo que permitiría una amplia exploración del espacio de parámetros fuera de ella. En este caso, los cambios en la sensibilidad térmica podrían ser el resultado de la adaptación a diferentes entornos térmicos. Otra subhipótesis es que los clados difieren sistemáticamente en la velocidad a la que evoluciona la sensibilidad térmica, debido a la aparición ocasional de innovaciones evolutivas. Por lo tanto, los clados con altas tasas de evolución podrían explorar mejor el espacio de parámetros de la sensibilidad térmica (es decir, a través de grandes cambios en mi y Wop valores), en comparación con los clados de tasa baja en los que la sensibilidad térmica evolucionaría más gradualmente. Una tercera subhipótesis es que la evolución puede favorecer a los individuos (y variantes metabólicas) que son relativamente insensibles a las fluctuaciones de temperatura. En ese caso, la tendencia central de mi no sería estacionario sino que se movería hacia valores más bajos con el tiempo evolutivo. Vale la pena aclarar que estas 3 subhipótesis no son necesariamente mutuamente excluyentes.


Métodos

Muestreo de taxón y clasificación del síndrome de polinización

Para este estudio se utilizaron flores conservadas con etanol de 30 especies de Merianieae, que cubren los principales clados y la diversidad morfológica de la tribu 25 (Cuadro suplementario 13). Nuestro material proviene de seis países latinoamericanos diferentes y ha sido recopilado en varios viajes de muestreo entre 2002 y 2015. Debido a las dificultades asociadas con el trabajo de campo (permisos de investigación, presencia de especies en lugares remotos y aislados), no pudimos aumentar el tamaño de las muestras. Quince de las 30 especies solo estaban representadas por un solo espécimen, las otras 15 especies estaban representadas por ocho especímenes en promedio (Tabla complementaria 13). En nuestro estudio solo se utilizaron flores completamente antéticas y relativamente intactas (ver párrafo sobre Estimación de puntos de referencia faltantes). Para 14 especies, los polinizadores están documentados e incluyen abejas (siete especies), paseriformes (tres especies) y conjuntos mixtos de colibríes, murciélagos, roedores y perforadores de flores (cinco especies 25). Para las 16 especies con polinizadores desconocidos, la clasificación de síndrome de Dellinger et al. 25, basado en un extenso conjunto de datos de 61 rasgos florales no incluidos en este estudio. Como en este estudio no se utilizó ninguno de los rasgos utilizados para la delimitación de síndromes, evitamos problemas de circularidad. Además, la clasificación de síndrome de 25 se basó en rigurosos estudios de campo y métodos de clasificación estadística objetiva que arrojaron predicciones de síndrome altamente precisas. Por lo tanto, estamos convencidos de que el riesgo de clasificación errónea de las especies en este estudio es muy bajo. En total, los síndromes de polinización están representados por 16 especies de abejas zumbadoras, ocho especies de vertebrados mixtos y seis especies de síndrome paseriforme en este estudio. Todas las especies tienen anteras tubulares, liberando polen solo por un pequeño poro apical 25. Las marcadas diferencias en los mecanismos de expulsión del polen diferencian los tres síndromes de polinización 25,28. Los apéndices de los estambres son la clave para activar la expulsión de polen en el síndrome de abejas zumbadoras y paseriformes, mientras que han perdido su función en el síndrome de vertebrados mixtos 25.

Filogenia, datación y estimación de síndromes de polinización ancestrales

Para analizar la evolución de la forma floral en Merianieae, inferimos una filogenia bayesiana para Merianieae utilizando BEAST2 (v2.5.0) 52, tal como se implementó a través del portal CIPRES 53. Determinamos el mejor esquema de partición con PartitionFinder 2 54, utilizando cada locus como una partición probable separada, y en el caso de los tres genes codificadores, permitiendo también que cada una de las tres posiciones de codones se considere una partición. Se encontró que un esquema de siete particiones era el mejor ajuste para los datos (cada locus como una partición independiente, y en el caso de ndhF, la posición del primer codón separada de la segunda y tercera posición). Asignamos a cada partición el modelo GTR + Γ + i de evolución de secuencia y desvinculamos las particiones. Establecemos la variación de la tasa entre las ramas como no correlacionada y con una distribución logarítmica normal, y con el árbol establecido antes del proceso de Yule. Basándonos en análisis previos a través de Melastomataceae, calibrados con fósiles a través de Myrtales, fijamos la edad de Merianieae en 29.25 MY (Michelangeli et al., Inédito). Realizamos tres análisis independientes de 60 millones de generaciones cada uno, muestreando cada 20.000 generaciones con un 20% de quemado. La convergencia se evaluó utilizando Tracer v.1.6 55, y las ejecuciones se consideraron satisfactorias con valores de tamaño de muestra efectivo (ESS) superiores a 200. Combinamos las distribuciones posteriores estables de las ejecuciones independientes utilizando LogCombiner v2.5.0 56 y un árbol de máxima credibilidad de clade resumido con TreeAnnotator v2.5.0 57.

Luego podamos este árbol para incluir solo las 30 especies presentes en este estudio (drop.tips PHYTOOLS 58). Reconstruimos los síndromes de polinización utilizando métodos ML (as APE 59 cuadro suplementario 14) y mapeo de caracteres estocásticos para mostrar que la polinización de abejas es ancestral (make.simmap PHYTOOLS Fig. 2a) utilizando el modelo de "tasas iguales" (AIC más bajo que "todas las tasas diferentes"). Posteriormente, se utilizaron reconstrucciones de síndromes de polinización para pintar ramas utilizando modelos OU (ver Evolución de la forma de la flor).

Tomografía computarizada de rayos X de alta resolución (HRX-CT), modelos 3D

Preparamos 137 flores conservadas con etanol de 30 especies (de una a 29 flores por especie, cuatro en promedio Tabla complementaria 13 para el número exacto de especímenes por especie) para la exploración HRX-CT colocándolas en un agente de contraste durante cuatro semanas (1% PTA – EtOH al 70%, tablas complementarias 13, 23). Luego montamos flores totalmente contrastadas en vasos de plástico (Semadeni Plastics Group) y las estabilizamos con espuma acrílica para evitar el movimiento durante el proceso de escaneo. HRX-CT escaneó las muestras utilizando el sistema Xradia MicroXCT-200. Reconstruimos pilas de imágenes tridimensionales a partir de los datos de escaneo sin procesar (XMReconstructor XRadia Inc.) y depositamos tiff-stacks en el repositorio público https://phaidra.univie.ac.at/ desde donde se pueden descargar.

Colocación de hitos

Usamos el software de imágenes AMIRA 5.5.0 para crear modelos 3D de las pilas de imágenes. Calculamos modelos de isosuperficie de cada flor para colocar puntos de referencia. En total, seleccionamos 37 puntos de referencia bajo los criterios de homología y repetibilidad (capacidad para localizar con precisión posiciones de puntos de referencia homólogos en diferentes especímenes) para capturar patrones de variación de forma floral en los tres síndromes de polinización diferentes (Fig.1). Colocamos puntos de referencia de la siguiente manera: cinco en la muesca típica en las puntas de los pétalos, uno en la base del estilo (en la parte superior del ovario sincarpos, no visible en la Fig.1), diez en las puntas de los apéndices del estambre, diez en la base de los apéndices del estambre, diez en los poros de las anteras y uno en el estigma. Todos los puntos de referencia fueron colocados por uno de nosotros (S. A.) para minimizar la variación debido a posibles inconsistencias de los observadores.

Estadística y reproducibilidad

Evaluación de la calidad de los hitos. Realizamos todos los análisis de datos en R 60. Con el fin de asegurar la ubicación precisa de los puntos de referencia y minimizar el error del observador, realizamos una prueba de precisión al comienzo del proceso de marcación de puntos para dos especímenes (un paseriforme y un colibrí / murciélago polinizado) siguiendo la metodología adoptada por la ref. 61. Marcamos diez réplicas de los dos especímenes y 10 especímenes adicionales derivados de diferentes síndromes de polinización y Procrustes ajustó esos tres conjuntos de datos por separado. En configuraciones óptimas de puntos de referencia, el error en las muestras replicadas debe ser cercano a 0 y al menos una magnitud menor que en las muestras no replicadas. Para calcular el error alrededor de cada hito, comparamos la distancia media de cada hito (de las 10 réplicas y las 10 muestras independientes, respectivamente) con el consenso. Utilizando T-y F-pruebas, comparamos las distancias medias de las réplicas con las distancias medias de las no réplicas en cada punto de referencia. Todos los puntos de referencia colocados en ambos conjuntos de replicación fueron significativamente menos variables que en las ubicaciones de no replicación que usaban T- y F-las pruebas y los errores del observador (distancia media de los puntos de referencia al consenso) fueron más de una magnitud más pequeños en las réplicas que en el conjunto de no réplicas (conjunto1-réplica: 0,00139, conjunto2-réplica: 0,00117, no repetido: 0,0689). Por lo tanto, los puntos de referencia seleccionados fueron lo suficientemente precisos como para continuar con la ubicación de los puntos de referencia.

Estimación de hitos faltantes. En 72 de las 137 muestras utilizadas para los análisis, todos los puntos de referencia se pudieron colocar con precisión sin problemas. Los 65 especímenes restantes mostraron daños menores debido a la manipulación y transporte o daños por herbívoros o ladrones de polen (por ejemplo, punta rota de un pétalo, punta rota, estambre rota o punta de estambre masticada por robo de polen Trigona abejas) de modo que no se puedan colocar de uno a diez puntos de referencia como máximo. La mayoría de los análisis morfométricos geométricos requieren la colocación de exactamente el mismo número de puntos de referencia homólogos en todos los especímenes y son intolerantes con los datos faltantes 62. Nuestro conjunto de datos incluye una serie de taxones raros recolectados en sitios con difícil acceso de seis países latinoamericanos diferentes y excluirlos de nuestros análisis habría reducido en gran medida la amplitud (en términos de diversidad taxonómica y morfológica) de nuestro estudio. Dado que nuestro objetivo era capturar la arquitectura floral tridimensional real de las flores, un estudio como el nuestro tampoco pudo utilizar flores de especímenes de herbario. Por lo tanto, decidimos estimar los puntos de referencia faltantes para los 65 especímenes en las preguntas, siguiendo los métodos desarrollados por Arbor y Brown 62. Para estos especímenes, estimamos los puntos de referencia faltantes mediante cuatro técnicas diferentes de estimación de puntos de referencia (PCA bayesiano (BPCA), sustitución media (MS), interpolación spline de placa delgada (TPS) y regresión de mínimos cuadrados (REG)) utilizando el paquete R LOST (ver ref. 61 para una comparación completa de las técnicas de estimación, J. Arbor proporcionó scripts R actualizados para ejecutar TPS en 3D, actualmente no implementado en LOST). Para mejorar la precisión de la estimación, solo estimamos los puntos de referencia faltantes de los especímenes más similares al espécimen para los cuales los puntos de referencia deben estimarse 63. Por lo tanto, dividimos el conjunto de datos de las 72 muestras intactas en seis subconjuntos para la estimación (primera columna, Tabla complementaria 15). Para cada uno de los subconjuntos, realizamos una ejecución de prueba eliminando al azar de uno a diez puntos de referencia en un individuo intacto 50 veces y estimando los puntos de referencia faltantes. Procrustes ajustamos cada conjunto estimado y realizamos un PCA. Usamos la función protest () del paquete R "vegano" para comparar las coordenadas PCA (primeros dos ejes) del subconjunto estimado y el subconjunto intacto para probar si el procedimiento de estimación alteró significativamente los patrones de ocupación morfoespacial relativa. Además, usamos T- y F-Pruebas para probar la alteración significativa de cada posición histórica entre el conjunto estimado y el intacto en las 50 carreras. Todas las técnicas de estimación dieron resultados de PCA que se correlacionaron significativamente con el subconjunto intacto respectivo, pero las cuatro técnicas diferían en la calidad de la estimación de un solo punto de referencia (Tabla complementaria 16) con MS y REG funcionando peor. Elegimos TPS como método para estimar puntos de referencia en los 65 especímenes. Para mantener pequeños los posibles errores debidos a datos faltantes, estimamos cada muestra con datos faltantes por separado con su subconjunto respectivo.

Procusa el cálculo del espacio de forma y ajuste. Realizamos una superposición Procrustes generalizada de puntos de referencia en GEOMORPH 64 para eliminar la variación en la posición, la orientación y el tamaño. Para cada especie con más de un espécimen presente (15 especies), calculamos la forma media. Para las otras 15 especies, que solo estaban representadas por un solo espécimen, usamos directamente las coordenadas ajustadas de Procrustes en análisis posteriores. Visualizamos el espacio de formas mediante análisis de componentes principales (PCA). Además, calculamos phylomorphospaces usando el phylomorphospace función en PHYTOOLS 58. Para visualizar el cambio de forma a lo largo de PC1 y PC2, usamos wireframes basados ​​en códigos de http://rgriff23.github.io/2017/11/10/ plotting-shape-changes-geomorph.html (consultado por última vez el 22 de noviembre de 2018).

Prueba de hipótesis sobre modularidad mediante el coeficiente CR. Usamos la razón de covarianza (CR) como una métrica para probar las cinco hipótesis de modularidad, ya que genera resultados sólidos incluso con tamaños de muestra pequeños y variables 24. La métrica CR determina el grado de modularidad entre módulos predefinidos (de nuestras Hipótesis 1-5) y estima si son significativamente más modulares que cuando los puntos de referencia se reasignan aleatoriamente a módulos (hipótesis nula de asociación de rasgos aleatorios). El coeficiente CR varía entre 0 y valores positivos, los valores más pequeños indican menos covariación entre particiones de datos y, por lo tanto, modularidad. Probamos las cinco hipótesis de modularidad para cada síndrome de polinización por separado, pero en coordenadas de hitos ajustadas de Procrustes conjuntas utilizando la función test.modularity (GEOMORFO). Se utilizaron miles de permutaciones aleatorias para evaluar la significación estadística del coeficiente CR observado.

Evaluar la fuerza de la modularidad dentro y entre síndromes. Las medidas de resumen de la correlación de rasgos son sensibles a varios atributos de los datos y, por lo tanto, no se pueden comparar fácilmente entre diferentes grupos 24,33,65 como, por ejemplo, los tres síndromes de polinización diferentes considerados aquí. Adams y Collyer 33 propusieron el puntaje z como un estadístico de prueba estandarizado para el rPLS (coeficiente de correlación de mínimos cuadrados parciales) donde el rPLS se escala por su distribución de muestreo basada en permutación (el tamaño del efecto del rPLS se calcula como desviaciones estándar para el permutado muestras). Calculating the effect size of the difference between two rPLS effect sizes allows for direct comparison of the strength of morphological integration across datasets 33 . We extended this approach for the CR-coefficient using the formulas provided by Adams and Collyer 33 in order to statistically evaluate the strengths of modularity between the three different pollination syndromes. We performed two-sample tests to assess if levels of modularity differed significantly between pollination syndromes.

Assessing floral modularity across Merianieae. In order to understand if detected floral modules represent relatively independent units also in an evolutionary context, we tested the five different modularity hypotheses across the Merianieae phylogeny. We calculated the CR-coefficient for all species together while accounting for phylogenetic relatedness using the function phylo.modularity (GEOMORPH).

Selecting the best-fit hypothesis of floral modularity. The approaches outlined above allow for detection of modularity and an evaluation of the strength of modularity between the different pollination syndromes. However, they do not permit conclusions on which modularity hypothesis fits the data best. We thus used the maximum-likelihood approach proposed by Goswami and Finarelli 34 to assess the fit of the five competing hypotheses. First, vector congruence coefficient correlation matrices were calculated on the Procrustes fitted landmark coordinates for each pollination syndrome separately, resulting in three 37 × 37 element matrices 66 using the dotcorr function (PALEOMORPH 67 ). We then ran the function EMMLi (EMMLi 34 ) to detect the best fitting model for each pollination syndrome by comparing the finite-sample corrected Akaike Information Criterion (AICc). EMMLi allows for complex models with different correlation coefficients between and within hypothesized modules, so that a total of 15 different models were tested, including a model of no modularity. The same procedure was repeated for all species together to assess the best-fit modularity hypotheses across Merianieae.

Assessing the rate of morphological evolution. In order to understand whether different floral modules evolve at different rates (i.e. whether some traits respond to changes in pollinator selection regimes more quickly than others), we calculated multivariate net evolutionary rates under Brownian motion for each module of Hypothesis 4 and Hypothesis 5 24 . We used the function compare.multi.evol.rates (GEOMORPH).

Flower shape evolution. We calculated phylogenetic signal in flower shape on the landmark data by the Kmult statistic, which is an extension of Blomberg’s Kappa statistic and designed for multivariate data 68 . We then assessed the fit of four different evolutionary models (Brownian motion (BM), Lambda, Early Burst (EB), Ornstein-Uhlenbeck (OU)) to the landmark data using the newly developed penalized likelihood framework for highly multivariate datasets (fit_t_pl in RPANDA 35 ). Based on the clear clustering of the three different pollination syndromes in shape space as assessed by PCA, we used PC1 and PC2 to visualize flower shape change on the phylogeny by constructing a traitgram (PHYTOOLS). We then modelled trait evolution (PC1–2) under an Ornstein-Uhlenbeck (OU) process 69 to screen for different phenotypic optima within Merianieae using the l1ou R-package 36 . We used a LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) procedure 70 to estimate shifts in phenotypic optima from the data without an a-priori definition of where regime shifts may have occurred (estimate_shift_configuration function, estimated shifts-model). Convergence of these shifts was then evaluated using the estimate_convergent_regimes function (L1OU). We evaluated model fit using the phylogenetic Bayesian information criterion (pBIC) and calculated weights (aicw from GEIGER 71 ).

Finally, we reconstructed morphospace evolution through time on PC1 and PC2 using the evomorphospace function (EVOMAP 72 ). We did ancestral character estimation for PC1 and PC2 (ace, method REML, APE) and painted pollination syndromes onto branches according to the estimation of ancestral pollination syndromes (Fig. 2).

Assessing the robustness of the data. Since our dataset is limited in size (ca. 10% of Merianieae, 15 species only represented by one specimen), we worked towards carefully assessing the robustness of our results. First, we randomly rarefied the landmark dataset 100 times to only include one specimen per species. This rarefaction helps understand the impact of intraspecific variability (i.e. calculation of mean shape or representing each species by one specimen only). Second, we randomly down sampled the landmark dataset 100 times to 50% of species per pollination syndrome (hence, eight buzz-bee, four mixed-vertebrate and four passerine) to understand how a reduction in species numbers affects our results. Again, we only included a single specimen per species in each down sampled dataset. Note that we included four (instead of three) species in the passerine syndrome since this was the minimum number required in assessments of the best-fit modularity hypothesis.

We tested all hypotheses on modularity on these two additional datasets following the methods described above. We calculated CR- and pag-values, z-scores and significant differences in strength of modularity between syndromes for each of the 100 runs. We summarized results by calculating average CR-, pag- and z-scores (Supplementary Tables 3, 4) and by reporting the proportion of times a hypothesis of modularity was significant (Supplementary Tables 5, 6). Also, we assessed the best-fit modularity hypothesis for the subsampled datasets and summarized these results by counting how often a specific hypothesis resulted as best fit (Supplementary Table 8). We also used the rarefied datasets to compare rates of morphological evolution among modules (Supplementary Table 9 reporting averages) and tested which hypothesis of evolution fits the landmark data best (Supplementary Table 10). We further used rarefied datasets to estimate regime shifts under an OU-process of floral shape evolution. We summarized these results by calculating the proportion of times a species was included in a regime shift (Supplementary Table 11). Overall, both the rarefaction and the down sampling results are congruent with results obtained from the original data and support the view that the buzz-bee syndrome is most modular and that functional modularity better explains floral shape evolution in Merianieae than developmental modularity.

Reporting summary

Further information on research design is available in the Nature Research Reporting Summary linked to this article.


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